CC BY
130
УДК 635.65:575
ОСОБЕННОСТИ ВЕГЕТАТИВНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ГОРОХА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Т.П. Жужжалова М.Н. Сащенко
ГНУ Всероссийский НИИ сахарной свеклы и сахара им. АЛ. Мазлумова Россельхозакадемии, 396030 Воронежская область, Рамонский район, п. ВНИИСС, 8(47340) 5-33-27
e-mail: [email protected],
В статье представлен усовершенствованный метод мик-роклонального размножения гороха, включающий этапы стерилизации эксплантов, их введение в условия in vitro, собственно размножение и укоренение регенерантов.
Ключевые слова: микроклональное размножение, горох, стерилизация, культура тканей, укоренение.
Введение
К настоящему времени установлено, что необходимость получения высокопродуктивных, устойчивых к биотическим и абиотическим факторам сортов и гибридов гороха требует использования современных методов биотехнологии, ускоряющих селекционный процесс и повышающих его эффективность. В процессе селекции отбор и сохранение ценных исходных и полученных форм затрудняется [4]. Нередко гибель зародышей возникает на ранних стадиях развития. Поэтому трудности получения необходимых признаков затягивают всю селекционную работу.
С целью повышения результативности селекционных работ для размножения ценных селекционных номеров в настоящее время разрабатываются методы на основе культуры изолированных тканей. Биотехнологические методы дают возможность получать и сохранять генетически однородный материал и проводить направленные отборы.
Анализ литературных данных показал, что ранее разработанные методики микроразмножения гороха очень громоздки и трудоемки, что усложняет работу по созданию и сохранению генетического разнообразия ценной зернобобовой культуры -гороха [2, 5].
Для разработки метода микроклонального размножения гороха было проведено изучение влияния состава питательных сред и различных эксплантов на культивирование в условиях in vitro.
В соответствии с целью исследований были поставлены задачи:
• подобрать стерилизующий агент, оказывающий наиболее эффективное обеззараживающее действие на вводимый эксплант и определить его оптимальную концентрацию;
• определить оптимальные составы питательных сред для роста, развития и дальнейшего укоренения эксплантов гороха.
Методы исследований
В качестве эксплантов для введения в культуру тканей использовали зрелые семена и фрагменты растений различных сортов гороха Рамонской селекции. Стерилизацию эксплантов проводили растворами веществ: доместос, мертиолят, ломакс-хлор. Вещества использовались в разных концентрациях с экспозицией 30 минут. Культивирование растений осуществлялось на питательной среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу, витаминами по Уайту с добавлением сахарозы, приготовленной по общепринятым методикам [1], в оптимальных условиях t = +23-25оС, 16-ти часовой фотопериод.
Результаты исследований
Проведенными исследованиями выявлено, что успех введения в культуру тканей определяется эффективностью стерилизации. Как показал сравнительный анализ действия различных стерилизующих агентов, использование хлорсодержащих веществ обеспечивало достаточную стерильность материала.
Среди изученных агентов хлорамин 10 % обладал наименьшим стерилизующим эффектом, инфицированность эксплантов составляла 90,9 %, из которых 39,4 % грибная и 51,5 % бактериальная инфекция (табл. 1).
Таблица 1
Влияние различных стерилизующих агентов на обеззараживание семенного материала в условиях in vitro
Стерили- зующий агент Концерт рация, Количество введенных семян, шт. Наличие инфекции Неинфицирован-ные растения Развитие ре-генерантов в баллах
грибной бактериальной
% % %
Хлорамин Б 10 99 39,4 51,5 9,1 2
Ломаксхлор 0.05 384 12,5 10,4 77,3 5
Мертиолят 0,01 132 2,3 2,3 95,5 3
Domestos 10 141 2,1 2,1 95,7 3
Анолит 10 207 8,7 10,1 81,2 4
Количество стерильных проростков не превышало 9,1 %. После обработки семян гороха хлорамином Б растения формировались недоразвитыми и уродливыми. Их длина составляла 1-3 см. Листочки на проростках были скручены и имели светлозеленый цвет. Корешок растения имел длину 1-2 см. Оценка состояния проростка по 5 балльной шкале составляла 2 балла. Растения обладали низкой жизнеспособностью, через 10 дней культивирования проростки засыхали и не могли использоваться для дальнейшей работы.
Применение раствора ломаксхлора обеспечивало больший стерилизующий эффект материала - 77,3 %. Количество инфицированных растений в условиях in vitro составляло 12,5 % и 10,4 % грибной и бактериальной микрофлорой соответственно. Аномалий в развитии проростков после обработки семян раствором ломакс-хлора не наблюдалось. При этом растения имели хорошо развитую корневую систему с многочисленными боковыми корешками. Длина главного корня составляла 7-8 см. Утолщенный стебель имел длину 5-6 см. Проросток имел насыщенную зеленую окраску. Оценка состояния проростков - 5 баллов. Высокий балл обусловлен наличием хорошо развитой корневой системы и утолщенным, длинным стеблем с многочисленными листочками.
Высокий стерилизующий эффект наблюдался так же после обработки семян гороха растворами мертиолята и domestos - 95,5 % и 95,7 % соответственно. При применении мертиолята общая зараженность растений составляла 4,6 %, domestos -4,2%. Инфицированность материала грибной и бактериальной микрофлорой была на одинаковом уровне, то есть количество зараженных проростков после применения мертиолята и domestos составляло 2,3 % и 2,1 %, соответственно. Вместе с тем, применение растворов оказывало ингибирующее действие на жизнеспособность проростков. Так, после 5-7 дней культивирования растения выглядели слабыми. Длина корешка была около 1 см. Стебелек проростка имел желтоватую окраску и небольшие размеры (около 1,5 см). Несмотря на высокое стерилизующее действие данных растворов, оценка состояния проростков - 3 балла.
При стерилизации семян раствором анолита число обработанных эксплантов составляло 207 штук. Эффект стерильности равнялся 81,2 %. Корневая система растений была нормально развита и имела длину 3-4 см. Стебли проростков характеризовались сильной вытянутостью. Их длина составляла 5-6 см. Оценка состояния проростков - 4 балла.
Таким образом, оптимальным стерилизующим агентом для обеспечения стерильности и сохранения высокой жизнеспособности вводимого материала в наших исследованиях был раствор ломаксхлора в концентрации 0,05 %.
Важным фактором, имеющим значение для успешного микроразмножения, является гормональный состав питательной среды и вид экспланта. Решающую роль в этом играют концентрации и сочетание фитогормонов.
Наблюдения показали, что асептические проростки гороха через 7-10 дней после посадки на ростовые питательные среды начинали активно расти. На среде без гормонов растения были слаборазвитые, при этом формировался один развитый побег высотой 2,0 - 4,0 см, коэффициент размножения не превышал 1 (табл. 2).
Таблица 2
Влияние гормонального состава питательной среды на рост и развитие растений гороха
№ среды Состав среды (мг/л) Развитие в баллах Высота растения, см Количество побегов на 1 растение (эксплант), шт Коэффициент размножения
l БAП, Гк, Кн по o,l з з - б 1 - 2 2
а БAП, Гк, Кн по 0,2 з 4 - б 1 - 2 2
з БAП 0,з +НУК 0,1 4 2 - 7 1 - 2 з
4 БAП 0,4 + Гк 0,1 4 2 - б 2 - з 4
5 БAП 0,5 +ИМК0,1 5 з - б з - б 5
б БAП 0,5 +ИУК 0,1 5 2 - б з - б 5
Безгормо- нальная (контроль) - з 2 - 4 l l
На средах № 1 - 4, дополненных БАП, гиббереллином, кинетином и НУК в различных сочетаниях и концентрациях наблюдался активный рост растений, их высота варьировала от 2 до 7 см. Количество побегов на 1 растение достигало трех, экспланты были сильно вытянутыми, поэтому коэффициент размножения был равен 1 - 3.
Отличительной особенностью было то, что на 4 среде с БАП и Гк растения характеризовались более высокой степенью развития, побеги были утолщенные, кустистые. Именно на этой среде коэффициент размножения равнялся 4.
На средах № 5, 6 содержащих БАП, ИМК/ИУК наблюдался интенсивный рост растений не только в высоту, но и хорошее развитие боковых побегов. При этом средняя высота растений составляла 2-6 см. Количество побегов на 1 растение составляло 3-6 штук, коэффициент размножения равнялся 5. Следовательно, с одного введенного на питательную среду проростка можно получить до пяти хорошо развитых растений.
На контроле (среда без гормонов) коэффициент размножения равнялся 1. При этом средняя высота растений составляла 2 - 4 см.
На основе полученных данных можно сделать вывод, что добавление в питательную среду БАП 0,5 мг/л и ИМК (ИУК) 0,1 мг/л обеспечивает наиболее высокий выход хорошо развитых растений с одного введенного экспланта, что дает возможность использовать для ускоренного микроразмножения гороха в культуре in vitro среды № 5, 6. Использование в дальнейшем 3-4 пассажей позволит значительно увеличить данный показатель и получить необходимое для селекционеров количество растений в короткие сроки. Полученные результаты послужат основой для разработки ускоренного вегетативного размножения ценных форм гороха.
Полученный и размноженный в культуре in vitro селекционный материал необходимо укоренить для дальнейшего его использования в селекционном процессе. Укоренение образовавшихся в культуре in vitro растений связано с индуцированием адвентивных корней, которое достигается изменением гормонального состава питательной среды. Из литературных данных известно, что ведущую роль в регуляции ризогенеза играют соединения ауксиновой природы [3, 6]. Механизм действия ауксинов аналогичен и в культуре in vitro, хотя условия выращивания изолированных эксплантов специфичны.
В связи с тем, что количество эндогенных ауксинов и ингибиторов в эксплан-тах не известно, приходится опытным путем подбирать тип экзогенного фитогормона и его концентрацию.
Проведенные исследования на горохе показали, что стимулирующее влияние на корнеобразование оказывала нафтилуксуская кислота в концентрации 0,5 мг/л. Количество укоренившихся эксплантов составляло 30%. Среднее число корней было равно 1-2 штук, размер составлял 1-2 см. Высота растений колебалась от 2 до 4 см. Было отмечено, что увеличение концентрации НУК до 1,0 мг/л в питательной среде активизирует рост надземной части растений после образования корней, однако выход укоренившихся проростков равнялся 15 %. Максимальное образование корней (42%) вызывала НУК в количестве 1,5 мг/л, среднее число корней было равно 2-3 штук, размер составлял 2-3 см. Высота растений колебалась от 3 до 5 см (табл. 3).
Таблица 3
Влияние физиологически активных веществ на формирование корней у клонов гороха
Ростовое вещество Концентрация, мг/л Количество введенных эксплантов, шт. Количество укорененных эксплантов, % Среднее количество и длина корня, шт; см Высота растения, см
0,5 30 1-2; 1-2
НУК 1,0 15 2-4
1,5 42 2-3; 2-3 3-5
2,0 2 1-2; 1-2 1-2
ИУК 0,5 0 0 0
1,0 60 0
0,2 + 0,2 0 0 0
НУК+ИУК 0.5 + 0.5 0
1,0 + 1,0 0 0 0
ИМК 1,0 0
Безгормональная (контроль) 0 0 0 0
Однако еще большее увеличение содержания гормона в среде (НУК 2,0 мг/л) оказывало негативное влияние на рост и развитие эксплантов, образования корней снизилось до 2 %. Добавление в питательную среду других гормонов и их сочетаний желаемых результатов не оказало. На контроле укорененных регенерантов не наблюдалось.
Выводы
Следовательно, для укоренения микроклонов гороха в культуре in vitro оптимальным фитогормоном является нафтилуксусная кислота в концентрации 1,5 мг/л.
Таким образом, на основании полученных данных был модифицирован метод микроклонального размножения гороха, включающий этапы стерилизации эксплантов, их введение в условия in vitro, собственно размножение и укоренение регенерантов.
Список литературы
1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных органов, тканей и клеток растений / Р.Г. Бутенко. - М.: Наука, 1970. - 342 с.
2. Внучкова В.В. Методические рекомендации по микроклонированию растений гороха в культуре ткани in vitro. - М., 1988. - 15 с.
3. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны. - М.: Наука, 1974. - 253 с.
4. Макашева Р.Х. Горох. - Л.: Колос, 1973. - 312 с.
5. Суркова Г.Н. Технологии клонирования зернобобовых и крупяных культур (методические рекомендации) / Г.Н. Суркова, С.В. Бобков, Г.В. Соболева. - М., 2005. - 20 с.
6. Турецкая Р.Х. Эндогенные факторы корнеобразования растений // Биология развития растений. - М.: Наука, 1975. - С. 126-145.
FEATURES MICROPROPAGATION PEAS IN CULTURE IN VITRO
The paper presents an improved method for micropropagation of peas, comprising the steps of the sterilization of explants, and their introduction into the conditions in vitro, the actual propagation and rooting of regenerants.
Key words: micropropagation, peas, sterilization, tissue culture, rooting.
T.P. Zhuzhzhalova M.N. Sashchenko
All-Russia Research Institute of sugar beet and sugar to them. AL Mazlumov RAAS, 396 030 Voro-nezh region, Ramonsky district, VNIISS,
8 (47 340) 5-33-27
e-mail: [email protected],
