CC BY
27
© Кравченко Л.В., Афонин АА., 2010
Л.В. Кравченко, A.A. Афонин
ОСОБЕННОСТИ ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА У ДЕТЕЙ ПЕРВЫХ МЕСЯЦЕВ ЖИЗНИ С ГЕНЕРАЛИЗОВАННОЙ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
ФГУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», г. Ростов-на-Дону, РФ
Проведено клинико-лабораторное обследование 147 новорожденных и детей первых месяцев жизни с цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ). У 67 детей (1-я группа) имела место ЦМВИ, типичная генерализованная форма (тяжелая), у 80 (2-я группа) — ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая); контрольную группу (3-я группа) составили 24 условно-здоровых ребенка обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных цитомегаловирусом. Изучена взаимосвязь провоспалительных цитокинов (интерферона а, интерферона у, интерлейкина 2, фактора некроза опухолей а) и противовоспалительных цитокинов (интерлейкина 4) в периферической крови на первом месяце жизни у детей с различными формами ЦМВИ. Выявлено статистически значимое влияние на прогноз заболевания содержания цитокинов ИФНа и ИФНу в сыворотке крови.
Ключевые слова: дети первых месяцев жизни, цитомегаловирусная инфекция, провоспалительные цитокины.
Clinical and laboratory examination was performed in 147 infants aged 0—2 months with cytomega-loviral infection (CMVI). 67 infants (1st group) had severe typical generalized CMVI, 80 infants (2nd group) had moderate typical generalized CMVI with incomplete presentations, 24 conditionally healthy infants without CMV carriage (3rd group) were examined as control group. Authors studied correlations of pro-inflammatory cytokiners (interferon a, interferon y, interleukine 2, tumor necrosis factor a) and anti-inflammatory cytokines (interleukine 4) in peripheral blood in first month of life in children with different variants of CMVI. Examination showed statistically significant influence of serum IFNa and IFNy upon prognosis of disease.
Key words:: infants in first two months of life, cytomegaloviral infection, pro-inflammatory cytokines.
Актуальность изучения цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) обусловлена широкой циркуляцией цитомегаловируса (ЦМВ) в популяции и высокой частотой передачи его от матери к ребенку [1]. В работах последних лет показано, что инфицирование ЦМВ плода приводит к нарушению иммунологической реактивности, реализующейся в неонатальном периоде разнообразной соматической и инфекционной патологией [2-7]. При отсутствии специфической терапии генерализованная ЦМВИ у новорожден-ных может привести в 80% случаев к смерти, а при выживании последних у 50% младенцев могут быть тяжелые последствия: гемипарезы, судороги и др. [8]. ЦМВ обладает множественными механизмами имму-носупрессии и ускользания от иммунного ответа хозяина. Основной контроль за переносом ЦМВ
от матери к плоду и защитой плода от ЦМВИ осуществляет иммунная система матери, в том числе интерферон у (ИФНу) [9, 10]. Значимое место в структуре противовирусного иммунитета занимают про- и противовоспалительные цитокины, в частности интерлейкины (ИЛ), активно оказывающие влияние на пролиферацию, дифференцировку и созревание Т-лимфоцитов [11].
В связи с этим целью данной работы явилась разработка клинико-иммунологических критериев прогноза развития тяжелых форм ЦМВИ у детей первых месяцев жизни с целью своевременного назначения адекватной терапии.
Материалы и методы исследования
Изучены клинико-лабораторные данные 147 новорожденных и детей первых месяцев жизни с
Контактная информация:
Кравченко Лариса Вахтанговна - д.м.н., ведущий научный сотрудник отдела педиатрии ФГУ
Ростовского НИИ акушерства и педиатрии Росздрава
Адрес: 344012 г. Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43
Тел.: (863) 232-56-64, E-mail: [email protected]
Статья поступила 14.05.10, принята к печати 30.09.10.
ЦМВИ (основная группа), находившихся на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных ФГУ Ростовский НИИ акушерства и педиатрии Федерального агентства по высокотехнологической медицинской помощи. В зависимости от тяжести состояния (согласно классификации К.В. Орехова, 2002) дети с ЦМВИ были разделены на 2 группы: 1-я группа - ЦМВИ, типичная генерализованная форма (тяжелая) - 67 детей (45,6%); 2-я группа - ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) - 80 детей (54,4%).
Контрольную группу (3-я группа) составили 24 условно здоровых ребенка обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных ЦМВ.
За детьми с ЦМВИ осуществляли динамическое наблюдение в течение первых 6 месяцев жизни. Всем детям на 1-м месяце жизни проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее использование молекулярно-биологического метода определения ЦМВ (ПЦР). В качестве материала для исследования пациентов служили периферическая кровь и моча. Использовали набор реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) и оборудования, включающего многоканальный амплифи-катор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология, г. Москва) с компьютером и программным обеспечением «Sigmagel» (Швеция).
Определение специфических антител (АТ) классов IgG и IgM в сыворотке крови к ЦМВ проводили непрямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Уровень интерферона а (ИФНа), интерферона у (ИФНу), ИЛ2 и ИЛ4 и фактора некроза опухолей а человека (ФНОа) в сыворотке крови определяли с помощью набора реагентов для твердофазного иммуноферментного анализа ProCon IF2 plus, ProCon Ifgamma, ProCon IL2, ProCon IL4, ProCon TNFа (ООО «Протеиновый контур», Россия, г. Санкт-Петербург).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «STATISTICA-6». В связи с тем, что распределение данных не подчинялось нормальному закону, для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Были также применены нелинейные методы анализа многомерных нелинейных зависимостей с использованием пакета PolyAnalist 3.5 Pro, метод «деревья классификации» с оценкой точности, чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов. Для представления результатов использованы медиана и интерквартильный размах. Различия сравниваемых величин признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Пересечение интерквар-тильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп [12, 13].
Результаты и их обсуждение
Анализ результатов ДНК-диагностики ЦМВИ, определяемых методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), показал, что в группе с тяжелым течением ЦМВИ у 31,4% детей в лейкоцитах крови определялась ДНК ЦМВ, у 71,3% больных ДНК ЦМВ была обнаружена в моче. Повышенный уровень ^М и IgG в лик-воре отмечался у 13,4% детей этой группы. У детей со среднетяжелым течением заболевания в крови в 13,8% случаев определяли ДНК ЦМВ, в 80% случаях ДНК ЦМВ обнаруживалась только в моче, в остальных случаях диагноз ЦМВИ был поставлен на основании обнаружения ^М в сыворотке крови у 7,5% больных детей. Динамика уровня IgG при ЦМВИ свидетельствует о достоверном нарастании титра анти-ЦМВ-IgG через 3-6 месяцев от начала заболевания в обеих группах (от 88 у.е. до 101 у.е. в 1-й группе и от 37 у.е. до 90 у.е. во 2-й группе).
Следует отметить, что тяжелая форма ЦМВИ развивалась у детей, родившихся у матерей с вегетососудистой дистонией (19,4%), кольпитом (20,9%), угрозой прерывания беременности (62,7%), ОРВИ (34,3%), гипоксией плода (38,8%), фетоплацентарной недостаточностью (17,9%). К особенностям преморбидного фона больных со среднетяжелой формой ЦМВИ относилось выявление у матерей вегетососудистой дистонии (12,5%), воспалительных заболеваний урогенитального тракта (32,5%), ОРВИ (27%), анемии (26,3%), угрозы прерывания беременности (52,5%), гипоксии плода (40%), причем достоверных различий с тяжелой формой ЦМВИ выявлено не было.
При оценке клинических данных на первом месяце жизни у всех детей выявлена группа признаков, не имевших статистически значимых различий по частоте их обнаружения (табл. 1). К таким признакам были отнесены лихорадка, конъюгационная желтуха, гипербилирубинемия, гепатит, лимфоаденит, ринофарингит.
В то же время клиническая картина заболевания имела и особенности, характерные для каждой группы больных. Так, при тяжелой форме ЦМВИ в высоком проценте случаев встречались такие симптомы, как сосудистая дезадаптация (86%), увеличение размеров печени (56,7%), гипотрофия (49,25%), геморрагический синдром (23,9%), менингоэнцефалит (13,4%). При среднетяжелой форме ЦМВИ достоверно реже по сравнению с тяжелой формой ЦМВИ встречались такие симптомы, как одышка (р<0,0001), тахикардия (р<0,0001), сосудистая дезадаптация (р<0,0001), геморрагический синдром (р<0,0001), увеличение размеров печени (р<0,0001), пневмония (р<0,0001). При этом такое грозное осложнение, как менингоэнце-фалит, у детей 2-й группы не регистрировалось.
Большинство обследованных детей с ЦМВИ имели различную неврологическую симптоматику
Таблица 2
Частота встречаемости основных неврологических симптомов и синдромов у детей с ЦМВИ на первом месяце жизни
Таблица 1
Характеристика и частота клинических симптомов у детей с ЦМВИ на первом месяце жизни
Клинические признаки ЦМВИ тяжелая форма (n=67) ЦМВИ средне-тяжелая форма (n=80) Р
n % от группы n % от группы
Одышка 45 67,2 9 11,3 0,0001
Тахикардия 44 65,7 14 17,5 0,0001
Сосудистая дезадаптация 58 86,6 38 47,5 0,0001
Лихорадка 20 29,9 21 26,3 0,7
Менингоэнцефалит 9 13,4 0 0 0,0001
Геморрагический синдром 16 23,9 4 5,0 0,001
Конъюгационная желтуха 23 34,3 32 40,0 0,5
Увеличение печени 38 56,7 15 18,8 0,0001
Гипербилирубинемия 22 32,8 26 32,5 1,0
Гепатит 10 14,9 6 7,5 0,1
Лимфоаденит 5 7,5 5 6,3 1,0
Пневмония 36 53,7 5 6,3 0,0001
Ринофарингит 30 44,8 30 37,5 0,03
Везикулярная сыпь 5 7,5 9 11,3 0,5
Аллергодерматит 16 23,8 16 20,0 0,7
Конъюнктивит 9 13,4 0 0 0,0006
Гипотрофия 33 49,2 22 27,5 0,01
Неврологические синдромы ЦМВИ тяжелая форма (n=67) ЦМВИ среднетяжелая форма (n=80) Р
n % от группы n % от группы
Синдром угнетения 39 58,2 19 23,7 0,0001
Повышенная возбудимость 28 41,8 44 55 0,1
Судороги 24 35,8 5 6,3 0,0001
Страбизм 31 46,3 24 30 0,05
Нистагм 22 32,8 8 10 0,009
Тремор конечностей 42 62,7 48 60,0 0,5
Гипертензионно-гидроцефальный синдром 60 89,6 72 90,0 1,0
Мышечная гипотония 39 58,2 23 28,8 0,0004
Угнетение рефлексов новорожденного 47 70,1 33 41,3 0,0005
Гипертонус мышц 30 44,8 53 66,3 0,01
Синдром пирамидной недостаточности 42 62,7 45 56,3 0,5
Синдром вегетовисцеральных дисфункций 40 59,7 36 45,0 1,0
(табл. 2). В отличие от детей с тяжелой формой ЦМВИ, в группе детей со среднетяжелой формой ЦМВИ значительно реже отмечались судороги (р<0,0001), синдром угнетения (р<0,0001), мышечная гипотония (р<0,0004) и гипертонус мышц (р<0,01). Синдромы повышенной возбудимости и вегетовисцеральных дисфункций встречались во всех группах больных с одинаковой частотой.
В настоящее время рассмотрение патогенеза ЦМВИ невозможно без комплексной оценки гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета, играющего регулирующую роль на всех этапах иммунного ответа [14] (табл. 3). Проведена сравнительная оценка содержания ИФНа, ИФНу,
ИЛ2 и ИЛ4 и ФНОа в периферической крови на 1-м месяце жизни у детей с различными формами ЦМВИ. У всех детей в обследуемых группах в начале заболевания отмечалось достоверное повышение в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой уровня ИЛ2, ИЛ4. Причем наиболее высокая концентрация ИЛ2 отмечалась в группе детей с ЦМВИ, типичной генерализованной формой. Обращает на себя внимание тот факт, что при тяжелой форме ЦМВИ разница между уровнями ИЛ2 и ИЛ4 больше, чем в случаях со среднетяже-лым течением заболевания. Это свидетельствует о нарушении баланса про- и противовоспалительных цитокинов и характеризует глубину наруше-
Таблица 3
Уровень цитокинов в сыворотке крови у детей с ЦМВИ на первом месяце жизни
Группы больных Показатели ИЛ2, пг/мл ИЛ4, пг/мл ИФНа, пг/мл ИФНу, пг/мл ФНОа, пг/мл
ЦМВИ тяжелая форма (п=54) медиана (1-3 квартили) 292,9 (134,6-463,0) 70,5 (42,9-113,4) 12,7 (6,6-19,2) 408,5 (220,5-620,5) 24,4 (5,9-45,7)
Р1-3 0,0001 0,01 0,006 0,0001 0,002
р1-2 0,001 0,25 0,28 0,003 0,178
ЦМВИ среднетяжелая форма (п=52) медиана (1-3 квартили) 139,6 (95,1-286) 92,2 (49,3-167,1) 14,7 (6,8-24,9) 87,8 (62,0-236,1) 35,8 (9,3-78,8)
р1-3 0,001 0,007 0,006 0,003 0,0001
Контрольная группа(п=15) медиана (1-3 квартили) 89,2 (57,5-107,6) 68,9 (50,8-84,0) 9,6 (6,3-15,4) 497,9 (209,9-581,9) 7,7 (5,9-17,2)
ний иммунного статуса, связанных с воспалительным процессом. Выраженный индуцибельный ответ на внедрение вируса отмечался у всех детей с ЦМВИ и характеризовался повышением в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой уровня ИФНа (р<0,006). Это свидетельствует о его своевременном включении в процесс противовирусной защиты, в то время как уровень ИФНу был ниже по сравнению с контрольной группой. У новорожденных с ЦМВИ уровень ФНОа в сыворотке крови повышался по сравнению с контрольной группой. При тяжелой форме ЦМВИ уровень ИЛ2 и ИФНу был достоверно выше по сравнению со среднетяжелой формой заболевания.
Для прогноза клинической формы ЦМВИ предложена формула, полученная с применением метода «деревья классификации» и логистической регрессии с использованием в качестве исходных параметров значения уровней цитокинов ИЛ2, ИЛ4, ИФНа, ИФНу, ФНОа: ИФНа • 0,1 + ИФНу • (-0,006)+ 0,769.
Если результат расчета по формуле <0,18, прогнозируется тяжелая форма ЦМВИ; если результат расчета по формуле >0,18, то прогнозируется среднетяжелая форма ЦМВИ. Чувствительность -84,2%, специфичность - 80%, прогностическая ценность положительного результата - 4,2, прогностическая ценность отрицательного результата - 5. Статистически влияющими факторами на прогноз формы ЦМВИ из 5 изученных цитокинов являются ИФНа и ИФНу, остальные цитокины при решении данной задачи исключены как статистически незначимые.
Объяснение этого факта состоит в том, что наиболее значимое место в противовирусном иммунитете принадлежит интерферонам. Имеется немало работ отечественных и зарубежных авторов, в которых изучены механизмы иммуносуп-рессии, позволяющие ЦМВ ускользать от иммун-
ного ответа больного за счет подавления синтеза цитокинов, и в первую очередь ИФНа, ИФНу [15, 16]. При ЦМВИ отмечаются увеличение в общем пуле ИФНа и ингибиция ИФНу. Учитывая, что синтез ИФНу снижен у детей 1-го года жизни по сравнению со взрослыми людьми, его дополнительное снижение при ЦМВИ обусловливает тяжесть течения заболевания у обследуемых детей. По-лученные нами данные подтверждают имеющиеся в литературе сведения о контрольно-регуляторных функциях системы интерферона в поддержании биологического гомеостаза. Системе интерферона принадлежит ведущая роль в надзоре за генетическим постоянством организма. Это позволяет ИФН влиять на весь комплекс защитных реакций организма и делает его важнейшим фактором неспецифической резистентности.
Выводы
1. У детей первых месяцев жизни тяжелая форма ЦМВИ характеризуется наличием гепато-мегалии (56,7%), пневмонии (53,7%), гипотрофии (49,2%), конъюгационной желтухи (34,3%), геморрагического синдрома (23,9%), менинго-энцефалита (13,4%). При среднетяжелой форме ЦМВИ достоверно реже обнаруживаются увеличение печени (18,8%), пневмония (6,3%), геморрагический синдром (5%).
2. Наиболее информативными критериями тяжести ЦМВИ у детей наряду с вышеуказанными клиническими особенностями, выявлением ЦМВ при молекулярно-генетическом исследовании крови и мочи, нарастанием титров анти-ЦМВ-IgG в динамике заболевания, являются изменения иммунного статуса. При ЦМВИ независимо от формы заболевания регистрируется достоверное увеличение ИЛ2, ИЛ4, ИФНа, ФНОа в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой. Тяжелая форма ЦМВИ характеризуется достовер-
но более высоким уровнем в сыворотке крови ИЛ2 и ИФНу по сравнению со среднетяжелой формой заболевания.
3. Выявлено статистически значимое влияние на прогноз заболевания содержания ИФНа и ИФНу в сыворотке крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ожегов А.М., Мальцев С.В, Мякишева Л.С. Клинико-иммунологическая характеристика активной цитомегалови-русной и сочетанной с ней инфекции у детей первого года жизни. Педиатрия. 2001; 2: 26-31.
2. Вельтищев Ю.Е., Юрьева ЭА. О значении методов лабораторной диагностики для профилактической (превентивной) педиатрии. Рос. вест. перинатологии и педиатрии. 2000; 5: 6-14.
3. Цхай В.Б., Волков НА., Голубцов Л.С. Возможности ультразвуковых методов исследования (эхографии, кардио-тографии, допплерографии) в диагностике внутриутробного инфицирования. Ультразвуковая диагностика в акуш., гин. и пед. 2000; 2: 89-93.
4. Елизарова М.Г., Мизалев Е.В., Филиппов Г.П. и др. Варианты адапционных реакций у новорожденных группы высокого риска по внутриутробному инфицированию. Акуш. и гин. 2005; 4: 19-23.
5. Сучков С.В., Маматказина Р.Р., Черепахина Н.Е., и др. Герпесвирусная инфекция: особенности взаимодействия вируса с системой противовирусного иммунитета. Вопр. гин., акуш. и перинатологии. 2007; 6 (3): 73-81.
6. Gaytant MA, Rours GI, Steegers EA et al. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Eur. J. Pediatr. 2003; 162 (34): 248-253.
7. Holler LM, Grissom H. Human herpes virus in pregnancy: cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and varicella zoster virus. Clin. Perinatol. 2005; 23 (3): 671-696.
8. Кудашов Н.И. Особенности терапии герпетического поражения головного мозга у новорожденных. Трудный пациент. 2009; 7 (11): 11-17.
9. Старикова ЭА, Фрейдлин И.С., Соколов Д.И. и др. Изменение свойств эндотелиальных клеток линии ЕА^у 926 под влиянием фактора некроза опухоли а, интерферона у, интерлейкина 4. Иммунология. 2006; 26 (2): 83-87.
10. Pusztai R, Lukacsi A, Kovacs I. Mother-to-fetus transmission of cytomegalovirus. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2004; 51 (4): 385-401.
11. Li H, Zhang J, Kumar A et al. Herpes simplex virus 1 infection induces the expression of proinflammatory cytokines, interferons and TLR7 in human corneal epithelial cells. Immunology. 2006; 117 (2): 167-176.
12. Власов В.В. Эффективность диагностических исследований. Эффективность диагностических исследований. М.: Медицина, 1988: 22.
13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: МедиаСфера, 2002: 312.
14. Маматказина Р.Р., Остроумов О.А., Ищенко А.И. и др. Герпесвирусная инфекция и особенности противовирусного иммунитета. Вопр. гин., акуш. и перинатологии. 2007; 6 (4): 49-57.
15. Ершов Ф.И.,. Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005: 356.
16. Taylor GH. Cytomegalovirus. Am. Fam. Physician. 2003; 67 (3): 519-524.
© Коллектив авторов, 2009
