ОСОБЕННОСТИ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-КЛЕТОК КРОВИ И УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ CD25 У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ГРЕЙВСА В ДИНАМИКЕ ПОСЛЕ РАДИОНУКЛИДНОГО ЛЕЧЕНИЯ

Дудина М. А.; Савченко А. А.; Догадин С. А.; Борисов А. Г.; Беленюк В. Д.

красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого, Красноярск, Россия

2Краевая клиническая больница, Красноярск, Россия

3Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук, Красноярск, Россия

ОБОСНОВАНИЕ. Пониженное число регуляторных Т-клеток (Treg) на разных стадиях формирования эффекторных субпопуляций и уровень экспрессии CD25 на их мембране при болезни Грейвса (БГ) могут определять длительную персистенцию аутоиммунного процесса и являться мишенью для иммунотропной терапии заболевания. ЦЕЛЬ. Изучить особенности субпопуляционного состава и уровень экспрессии CD25 на мембране Treg в крови у пациентов с БГ в динамике после радионуклидного лечения для выделения отдельных субпопуляций Treg в качестве возможных мишеней для иммунотропной терапии заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Проведено одноцентровое проспективное когортное открытое контролируемое исследование с участием пациентов с лабораторно подтвержденной БГ. Методом проточной цитометрии с применением мо-ноклональных антител были исследованы особенности субпопуляционного состава Treg и уровень экспрессии MFI поверхностного рецептора CD25.

РЕЗУЛЬТАТЫ. В исследование включены 36 женщин с рецидивом БГ, средний возраст 46,34±14,32 года. У пациентов с БГ до и в течение всего периода после радионуклидного лечения установлен низкий относительно контрольного диапазона процентный уровень наивных (CD45R0-CD62L+) и терминально-дифференцированных (CD45R0-CD62L-) Treg, а через 3 и 6 мес выявлено значительное снижение клеток с данным фенотипом и относительно значений, выявляемых у больных в период до и через 1 мес после радиойодтерапии (p<0,001). Наиболее значимые изменения в уровнях экспрессии рецептора CD25 были обнаружены через 3 и 6 мес после радионуклидного лечения: на фоне компенсированного пострадиационного гипотиреоза в крови пациентов с БГ остаются пониженными уровни MFI CD25 на поверхности наивных и терминально-дифференцированных Treg.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Установлено понижение уровня наивных Treg (по-видимому, за счет нарушения процессов диффе-ренцировки в тимусе) и терминально-дифференцированных Treg (за счет процессов созревания и выживаемости), которые дополняются пониженным уровнем экспрессии рецептора CD25 на поверхности этих клеток и не зависят от компенсации гипертиреоза, титра антител к рецептору тиреотропного гормона, предшествующей консервативной терапии тиамазолом и радионуклидного лечения. Полученные новые данные вносят вклад в понимание роли наивных и терминально-дифференцированных субпопуляций Treg в иммунопатогенезе БГ и помогают наметить дальнейшие пути разработки подходов для иммунотропной терапии.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: болезнь Грейвса;регуляторные Т-лимфоциты;уровень экспрессии CD25;радионуклидная терапия.

THE FEATURES OF REGULATORY T-BLOOD CELLS SUBPOPULATION AND THE LEVEL OF CD25 EXPRESSION IN PATIENTS WITH GRAVES' DISEASE IN DYNAMICS AFTER RADIOACTIVE IODINE THERAPY

'Krasnoyarsk State Medical University, Krasnoyarsk, Russia 2Krasnoyarsk regional clinical hospital, Krasnoyarsk, Russia 3Federal Research Center «Krasnoyarsk Science Center», Krasnoyarsk, Russia

BACKGROUND: The content of regulatory T cells (Treg) at different stages in formation of effector subpopulations and the level of CD25 expression on the membrane of their various fractions in Graves' disease can determine the long-term autoimmune process persistence and be the target of immunotropic therapy of the disease.

AIM: To study the features of regulatory T-blood cells subpopulation and the level of CD25 expression in patients with Graves' disease in dynamics after radioactive iodine therapy (RIT) to identify the specific Treg subpopulations for potential immunotropic therapy targets of the disease.

MATERIALS AND METHODS: A single-center, prospective, cohort, open, controlled study was conducted with the participation of women with laboratory-confirmed Graves' disease. The features of regulatory T-blood cells subpopulation and the level of expression (MFI) CD25 surface receptor were studied by flow cytometry using direct immunofluorescence using monoclonal antibodies.

RESULTS: The study included 36 women with recurrent Graves' disease, middle age 46.34±14.32 years. In patients with Graves' disease before and during the entire period after RIT a low percentage of naive (CD45R0"CD62L+) and terminally differentiated (CD45R0"CD62L") Treg was established relative to the control, and on 3 and 6 months after RIT a significant decrease of cells with this phenotype was revealed relative to the values detected in patients before and 1 month after RIT (p<0.001). Against the background of compensated hypothyroidism the most significant changes of expression CD25 receptor in patients with Graves' disease were found on 3 and 6 months after RIT: reduced levels of MFI CD25 on surface of naive and terminally differentiated Treg.

CONCLUSION: A decrease in the level of naive Treg was found (apparently due to a violation of differentiation processes in thymus) and terminally differentiated Tregs (due to maturation and survival processes), which are supplemented by a reduced expression of the CD25 receptor on the surface of these cells and do not depend on hyperthyroidism compensation, the titer of TSH receptor antibodies, previous conservative therapy with thiamazole and RIT. The obtained new data reveal the role of naive and terminally differentiated Treg subpopulations in immunopathogenesis and help to outline further ways to develop approaches for immunotropic therapy.

KEYWORDS: Graves' disease; regulatory T-cells; CD25 expression; radioactive iodine therapy.

ОБОСНОВАНИЕ

Болезнь Грейвса (БГ) — органоспецифическое аутоиммунное заболевание, возникающее вследствие нарушения иммунологической толерантности и образования аутоантител к рецептору тиреотропного гормона (рТТГ), клинически выражающееся поражением щитовидной железы (ЩЖ) с формированием синдрома тиреотоксикоза и экстратиреоидной патологией. Ежегодно регистрируется 20-50 новых случаев на 100 тыс. человек, при этом заболевание превалирует среди женщин [1, 2]. По завершении консервативной терапии всего 30% пациентов достигают стойкой ремиссии, в то время как у большинства пациентов с БГ заболевание рецидивирует и клинически может проявляться как гипертиреозом, так и сменой медикаментозного гипо-и эутиреоза при консервативном лечении антитирео-идными препаратами [3, 4].

Расширение знаний о роли регуляторных Т-лим-фоцитов (Тгед) и дефекте их супрессорной функции, а также фенотипическая изменчивость и высокая конститутивная экспрессия поверхностного маркера СР25 (рецептора для интерлейкина 2, имеют решаю-

щее значение в раскрытии механизмов персистенции аутоиммунного процесса при БГ [1, 5]. Тгед реализуют супрессию, используя многочисленные механизмы, причем их важной конститутивной фенотипической особенностью является высокий уровень экспрессии маркера СР25 [6].

К настоящему времени Тгед рассматриваются как возможная терапевтическая мишень при БГ. В некоторых исследованиях в качестве мишени иммунотроп-ной терапии заболевания обсуждается субпопуляция адаптивных Тгед, дефект которых при БГ заключается в отсутствии признаков пролиферации и продукции эффекторных цитокинов при их стимуляции [7, 8]. Однако до сих пор отсутствует полное понимание механизмов снижения уровня и дефекта супрессорной функции Тгед при БГ [9]. В результате неэффективности консервативной терапии возникает необходимость в разработке этиопатогенетических методов лечения БГ. С учетом возможного влияния консервативной терапии тиамазолом и радионуклидного лечения на иммунный статус пациентов с БГ, актуальным является изучение уровня Тгед в динамике после проведенного лечения [10].

Содержание Тгед на разных стадиях формирования эффекторных субпопуляций и уровень экспрессии СР25 на их мембране могут определять длительную перси-стенцию аутоиммунного процесса при БГ. В свою очередь, изучение содержания отдельных субпопуляций Тгед является многообещающим подходом для будущих методов лечения заболевания.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить особенности субпопуляционного состава и уровень экспрессии СР25 на мембране Тгед в крови у пациентов с БГ в динамике после радионуклидного лечения для выделения отдельных субпопуляций Тгед в качестве возможных мишеней для иммунотропной терапии заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Исследование проводилось на базе эндокринологического центра КГБУЗ «Краевая клиническая больница» (г. Красноярск).

Время исследования. Наблюдение пациентов осуществлялось с 6 сентября 2017 г. по 24 марта 2021 г.

Изучаемые популяции

Изучались две популяции — пациенты с БГ и здоровые люди (контроль).

Популяция «пациенты с БГ»

Критерии включения: женский пол, возраст от 18 до 65 лет, лабораторно подтвержденная БГ.

Популяция «контроль»

Критерии включения: женский пол, возраст от 18 до 65 лет.

Критерии исключения в изучаемых популяциях: узловой/многоузловой токсический зоб, беременность, лактация, эндокринная офтальмопатия, наличие инфекционных и аллергических заболеваний, новообразования, системные заболевания соединительной ткани, другие заболевания органов эндокринной системы, острые респираторные и вирусные инфекции, сердечная недостаточность, введение профилактических прививок в течение 2 мес, предшествующих иммунологическому и гормональному анализу.

Способ формирования выборки из изучаемой

популяции

Формирование группы больных с рецидивом БГ проводилось сплошным способом подбора. Верификация диагноза, консервативное лечение и направление пациентов с БГ на радионуклидное лечение осуществлялись согласно национальным клиническим рекомендациям [11]. Рецидивом гипертиреоза считалось изменение показателей тиреоидного статуса, соответствующих критериям субклинического или манифестного гипертиреоза, у обследуемых пациентов с ранее достигнутым и подтвержденным лабораторно медикаментозным эутиреозом.

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое проспективное когорт-ное открытое контролируемое исследование с участием пациентов с лабораторно подтвержденной БГ.

Методы

Все обследуемые пациенты наблюдались в КГБУЗ «Краевая клиническая больница» с дебюта заболевания и получали медикаментозное лечение тиамазолом по стандартной схеме с постепенным переходом на поддерживающую дозу тиреостатика. При диагностике рецидива гипертиреоза до устранения симптомов тиреотоксикоза всем пациентам доза тиамазола была увеличена до лечебной. Поддерживающая доза тиамазола отменялась за 14 дней до приема раствора радиоактивного йода (131I). Клинико-гормональное и иммунологическое обследования проводились до приема терапевтической активности 131I, а также через 1, 3 и 6 мес после радионуклидного лечения. Обследование пациентов с БГ до радиойодтера-пии (РЙТ) проводилось непосредственно в день проведения процедуры, соответственно через 2 нед после отмены тиамазола. Всем пациентам с диагностируемым пострадиационным гипотиреозом назначалась заместительная терапия левотироксином натрия.

Клинические методы обследования включали объективный осмотр, пальпацию ЩЖ, клинико-лаборатор-ную оценку тиреоидного статуса и титра антител к рТТГ в сыворотке крови до и в динамике после радионуклидного лечения. Определение содержания тиреоидных гормонов осуществлялось методом хемилюминесцент-ного иммуноанализа на автоматическом анализаторе Architecti 1000sr (Abbott Diagnostics, США) в гормональной лаборатории эндокринологического центра Красноярской краевой клинической больницы, референсные показатели: для ТТГ (0,4-4,0 мЕд/л), свободного тироксина (свТ4) (9,01-19,05 пмоль/л), свободного трийодти-ронина (свТ3) (2,14-6,42 пмоль/л). Уровень аутоантител к рТТГ оценивался иммуноферментным методом при помощи набора Medizym T.R.A. (MedipanGmbH, Германия). Исследование объема и определение структуры ЩЖ у пациентов с БГ и лиц контрольной группы проводилось ультразвуковым методом на аппарате Philips iU22 xMatrix (США) с линейным датчиком 7,5 МГц.

Радионуклидное лечение проводилось на базе отделения радионуклидной терапии ФМБА России г. Красноярска. Для всех пациентов радионуклидное лечение проводилось впервые в качестве терапии второй линии. На основании комплексного предтерапевтического об-

следования всем пациентам назначалась удельная активность 131I перорально в виде изотонического водного раствора натрия йодида.

Исследование фенотипа Т-лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии цельной периферической крови с применением моноклональных антител (Beckman Coulter, USA), меченных FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), ECD (phycoerythrin-TexasRed-X), PC5 (phycoerythrin-cyanin 5), PC7 (phycoerythrin-cyanin 7), AA700 (alexafluor 700) и AA750 (alexafluor 750) в следующих панелях: CD8-FITC/CD127-PE/CD25-PC5/CD4-PC7/ CD3-AA700/CD45-AA750 и CD5-FITC/CD23-PE/CD19-ECD/ CD45-PC5/CD27-PC7. Распределение антител по каналам флуоресценции проводили в соответствии с принципами формирования панелей для многоцветных цитофлуори-метрических исследований [12]. Процесс дифференци-ровки Treg изучался по экспрессии на поверхности Treg рецепторов CD45R0 и CD62L. Исследовался состав следующих субпопуляций Treg: наивные (CD45R0-CD62L+Treg), Treg центральной памяти (CD45R0+CD62L+Treg), эффек-торной памяти (CD45R0+CD62L-Treg) и терминально-дифференцированные Treg (CD45R0-CD62L-Treg). Уровни экспрессии поверхностного рецептора CD25 оценивали по средней интенсивности флуоресценции (MFI). Про-боподготовку выполняли по стандартной методике [13]. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, USA) Красноярского регионального центра коллективного пользования ФИЦ КНЦ СО РАН. Обработку полученных цитофлу-ориметрических результатов осуществляли с помощью программ Navios Software v. 1.2 и Kaluzav. 2.1.1 (Beckman Coulter, USA). В каждой пробе анализировали не менее 50 000 лимфоцитов.

Статистический анализ

Описание полученных данных производили с помощью подсчета медианы (Ме) и интерквартильного размаха в виде 1-3 квартилей (Q1-Q3). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий Шапиро-Уилка. Статистическую значимость различий между исследуемыми показателями больных и контрольной группы оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test). Статистическую значимость различий в динамике после радионуклидного лечения определяли с помощью критерия Вилкоксона (Wilcoxon matched pairs test). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 8.0 (StatSoftInc., 2007).

Этическая экспертиза

Протокол исследования рассмотрен и одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России (протокол № 72/2016 от 09.11.2016) и КГБУЗ «Краевая клиническая больница» (протокол № 124 от 07.04.2016).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование включены 36 женщин с рецидивом БГ, средний возраст 46,34±14,32 года, которые наблюдались в эндокринологическом центре КГБУЗ

«Краевая клиническая больница» и получали консервативное лечение тиамазолом с дебюта заболевания. При верификации заболевания манифестный гиперти-реоз диагностирован у 29 (80,00%) и субклинический гипертиреоз — у 7 (20,00%) пациентов соответственно, ТТГ=0,01 мЕд/л (0,001-0,03), свТ3=7,34 пмоль/л (5,11-12,32), свТ4=32,09 пмоль/л (25,63-38,12) и ТТГ=0,02 мЕд/л (0,004-0,11), свТ3=5,01 пмоль/л (3,23-5,36), свТ4=13,27 пмоль/л (11,25-18,42). На момент манифестации заболевания медиана уровня антител к рТТГ у пациентов с БГ статистически значимо не отличалась в зависимости от степени тяжести ги-пертиреоза и составила 14,52 мЕд/л (7,95-23,15). Медиана продолжительности консервативного лечения ти-амазолом составила 5 мес (2-9), при этом у 27 (75,00%) рецидив гипертиреоза развивался в течение 2 мес, а у 9 (25,00%) — спустя 7-12 мес после достижения медикаментозного эутиреоза.

При планировании радионуклидного лечения все пациентки с рецидивом заболевания принимали поддерживающую дозу тиамазола и находились в состоянии медикаментозного эутиреоза: медианы уровней ТТГ, свТ3 и свТ4 на фоне приема поддерживающей дозы тирео-статика составили соответственно 0,21 мЕд/л (0,11-0,67), 4,21 пмоль/л (3,42-4,91) и 15,29 пмоль/л (11,54-19,81). Уровень антител к рТТГ при купировании рецидива ги-пертиреоза статистически значимо не отличался от показателей, установленных в дебюте заболевания, и составил 12,91 (5,59-21,32) мЕд/л. Клинико-лабораторная характеристика пациентов с БГ на момент обследования до РЙТ и в динамике после радионуклидного лечения представлена в таблице 1.

На фоне отмены антитиреоидной терапии в течение 2 нед до радионуклидного лечения у большинства обследуемых пациентов развился субклинический гипертиреоз с сохраняющимся высоким уровнем ау-тоантител к рТТГ, титр которых статистически значимо не изменялся в сравнении со значениями, установленными в состоянии достигнутого медикаментозного эутиреоза. Медиана терапевтической активности 1311 при радионуклидном лечении обследованных пациентов с БГ составила 500 мБк (400-700). У всех пациентов клинико-лабораторный симптомокомплекс пострадиационного гипотиреоза развивался на 3-4-й неделе после РЙТ, и при обследовании через 1 мес после радионуклидного лечения медиана уровня ТТГ соответствовала субклиническому гипотиреозу, а уровень аутоантител к рТТГ был статистически значимо снижен относительно значений, установленных до радионуклидного лечения, но оставался повышенным относительно контроля. При обследовании через 3 мес после радионуклидного лечения все пациенты находились в состоянии компенсированного пострадиационного гипотиреоза. При контрольном клинико-гормональ-ном обследовании через 6 мес после радионуклидного лечения все пациенты сохраняли компенсированный пострадиационный гипотиреоз. Уровень антител к рТТГ статистически значимо снижался в течение всего пострадиационного периода, но оставался повышенным относительно контрольных значений в исходе радионуклидного лечения.

При исследовании содержания Тгед (СР3+С04+СР127|-ожС025Н|д|1) в крови у пациентов с БГ обнаружено, что еще до проведения радионуклидного

Таблица 1. Клинико-гормональная характеристика пациентов с болезнью Грейвса в динамике после радионуклидного лечения (РЙТ), Ме, (01-03)

Показатель

Контроль п=42

Пациенты с БГ в динамике после радионуклидного лечения

(n=36)

до РИТ

через 1 мес

через 3 мес

через 6 мес

1

2

3

4

5

ТТГ, мЕд/л 1,14 (0,86-1,56) 0,07 (0,01-0,45) p1<0,001 7,23 (6,23-10,72) p=0,010 p21 <0,001 2,36 (0,68-7,81) p1<0,001 p3<0,001 2,12 (0,99-3,44) p1<0,001 p3<0,001

свТ3, пмоль/л 4,14 (2,91-5,52) 5,21 (4,31-6,91) p1<0,001 2,52 (1,68-3,87) p=0,010 p21 <0,001 3,21 (2,21-4,25) p=0,010 3,42 (2,63-4,57) p2<0,001

свТ4, пмоль/л 14,12 (12,41-15,83) 16,21 (14,82-18,06) p1<0,001 10,21 (7,16-11,05) p1 <0,001 p21 <0,001 12,31 (9,56-14,61) p=0,011 p2<0,001 13,22 (12,02-15,78) p2<0,001 p3<0,001

Антитела к рТТГ, МЕ/л 0,21 (0,11-0,35) 12,41 (5,42-21,12) p1<0,001 1,75 (0,49-5,33) p1 <0,001 p21 <0,001 2,61 (1,81-3,43) p1<0,001 p21<0,001 1,42 (0,81-2,56) p1<0,001 p2<0,001

Объем ЩЖ, мл 23,42 (17,61-27,81) p1<0,001 16,23 (11,29-18,72) 13,51 (9,21-17,06) 9,24 (7,66-11,25) p1<0,001 P1<0,001 p3<0,001

9,91 (9,41-12,63) p1 <0,001 p1<0,001

p21 <0,001 p21<0,001

Примечание. р — статистически значимые различия с контрольными величинами; р2 — статистически значимые различия с показателями пациентов до РЙТ; р3 — статистически значимые различия с показателями пациентов через 1 мес после РЙТ. свТ4 — свободный тироксин, свТ3 — свободный трийодтиронин, рТТГ — рецептор тиреотропного гормона.

* Клинико-гормональные показатели до РЙТ соответствуют обследованию пациентов с БГ через 14 дней после отмены поддерживающей дозы тиамазола.

Таблица 2. Содержание различных субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов в крови у пациентов с болезнью Грейвса в динамике после радионуклидного лечения (РЙТ), Ме (Q1-Q3)

Субпопуляции регуляторных

Содержание регуляторных Т-лимфоцитов в крови в норме (n=42) и при болезни Грейвса в динамике после радионуклидного лечения (n=36)

Т-лимфоцитов контроль до РЙТ через 1 мес через 3 мес через 6 мес

1 2 3 4 5

CD3+CD4+CD127LowCD25High, 109/л 0,069 (0,059-0,117) 0,030 (0,013-0,067) p1<0,001 0,025 (0,013-0,065) p1<0,001 0,022 (0,013-0,033) p1<0,001 0,022 (0,017-0,035) p1<0,001 р2=0,008

CD3+CD4+CD127LowCD25High, % 1,55 (0,83-3,09) 1,33 (0,69-3,03) 1,36 (0,65-2,56) 0,95 (0,79-1,58) 1,00 (0,77-2,04) р2=0,015

0,36 (0,26-0,69) 0,124 0,146 0,001 0,001

Treg CD45R0-CD62L+, % (0,043-0,223) p1<0,001 (0,067-0,234) p1<0,001 (0,0007-0,002) pu,3<0,001 (0,0006-0,016) pw<0,001

Treg CD45R0+ CD62L+, % 0,60 0,71 0,72 0,50 0,82

(0,32-0,89) (0,58-0,99) (0,40-0,95) (0,34-0,60) (0,50-1,08)

0,15

Treg CD45R0+ CD62L-, % 0,41 0,47 0,41 0,43 (0,12-0,32)

(0,21-0,55) (0,29-0,63) (0,27-0,53) (0,25-0,57) р2=0,018 р2=0,012

0,145 (0,124-0,207) 0,021 0,030 0,001 0,001

Treg CD45R0-CD62L-, % (0,009-0,031) p1<0,001 (0,017-0,052) p1<0,001 (0,0006-0,002) p,23<0,001 (0,0007-0,002) p,23<0,001

Примечание. р1 — статистически значимые различия с контрольными величинами; р2 — статистически значимые различия с показателями пациентов до РЙТ; р3 — статистически значимые различия с показателями пациентов через 1 мес после РЙТ.

лечения у больных относительно контрольных значений было снижено абсолютное, но не процентное содержание Тгед (табл. 2).

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В течение 6 мес после радионуклидного лечения абсолютное число Тгед оставалось сниженным. Более того, к концу периода наблюдения (6-й мес РЙТ) у обследованных пациентов выявлялось понижение абсолютного и процентного содержания Тгед относительно исходных значений. Процентный уровень наивных Тгед (СР45К0-СР621+) у пациентов с БГ понижен относительно контрольного диапазона до и в течение всего периода после радионуклидного лечения, но через 3 и 6 мес наблюдается значительное снижение клеток с данным фенотипом как относительно значений, выявляемых у больных в период до, так и через 1 мес после РЙТ. Количество Тгед центральной (СР45К0+СР621+) и эффек-торной (СР45К0+СР621-) памяти в крови у пациентов с БГ соответствовало уровням контрольного диапазона. Однако через 6 мес после РЙТ у обследованных пациентов обнаружено понижение уровня Тгед эффекторной памяти (СР45К0+СР621-) относительно значений, выявляемых в период до и через 1 мес после радионуклидного лечения. Процентное содержание терминально-дифференцированных (СР45К0-СР621-) Тгед у больных снижено относительно контрольного диапазона в течение всего периода наблюдения. В то же время уровень клеток с данным фенотипом дополнительно понижался в период через 3 и 6 мес после РЙТ относительно значений, выявляемых до и через 1 мес после радионуклидного лечения.

При исследовании уровня экспрессии СР25 (МП) на мембране различных субпопуляций Тгед в крови у пациентов с БГ были установлены значительные отличия от контрольных значений, которые зависят от сроков наблюдения в пострадиационном периоде (табл. 3).

До радионуклидного лечения в периферической крови пациентов с БГ снижен уровень экспрессии МП рецептора СР25 относительно контрольных значений на наивных (СР45К0-СР621+) и терминально-дифференцированных (СР45К0-СР621-) Тгед, остальные субпопуляции Тгед экспрессировали рецептор СР25 в соответствии с показателями контрольной группы. Через 1 мес после радионуклидного лечения, несмотря на развитие пострадиационного гипотиреоза, у обследуемых пациентов зафиксированы аналогичные статистически значимые изменения в экспрессии СР25 на отдельных субпопуляциях Тгед. Однако наиболее значимые изменения в уровнях экспрессии рецептора СР25 на поверхности отдельных субпопуляций Тгед у пациентов с БГ были обнаружены через 3 и 6 мес после радионуклидного лечения. Так, через 3 и 6 мес после приема терапевтической активности 1311, на фоне компенсированного пострадиационного гипотиреоза, в крови пациентов с БГ остаются пониженными уровни МП СР25 на поверхности наивных и терминально-дифференцированных Тгед, но добавляется понижение экспрессии данного маркера на мембране Тгед центральной памяти (СР45К0+СР621+). Уровень МП СР25 на поверхности Тгед эффекторной памяти (СР45К0+СР621-) у пациентов с БГ соответствовал значениям контрольной группы в течение всего периода наблюдения.

Таблица 3. Уровень экспрессии СР25 (МР!) на мембране различных субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов (в относительных единицах) в крови у пациентов с болезнью Грейвса в динамике после радионуклидного лечения (РЙТ), Ме (01-03)

Уровень экспрессии CD25 (MFI) в норме (п=42) и при болезни Грейвса

Субпопуляции в динамике после радионуклидного лечения (п=36)

регуляторных -3-

Т-лимфоцитов контроль до РЙТ через 1 мес через 3 мес через 6 мес

1 2 3 4 5

Treg CD45R0-CD62L+ 5,11 (3,46-8,35) 0,01 (0,007-3,24) p1<0,001 0,01 (0,006-0,02) p1<0,001 0,01 (0,007-0,02) p1<0,001 0,01 (0,005-0,02) p1<0,001

Treg CD45R0+CD62L+ 5,91 (5,09-7,48) 5,23 (4,67-8,62) 5,71 (5,21-6,02) 5,22 (4,95-5,39) p1=0,034 5,15 (0,05-5,77) p1=0,019

Treg CD45R0+CD62L- 5,81 (4,68-7,29) 5,15 (1,77-6,44) 4,97 (4,64-6,02) 5,37 (2,32-5,84) 5,01 (0,93-6,78)

Treg CD45R0-CD62L- 4,87 (4,13-6,22) 0,01 (0,005-0,02) p1<0,001 0,01 (0,004-0,02) p1<0,001 0,01 (0,006-0,02) p1<0,001 0,01 (0,006-0,02) p1<0,001

Примечание. р1 — статистически значимые различия с контрольными величинами; р2 — статистически значимые различия с показателями пациентов до РЙТ; р3 — статистически значимые различия с показателями пациентов через 1 мес после РЙТ.

ОБСУЖДЕНИЕ

Репрезентативность выборок

Набор участников исследования проводился только в эндокринологическом центре КГБУЗ «Краевая клиническая больница». Радионуклидное лечение осуществлялось всем пациентам на базе отделения радионуклидной терапии ФМБА России г. Красноярска. На внешнюю валид-ность результатов данного исследования могли повлиять индивидуальные иммуногенетические аспекты, связанные со степенью дефекта Тгед у пациентов с БГ, а также эпигенетические факторы в каждом конкретном случае заболевания.

Сопоставление с другими публикациями

Тгед являются субпопуляцией Т-клеток, которая обладает супрессорной активностью и занимает центральное место в поддержании иммунологической толерантности и ограничении иммунного ответа [14]. В предыдущих исследованиях было подтверждено наличие выраженного дефекта Тгед при БГ, который заключается в снижении количества Тгед и повышении соотношения ТЬ/Тгед как до, так и после лечения [15]. Отмечено, что у пациентов с БГ, получающих консервативное лечение тиамазолом в состоянии стойкого медикаментозного эутиреоза более 12 мес, увеличение количества Тгед в периферической крови не приводит к снижению доли активированных ТЬ-клеток [16]. Абсолютное снижение Тгед в ходе развития БГ и тенденция к восстановлению их уровня после лечения антитиреоидными препаратами у пациентов с БГ были установлены и ранее. Авторами выявлена корреляция низкого уровня Тгед с некоторыми клиническими проявлениями тиреотоксикоза, в частности, такими, как экзофтальм и/или снижение веса в дебюте гипертиреоза Грейвса [17]. В других публикациях обсуждается, что радионуклидное лечение оказывает специфическое иммунное воздействие. В 30-дневном проспективном исследовании с участием 27 пациентов с болезнью Грейвса, из которых 11 получали антитирео-идные препараты, было показано, что разница в соотношении числа Тгед и инвариантных Т-клеток естественных киллеров после РЙТ в группе больных была выше, чем в группе контроля. Авторы также отмечают и снижение

супрессорной функции Тгед у обследуемых больных с БГ после РЙТ, объясняя выявленные изменения усилением иммунной активности [18]. Клинические исследования содержания отдельных субпопуляций Тгед после радио-нуклидного лечения отсутствуют. Но к настоящему времени накоплены убедительные данные о том, что положительный титр антител к рТТГ у пациентов с болезнью Грейвса может сохраняться длительное время после ти-реоидэктомии и радионуклидного лечения [19], что согласуется и с полученными нами данными.

Настоящее исследование демонстрирует, что радио-нуклидное лечение оказывает иммуносупрессивное воздействие на систему адаптивного иммунитета, что проявляется в пониженном содержании Тгед и низком уровне экспрессии рецептора СР25 на мембране отдельных субпопуляций Тгед. Исходя из результатов исследования установлено, что у пациентов с БГ в периферической крови в динамике после радионуклидного лечения снижено количество наивных и терминально-дифференцированных Тгед. После проведения РЙТ у пациентов с БГ количество данных субпопуляций Тгед не восстанавливается и достигает минимальных значений к 6-му месяцу после радионуклидного лечения. Пониженное содержание Тгед у пациентов с БГ было выявлено и до радионуклидного лечения, независимо от титра антител к рТТГ, функции ЩЖ и предшествующей консервативной терапии тиамазолом. Причем низкий уровень Тгед у пациентов с БГ до РЙТ определяется несмотря на прогрессивное снижение титра антител к рТТГ, которое наблюдалось с 1-го месяца после терапии 131!, что свидетельствует о сохранении количественного дефекта Тгед, независимо от терапевтического воздействия 131! и устранения антигенного стимула. Низкое абсолютное число Тгед у пациентов с БГ сразу, через 1 и 3 мес после РЙТ и еще большее их снижение через 6 мес после радионуклидного лечения является аргументом в пользу иммуносупрессивного воздействия 131!.

В то же время обращает на себя внимание, что у пациентов с БГ общее процентное число Тгед (СР3+С04+СР127|-ожС025Н|д|1) и количество Тгед центральной и эффекторной памяти сохраняется в диапазоне нормальных значений в течение длительного времени, что может объясняться большей резистентностью

данных субпопуляций Treg к воздействию 131I в сравнении с остальными исследуемыми субпопуляциями Treg. Следует отметить и то, что Treg центральной памяти характеризуются как самая долгоживущая субпопуляция Т-лимфоцитов с длительным периодом циркуляции по сравнению с другими клетками памяти [14]. В свою очередь, Treg эффекторной памяти не способны мигрировать в периферические лимфоидные органы за счет отсутствия экспрессии CD62L, но проявляют более выраженную функциональную активность. Таким образом, длительное сохранение Treg памяти обоих типов у пациентов с БГ после радионуклидного лечения может объясняться их эффекторными свойствами и степенью диф-ференцировки.

Обнаружено, что в период до проведения РЙТ у пациентов с БГ снижен уровень экспрессии MFI CD25 именно на наивных и терминально-дифференцированных Treg. После РЙТ уровень экспрессии CD25 на наивных и терминально-дифференцированных Treg не восстанавливается, и, более того, на 3-м и 6-м месяцах после радионуклидного лечения выявляется снижение экспрессии данного маркера на мембране Treg центральной памяти. Известно, что результатом связывания CD25 является активация STAT (signal transducer and activator of transcription), mTOR (mammalian target of rapamycin) и различных MAPK (mitogen-activated protein kinase, ми-тоген-активируемая протеинкиназа), что проявляется в усилении пролиферативной активности и выживаемости клеток [20]. Следовательно, снижение количества наивных и терминально-дифференцированных Treg у пациентов с БГ может определяться низким уровнем экспрессии рецептора CD25 и, соответственно, пониженным уровнем пролиферативного ответа, индуцируемым IL-2. Выявленные изменения согласуются с предположением некоторых авторов о том, что при БГ существуют некоторые генетические изменения в гене CD25, которые предрасполагают к развитию аутоиммунного процесса путем нарушения функции Treg и адекватного развития периферической толерантности [21].

Клиническая значимость результатов

Выявленные закономерности в исходном дефекте Treg, его реализации на фоне двухнедельной отмены тиамазола перед РЙТ и срыва иммунологической толерантности с развитием субклинического гипертиреоза, а также иммуносупрессивное воздействие радионуклидного лечения на содержание и уровень экспрессии CD25 на мембране различных субпопуляций Treg свидетельствуют о стойком дефекте Treg при БГ и позволяют выделить субпопуляции наивных (CD45R0-CD62L+) и терминально-дифференцированных (CD45R0-CD62L-) Treg как потенциальные мишени для разработки иммунотропной терапии заболевания.

Ограничения исследования

Выраженность дефекта Treg также зависит от уязвимости иммунорегуляторных генов и их конечных продуктов транскрипции, которые расположены на поверхности Treg, таких как FOXP3, CD25 и CTLA-4. Эти гены и их продукты участвуют в обеспечении надлежащего поддержания периферической толерантности (FOXP3 и CD25) и установлении соответствующей ко-стимуля-

ции (СТМ-4) [2]. В связи с этим клинически проявление дефекта Тгед при БГ может различаться индивидуально, в зависимости от накопленных эпигенетических факторов, у каждого конкретного пациента.

Направления дальнейших исследований

Необходимы дальнейшие иммуногенетические исследования для уточнения ассоциации степени дефекта Тгед с аллелями генов системы ИЬА II класса и экспрессией HLA-DR на клетках иммунной системы, что поможет идентифицировать пациентов с БГ с более выраженным дефектом иммунорегуляции в клинической практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При анализе содержания субпопуляций Тгед у пациентов с БГ установлено понижение уровня наивных Тгед (по-видимому, за счет нарушения процессов дифферен-цировки в тимусе) и терминально-дифференцированных Тгед (за счет процессов созревания и выживаемости), которые дополняются пониженным уровнем экспрессии МП рецептора CD25 на поверхности этих клеток и не зависят от компенсации гипертиреоза, титра антител к рТТГ, предшествующей консервативной терапии тиамазолом и радионуклидного лечения. Расширение знаний о роли субпопуляций Тгед и значении наивных (CD45R0-CD62L+) и терминально-дифференцированных (CD45R0-CD62L-) Тгед в иммунопатогенезе БГ позволяет не только лучше понять механизмы рецидива и прогрес-сирования аутоиммунного процесса, но и помогает наметить дальнейшие пути разработки подходов для иммунотропной терапии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Согласие пациентов. Все исследования выполнены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

Источники финансирования. Исследование выполнялось на базе лаборатории молекулярно-клеточной физиологии и патологии Федерального исследовательского центра «Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук», обособленное подразделение «НИИ медицинских проблем Севера».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Дудина М.А. — получение, анализ данных, интерпретация результатов, написание статьи; Савченко А.А. — концепция и дизайн исследования, внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи; Дога-дин С.А. — концепция и дизайн исследования, внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи; Борисов А.Г. — интерпретация результатов, внесение в рукопись существенной (важной) правки с целью повышения научной ценности статьи; Беленюк В.Д. — получение и интерпретация результатов. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES

1. Liu Y, Zou J, Xu J, et al. Comprehensive Analysis of IncRNA Expression Profile and the Potential Role of ENST00000604491 in Graves' Disease. J Immunol Res. 2022;2022:8067464.

doi: https://doi.org/10.1155/2022/8067464.

2. Antonelli A, Ferrari SM, Ragusa F, et al. Graves' disease: Epidemiology, genetic and environmental risk factors and viruses. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2020;34(1):101387. doi: https://doi.org/10.1016/jbeem.2020.101387.

3. Kim YA, Cho SW, Choi HS, et al. The Second Antithyroid Drug Treatment Is Effective in Relapsed Graves' Disease Patients:

A Median 11-Year Follow-Up Study. Thyroid. 2017;27:491-496. doi: 10.1089/ thy.2016.0056

4. Lang BH, Woo YC, Chiu KW. Two-year outcomes of single-session high- intensity focused ultrasound (HIFU) treatment in persistent or relapsed Graves' disease. Eur Radiol. 2019; 29:6690-6698.

doi: https://doi.org/10.1007/s00330-019-06303-8

5. Janyga S, Marek B, Kajdaniuk D, et al. CD4+ cells in autoimmune thyroid disease. EndokrynolPol. 2021;72(5):572-583.

doi: https://doi.org/10.5603/EP.a2021.0076.

6. Kanamori M, Nakatsukasa H, Okada M, et al. Induced Regulatory

T Cells: Their Development, Stability, and Applications. Trends Immunol. 2016;37(11):803-811. doi: https://doi.org/10.1016/jjt.2016.08.012.

7. Koenecke C, Czeloth N, Bubke A, et al. Alloantigen-specific

de novo-induced Foxp3+ Treg revert in vivo and do not protect from experimental GVHD. Eur J Immunol. 2009;39(11):3091-3096. doi: https://doi.org/10.1002/eji.200939432.

8. Tan Y, Chen W, Liu C, et al. Effect of IL-21 on the Balance ofTh17 Cells/Treg Cells in the Pathogenesis of Graves' Disease. Endocr Res. 2019;44(4):138-147. doi: https://doi.org/10.1080/07435800.2019.1600535

9. Sakaguchi S, Mikami N, Wing JB, et al. Regulatory T Cells and Human Disease. Annu Rev Immunol. 2020;38:541-566,

doi: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-042718-041717.

10. Espinosa JR, Wheaton JD, Ciofani M. In Vitro Differentiation of CD4 T Cell Effector and Regulatory Subsets. Methods Mol Biol. 2020;2111:79-89. doi: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0266-9_7.

11. Трошина Е.А., Свириденко Н.Ю., Беловалова И.М., и др. Клинические рекомендации по диагностике и лечению тиреотоксикоза с диффузным зобом (БГ), узловым/многоузловым зобом. — М.: РАЭ, 2021 [Troshina EA, Sviridenko NYu, Belovalova IM, et al. Klinicheskierekomendatsiipo diagnostike ilecheniiu tireotoksikoza s diffuznym zobom (bolezn' Greivsa), uzlovym/mnogouzlovym zobom. Moscow: RAE, 2021 (In Russ.)].

12. Кудрявцев И.В., Субботовская А.И. Опыт измерения параметров иммунного статуса с использованием шестицветного цитофлуориметрического анализа // Медицинская иммунология. —

2015. — Т. 17. — №1. — С. 19-26. [Kudryavtsev IV, Subbotovskaya AI. Application of six-color flow cytometric analysis for immune profile monitoring. Medicinskaya Immunologiya. 2015;17(1):19-26. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-1-19-26

13. Struja T, Kutz A, Fischli S, et al. Is Graves' disease a primary immunodeficiency? New immunological perspectives on an endocrine disease. BMC Med. 2017;15(1):174.

doi: https://doi.org/10.1186/s12916-017-0939-9.

14. Chen Z, Wang Y, Ding X, et al. The proportion of peripheral blood Tregs among the CD4+ T cells of autoimmune thyroid disease patients: a meta-analysis. Endocr J. 2020;67(3):317-326. doi: https://doi.org/10.1507/endocrj.EJ19-0307.

15. Yuan Q, Zhao Y, Zhu X, et al. Low regulatory T cell and high IL-17 mRNA expression in a mouse Graves' disease model. J Endocrinol Invest. 2017;40(4):397-407. doi: https://doi.org/10.1007/s40618-016-0575-9.

16. Дудина М.А., Догадин С.А., Савченко А.А., и др. Фенотипический состав Т-лимфоцитов периферической крови у пациентов

с болезнью Грейвса при консервативной терапии тиамазолом // Проблемы эндокринологии. — 2021. — Т. 67. — №6. — С. 39-49. [Dudina MA, Dogadin SA, Savchenko AA, et al. T-lymphocytes phenotypic composition of peripheral blood in patients with Graves' disease undergoing conservative therapy with thiamazole. Problemy Endocrinologii. 2021;67(6):39-49. (In Russ.)]. doi: https://doi.org/10.14341/probl12812

17. Liu HY, Shi ZY, Fan D, et al. Absolute reduction in peripheral regulatory T cells in patients with Graves' disease and post-treatment recovery. Mol Immunol. 2022;144:49-57. doi: https://doi.org/10.1016/j.molimm.2022.02.004.

18. Côté-Bigras S, Tran V, Turcotte S, et al. Impaired immune regulation after radioiodine therapy for Graves' disease and protective effect of methimazole. Endocrine. 2016;52(3):587-596. doi: https://doi.org/10.1007/s12020-015-0832-2.

19. El Kawkgi OM, Ross DS, Stan MN. Comparison of long-term antithyroid drugs versus radioactive iodine or surgery for Graves' disease: A review of the literature. Clin Endocrinol (Oxf). 2021;95(1):3-12. doi: https://doi.org/10.1111/cen.14374.

20. Rydzewska M, Jaromin M, Pasierowska IE, et al. Role of the T and B lymphocytes in pathogenesis of autoimmune thyroid diseases. Thyroid Res. 2018;11:2. doi: https://doi.org/10.1186/s13044-018-0046-9.

21. Du P, Zhu J, Yao Q, et al. HLA-DRA Gene Polymorphisms Are Associated with Graves' Disease as an Autoimmune Thyroid Disease. Biomed Res Int. 2022;2022:6839634. doi: https://doi.org/10.1155/2022/6839634.

Рукопись получена: 11.01.2023. Одобрена к публикации: 22.02.2023. Опубликована online: 30.06.2023. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ [AUTHORS INFO]

* Дудина Маргарита Андреевна, к.м.н. [Margarita A. Dudina, MD, PhD]; адрес: 660022, Россия, Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1 [address: 1 P. Zeleznyaka street, 660022 Krasnoyarsk, Russia]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2776-927X; SPIN-код: 4854-1926; e-mail: [email protected]

Савченко Андрей Анатольевич, д.м.н., профессор [Andrei A. Savchenko, MD, PhD, Professor];

ORCID: http://orcid.org/0000-0001-5829-672X; SPIN-код: 3132-8260; e-mail: [email protected]

Догадин Сергей Анатольевич, д.м.н., профессор [Sergey A. Dogadin, MD, PhD, Professor];

ORCID: http://orcid.org/0000-0002-1709-466X; SPIN-код: 4803-3756; e-mail: [email protected]

Борисов Александр Геннадьевич [Alexandr G. Borisov, MD, PhD]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9026-2615;

SPIN-код: 9570-2254; e-mail: [email protected]

Беленюк Василий Дмитриевич [Vasiliy D. Belenyuk, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2848-0846; SPIN-код: 6195-6630; e-mail: [email protected]

ЦИТИРОВАТЬ:

Дудина М.А., Савченко А.А., Догадин С.А., Борисов А.Г., Беленюк В.Д. Особенности субпопуляционного состава регуляторных Т-клеток крови и уровень экспрессии CD25 у пациентов с болезнью Грейвса в динамике после радионуклидного лечения // Проблемы эндокринологии. — 2023. — Т. 69. — №3. — С. 35-43. doi: https://doi.org/10.14341/probl13223

TO CITE THIS ARTICLE:

Dudina MA, Savchenko AA, Dogadin SA, Borisov AG, Belenyuk VD. The features of regulatory T-blood cells subpopulation and the level of CD25 expression in patients with Graves' disease in dynamics after radioactive iodine therapy. Problems of Endocrinology. 2023;69(3):35-43. doi: https://doi.org/10.14341/probl13223

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Дудина М. А., Савченко А. А., Догадин С. А., Борисов А. Г., Беленюк В. Д.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Дудина М. А., Савченко А. А., Догадин С. А., Борисов А. Г., Беленюк В. Д.

THE FEATURES OF REGULATORY T-BLOOD CELLS SUBPOPULATION AND THE LEVEL OF CD25 EXPRESSION IN PATIENTS WITH GRAVES’ DISEASE IN DYNAMICS AFTER RADIOACTIVE IODINE THERAPY