CC BY
45
Последнее десятилетие XX века характеризуется значительным ростом заболеваемости сифилисом [13]. Особенности течения сифилиса обусловлены взаимодействием бледной трепонемы и макроорганизма человека, при этом основная роль по защите организма отводится иммунной системе [2, 10, 14, 15]. Исследование Т-В-клеточного звена иммунной системы при сифилисе дает порой разноречивые результаты [5, 8, 10, 14]. Вместе с тем все авторы отмечают некоторое снижение количества Т-клеток при увеличении уровня В-лимфоцитов [15]. Развивающееся у части больных после проведенной терапии состояние серологической резистентности также большинство исследователей связывают с изменениями в иммунном статусе ввиду присутствия бледной трепонемы [10,14].
В последние годы возник интерес к изучению состояния клеточных мембран иммунокомпетентных клеток при заболеваниях, связанных с изменением иммунных реакций [2, 3, 4]. В реализации иммунного ответа организма на внедрение бледной трепонемы участвуют три звена: макрофаги, Т-лимфоциты и В-лимфоциты. При этом, есть прямые основания предполагать взаимосвязь функциональной недостаточности иммунной системы с особенностями структуры мембран иммунокомпетентных клеток [7]. Вышесказанное определяет актуальность изучения вопроса патогенетической роли изменений, происходящих на уровне мембран лимфоцитов, при различных клинических вариантах сифилиса.
Цель настоящей работы - выявить структурно-функциональные изменения в мембранах иммунокомпетентных клеток в группах больных с вторичным сифилисом в стадии манифестации клинических проявлений, ранним скрытым сифилисом и у пациентов с серологической резистентностью после лечения.
Учитывая роль иммунных изменений в патогенезе стадийности сифилиса, может обсуждаться нестабильность морфо-функционального состояния области белок-липидного взаимодействия мембраны, что может приводить к преждевременной деструкции рецепторного аппарата и элиминации клеток из сосудистого русла [3,7].
Для экспериментального исследования клеточной мембраны мы использовали чувствительный и высокоинформативный метод флуоресцентных зондов. Моделью для изучения указанных характеристик мы выбрали мембрану лимфоцита как основную клетку адаптивного иммунитета.
Исследованы лимфоцитарные мембраны в трех группах: 1-я группа состояла из 15 пациентов вторичным сифилисом с клиническими проявлениями (МС) - папулезными сифилидами и розеолой в возрасте от 20 до 41 года (9 мужчин и 6 женщин). 2-я группа состояла из 15 пациентов ранним скрытым сифилисом (СС) от 18 до 39 лет (10 мужчин и 5 женщин). В обеих группах исследование проводилось до лечения. 3-я группа состояла из 18 пациентов с серологической резистентностью (СР) после лечения сифилиса в возрасте от 22 до 45 лет (9 мужчин и 9 женщин). Группа подбиралась с учётом отсутствия соматической патологии и перенесённых в анамнезе заболеваний (вирусного гепатита, туберкулеза, коллагенозов). Больные были консультированы невропатологом и окулистом, патологии не было обнаружено. Диагноз серологической резистентности устанавливался на основании стойкого отсутствия негативации клинико-серологических реакций (КСР) от 1 до 1,5 года. Контрольную группу составляли 15 здоровых лиц от 19 до 26 лет.
Мононуклеары выделяли из гепаринизированной крови с помощью центрофугирования в ступенчатом градиенте плотности фиколлвераграфин [6]. Биофизические характеристики выделенных клеток исследовали методами флуоресцентного зондирования [4] на спектрофлуориметре МРБ-4 («ШШеЫ») при комнатной температуре. Измерение проводилось в круглых кварцевых кюветах с длиной оптического пути 5 мм.
Определялись следующие параметры:
1. Излучение собственной беззондовой флуоресценции триптофановых остатков белков при длине волны возбуждения 284 нм и волны флуоресценции 334 нм - в единицах флуоресценции (ЕФ);
2. Исследование флуоресценции гидрофобного зонда пирена с определением текучести по отношению флуоресценция эксимеров/флуоресценция мономеров - в относительных единицах (ОЕ);
3. Погруженность мембранных белков в липидный бислой по коэффициенту индуктивно-резонансного переноса энергии в системе триптофанилы-пирен - в (ОЕ);
4. Оценка уровня восстановленных пиридиннуклеотидов (ВП) была основана на интенсивности их флуоресценции при 460-480 нм, а окисленных флавопротеинов (ОФ) - при 520-540 нм - в ЕФ. Вычислялось отношение ВП/ОФ.
Статистическую обработку данных проводили с использованием прикладной программы «81а11811еа-5». Для оценки статистической значимости различий в группах использован критерий Манна-Уитни.
Результаты флуоресцентного зондирования представлены в таблице 1.
Среди выявленных нами параметров изменений структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов можно выделить два направления изменений.
Первая группа параметров отражает наличие однонаправленных изменений в мембранах лимфоцитов у больных сифилисом во всех группах по отношению к контрольной. Согласно нашим исследованиям, к этим изменениям относится достоверное повышение текучести (снижение микровязкости) в глубоких слоях липидного бислоя
мембраны. Одновременно в основных группах была достоверно снижена флуоресценция триптофановых остатков мембранных белков по сравнению с контролем (табл. 1). Интересным представляется анализ соотношения липидной (определенной по флуоресценции пирена) и белковой (определенной по флуоресценции триптофанилов) составляющих мембран. Мы выявили достоверное повышение (р < 0,05) отношения как мономеров, так и эксимеров пирена к триптофанилам у больных сифилисом в группах с МС и СС по сравнению с контролем. В группе с СР прослеживается тенденция к повышению указанных параметров (таблица 1).
Вторая группа параметров отражает определённые различия в структуре мембран лимфоцитов между группами скрытого и манифестного течения сифилиса.
Результаты нашего исследования выявили значительные различия в степени погруженности мембранных белков в липидный бислой. Этот показатель был достоверно ниже (р < 0,01) у больных СР по сравнению с контролем, а также значительно ниже в группах МС и СС. Его снижение свидетельствует о более поверхностном расположении мембранных белков (рецепторных детерминант), что может делать их недоступными для связывания с антигеном. Это в свою очередь отражается в низкой функциональной активности лимфоцита, в снижении уровня межклеточной кооперации в целом и, вероятно, может играть значительную роль в сохранении персистирующей формы бледной трепонемы.
Указанные взаимоотношения подтверждаются при анализе энергетического потенциала лимфоцитов, прямо отражающего их функциональную активность. По нашим данным, у больных СР и СС достоверно снижена флуоресценция окисленных флавопротеидов (р < 0,05) при незначительном изменении у больных МС и в контрольной группе. Одновременно показатель энергетической активности клетки (отношение окисленных и восстановленных форм флавопротеинов и пиридиннуклеотидов) оказался достоверно ниже у больных СР (р < 0,05), а в группе больных МС - достоверно выше (р < 0,05) по отношению к контролю (рис. 2). В группе больных СС выявлена тенденция к снижению этого показателя (р > 0,05).
Энергетический обмен в мембране лимфоцита соответствует той функциональной нагрузке, которую она выполняет. Вероятно, при вторичном МС повышенный энергетический обмен клетки обусловлен более интенсивной антигенной стимуляцией, чем при СС и СР. Полученные результаты согласуются и с показателями фагоцитарного звена иммунитета [12]. Показатели низкой функциональной активности лимфоцитов в группах СС и СР со снижением микровязкости в глубоких слоях липидного слоя и изменениями белковой части мембраны говорят о схожести изменений на мембранном уровне у таких больных.
Таким образом, по совокупности вышеотмеченных данных у больных сифилисом имеет место повышение текучести (снижение микровязкости) липидов в глубоких областях липидного бислоя со снижением относительного содержания мембранных белков, что может индуцировать генерацию лейкотриенов и простогландинов [17], подавляющих, в свою очередь, продукцию интерлейки-на-1, являющегося неспецифическим маркером персистенции бледной трепонемы [10, 16]. Комплексная сравнительная оценка изменений в мембранах лимфоцитов с помощью флуоресцентных зондов при различных формах сифилиса выявила однонаправленность нарушений в их структурно-функциональном состоянии.
Одновременно нами выявлено уменьшение степени W погруженности рецепторно-белкового комплекса в липидный бислой мембраны лимфоцита у больных СР на фоне снижения функциональной энергетической активности клетки, что может приводить к созданию условий для персистенции бледной трепонемы в организме больного. В качестве одного из возможных механизмов формирования СР предложена гипотеза о патологии мембранно-рецепторного комплекса, в частности пространственно-ориентационного положения рецепторных белков.
Таблица1. Показатели структурно-функционального состояния мембран лимфоцитов у больных
сифилисом
№ Анализируемый показатель Контроль Манифестный сифилис (МС) Ранний скрытый сифилис (СС) Серорезис- тентный Достоверность различий
п=15(1) п = 15 (2) п=15(3) п=18(4)
1. Флуоресценция восстановленных 44 ± 7,6 28,1 ± 3,9 39Д ± 2,4 43,9 ± 7,8 Рг-4 < 0,05
2. Флуоресценция окисленных фл авопротеинов (ЕФ) - ОФ 29,5 ± 3,8 24,6 ±2,5 14,8 ±1,3 17,7 ± 1,2 ри,4<0,05
з. Отношение ОФ/ВП (ОЕ) 0,88 ± 0,14 1,0 ±0,12 0,76 ± 0,4 0,50 ± 0,06 Pi-2,4<0,05
4. Флуоресценция триптофановых остатков в белках мембран (ЕФ) 94,5 ± 10,8 41,5 ±4,7 59,6 ±4,8 57,2 ± 4,2 рн34< 0,001
5. Степень погруженности белков в липиды (ОЕ) 0,36 ±0,5 0,22 ±0,05 0,19 ± 0,04 0,13 ±0,05 Рм<0,05
6. Текучесть в глубоких слоях мембраны по флуоресценции пирена (ОЕ) 0,714 ± 0,058 0,903 ±0,033 0,884 ± 0,044 0,864 ± 0,032 Pi-2.3,4 <0,05
7. Отношение флуоресценции эксимеров пирена к триптофанилам (ОЕ) 0,728 + 0,116 1,853 ± 0,401 1,64 ± 0,36 1,17 ±0,21 pi-2,3 <0,05
8. Отношение флуоресценции мономеров пирена к триптофанилам (ОЕ) 0,84 ± 0,17 2,1 ± 0,44 1,95 ± 0,25 1,31 ±0,21 pi-2,3 < 0,05
Рис. 1. Отношение флуоресценции эксимеров пирена к мономерам РЭ/РМ (глубокая микровязкость липидного бислоя лимфоцита): 1 — контроль, 2 — вторичный манифестный, 3 — ранний скрытый, 4 — серорезистентный. - достоверные (р < 0,05) различия между контролем и больными.
12 3 4
Рис. 2. Отношение флуоресценции окисленных флавопротеинов восстановленных к коферментам ОФ/ВК (функциональная активность клетки):
1 — контроль, 2 — вторичный манифестный, 3 — ранний скрытый, 4 — серорезистентный. *- достоверные (р < 0,05) различия между контролем и больными.
1
/
0.4
0.35 0.3 > 0.25 0.2
■ 2
X
3
Рис. 3. Степень погруженности мембранных белков лимфоцита у больных сифилисом (Т1-Т2/Т1): 1 — контроль, 2 — вторичный манифестный, 3 — ранний скрытый, 4 — серорезистентный. * — достоверные (р < 0,05) различия между контролем и больными.
и.иэ <
м 3
