CC BY
50
№ 1 - 2013 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 616-006:612.57]-092.9:612.017.1
ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ ГУМОРАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ НА ФОНЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОПУХОЛЕВОГО РОСТА, ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ И ПРИ СОЧЕТАНИИ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА И ОБЩЕЙ ГИПЕРТЕРМИИ
И. А. Кривошапкин, А. В. Ефремов, Е. Н. Самсонова, М. Г. Пустоветова, О. Н. Логачева
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
В исследовании показано, что в раннем постгипертермическом периоде отмечается снижение CD20+ лимфоцитов и иммуноглобулинсекретирующей функции лимфоцитов с последующим повышением к 14-м суткам наблюдения. При экспериментальном опухолевом росте отмечалась волнообразная динамика исследуемых показателей с повышением к 3-м суткам наблюдения и последующем снижении. При сочетании гипертермии и опухолевого роста отмечалось менее выраженное подавление гуморального звена иммунной системы.
Ключевые слова: общая гипертермия, иммуноглобулины, циркулирующие иммунные комплексы, опухолевый рост.
Кривошапкин Иван Алексеевич — аспирант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон: 8 (383) 225-39-78, е-mail:
decoivan@yandex.ru
Ефремов Анатолий Васильевич — член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-39-78, е-mail: eav48@yandex.ru
Самсонова Елена Николаевна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая учебной частью кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-39-78, е-mail: Elena-samsonova@mail.ru
Пустоветова Мария Геннадьевна — доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии, заведующий ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, е-mail: patophisiolog@mail.ru
Логачева Ольга Николаевна — аспирант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», контактный телефон: 8 (383) 225-39-78, е-mail: Elena-samsonova@mail .т
Введение. В последние годы, благодаря успехам, достигнутым в области иммунологии и молекулярной генетики, и широкому использованию современных методов исследования, эволюционировали представления о взаимоотношении опухоли и иммунной системы организма [6]. Исследования последних лет показали, что рост большинства злокачественных опухолей сопровождается значительными нарушениями различных звеньев иммунного ответа организма. Проведенные исследования у онкологических больных указывают на снижение количества естественных киллеров, Т-хелперов, функциональной активности Т-лимфоцитов, увеличение Т-супрессоров и их функциональной активности, подавление гуморального звена иммунной системы. На протяжении многих лет вопрос о применении температурного фактора при лечении злокачественных опухолей оставался дискуссионным [5, 7]. Гипертермия уже
неоднократно привлекала внимание онкологов. Перегрев популяций злокачественных клеток резко увеличивает вероятность их гибели при воздействии лучевой и химиотерапии. Нагрев клетки до 39-40 °С резко ускоряет ее митогенетическую активность, увеличивая тем самым время нахождения клетки в состоянии митоза и вероятность ее поражения ионизирующим излучением. При более высоких температурах (41-42 °С) начинается процесс теплового разрушения внутриклеточных мембран тем более активный, чем выше температура. При гипертермическом воздействии в опухолевой ткани происходят сложные патофизиологические процессы: изменение кровотока, оксигенации, метаболического и энергетического статуса [2, 3, 4]. Среди клинически значимых эффектов искусственной гипертермии исследователей и практикующих врачей привлекает внимание способность вызывать положительные иммуномодулирующие эффекты. Имеются убедительные данные об усилении противоопухолевого действия интерферонов, фактора некроза опухоли, интерлейкина-2 [9, 10]. Все это послужило основанием для изучения влияния общей гипертермии (ОГ) на функциональное состояние иммунной системы в сочетании с опухолевым ростом.
Данное исследование посвящено анализу изменений показателей гуморального звена иммунной системы.
Материал и методы. Эксперименты проводились на 90 крысах-самцах линии Вистар весом 220-230 г. Для опыта использовались животные, содержавшиеся в условиях вивария. Уход и содержание экспериментальных животных были стандартными в соответствии с требованиями приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» от 06.04.1973 № 1045-73, а также № 1179 МЗ
СССР от 10.10.1983, № 267 МЗ РФ от 19.06. 2003, «Правилами по обращению,
содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденными МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципами Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996). Разогревание животных проводилось в соответствии со «Способом экспериментального моделирования ОГ у мелких лабораторных животных» [1]. Эксперимент проводился в несколько серий.
1-я серия. Все животные были однократно подвергнуты воздействию ОГ.
2-я серия. Экспериментальным животным перевивали только опухоль.
3-я серия. У животных данной группы на фоне экспериментального опухолевого роста применяли однократно ОГ.
Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker-256, поддерживаемый т у1уо (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносаркомы Walker-256 вводили животным в мышцу задней части бедра в дозе 1 х 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора №С1 [8]. Животных забивали методом декапитации под эфирным наркозом на 1,
3, 7, 14 и 21-е сутки после ОГ. В группу контроля вошли 7 интактных крыс этой же породы. В качестве материала исследования использовали периферическую кровь.
Исследование гуморального звена иммунной системы проводилось путем определения моноклональных антител (мАТ) к СD20+ антигенам в прямой или непрямой реакции иммунной флюоресценции с учетом результатов на проточном цитофотометре. Также определяли содержание ^ A, M и G-классов в сыворотке крови экспериментальных животных с применением моноспецифических сывороток против ^А, М и G. Расчет абсолютного значения иммуноглобулинов проводили по калибровочным графикам, построенным по одной серии антииммуноглобулинов (Горьковский институт НИИ эпидемиологии и эмбриологии).
Статистическую обработку результатов исследования осуществляли пакетом прикладных программ Ехе1 7,0 с использованием средней арифметической, ошибки средней, критерия Стьюдента. Различия принимались за достоверные при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. При анализе содержания CD20+ лимфоцитов в крови у экспериментальных животных на фоне экспериментального опухолевого роста, после применения ОГ и при сочетании опухолевого роста и ОГ были выявлены следующие изменения. У животных контрольной группы данный показатель составил 14,03 ± 1,36 %. У животных первой группы, подвергшихся воздействию только ОГ, в 1-е сутки наблюдения отмечалось снижение содержания CD20+ лимфоцитов в крови до 11,17 ± 1,05 %. На 3-и сутки постгипертермического периода изучаемый показатель
не отличался от контрольных значений, с 7-х по 14-е сутки наблюдения содержание CD20+ лимфоцитов в крови у животных данной группы превысило контрольные значения и составило 17,09 ± 1,77 и 16,74 ± 1,34 % соответственно. В группе животных с перевиваемой карциносаркомой отмечалось изменение содержания CD20+ лимфоцитов в крови на 3-и сутки наблюдения, когда данный показатель повысился и составил 18,17 ± 1,44 %. Затем содержание CD20+ лимфоцитов постепенно снижалось и к 14-м суткам составило 9,26 ± 0,79 %. В группе животных с карциносаркомой, подвергшихся
воздействию ОГ, изменение содержания CD20+ лимфоцитов крови отмечалось только на 14-и сутки наблюдения и составило 11,52 ± 0,88 %.
Содержание иммуноглобулина М в сыворотке крови у экспериментальных животных контрольной группы составило 0,78 ± 0,062 г/л (табл. 1). У животных, подвергшихся воздействию ОГ, на 1-е сутки постгипертермического периода отмечалось снижение изучаемого показателя на 25 %. К 3-м суткам наблюдения содержание иммуноглобулина М в сыворотке крови у животных данной группы восстановилось до контрольных значений. В период с 7-х по 14-е сутки после воздействия ОГ данный показатель превышал контрольные значения на 20-23 %.
Таблица 1
Динамика содержания иммуноглобулина М в сыворотке крови у экспериментальных животных на фоне экспериментального опухолевого роста после применения ОГ и при сочетании опухолевого роста и ОГ (г/л)
Сроки исследования Г ипертермия (М ± т) Опухолевый рост (М ± т) Г ипертермия + опухолевый рост (М ± т)
Контроль 0,78 ± 0,062
1-е сутки 0,55 ± 0,051* 0,94 ± 0,082* 0,58 ± 0,044*
3-и сутки 0,81 ± 0,064 1,11 ± 0,077* 0,91 ± 0,051*
7-е сутки 0,94 ± 0,078* 0,89 ± 0,084 0,88 ± 0,062
14-е сутки 1,02 ± 0,087* 0,64 ± 0,039* 0,73 ± 0,071
Примечание: * — обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля.
В группе животных с перевиваемой карциносаркомой в период с 1-х по 3-и сутки наблюдения отмечалось повышение содержания иммуноглобулина М в сыворотке крови. На 7-е сутки данный показатель не отличался от контрольных значений. К 14-м суткам наблюдения содержание иммуноглобулина М в сыворотке крови снизилось на 25 %. В группе животных с карциносаркомой, подвергшихся воздействию ОГ, на 1-е сутки постгипертермического периода отмечалось снижение содержания иммуноглобулина М в сыворотке крови экспериментальных животных до 0,58 ± 0,044 г/л. На 3-и сутки наблюдения данный показатель повысился на 24 %. С 7-х по 14-е сутки наблюдения содержание иммуноглобулина М в сыворотке крови не отличалось от контрольных значений.
В табл. 2 представлены данные о динамике содержания иммуноглобулина G в сыворотке крови у животных. Содержание иммуноглобулина G в сыворотке крови у экспериментальных животных контрольной группы составило 5,2 ± 0,39 г/л.
У животных, подвергшихся воздействию ОГ, на 1-е сутки постгипертермического периода отмечалось снижение изучаемого показателя на 20 %. К 3-м суткам наблюдения содержание иммуноглобулина G в сыворотке крови у экспериментальных животных восстановилось до контрольных значений. В период с 7-х по 14-е сутки после воздействия ОГ данный показатель превышал контрольные значения на 20-22%.
Таблица 2
Динамика содержания иммуноглобулина G в сыворотке крови у экспериментальных животных на фоне экспериментального опухолевого роста, после применения ОГ и при сочетании опухолевого роста и ОГ (г/л)
Сроки исследования Г ипертермия (М ± т) Опухолевый рост (М ± т) Г ипертермия + опухолевый рост (М ± т)
Контроль 5,2 ± 0,39
1-е сутки 3,92 ± 0,26* 5,44 ± 0,27 4,13 ± 0,32*
3-и сутки 4,41 ± 0,68 7,23 ± 0,63* 6,48 ± 0,51*
7-е сутки 6,75 ± 0,68* 5,31 ± 0,34 7,04 ± 0,53*
14-е сутки 7,12 ± 0,57* 3,94 ± 0,25* 4,88 ± 0,39
Примечание: * — обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля.
В группе животных с перевиваемой карциносаркомой на 1-е сутки наблюдения данный показатель не отличался от контрольных значений. На 3-и сутки отмечалось повышение содержания иммуноглобулина G в сыворотке крови до 7,23 ± 0,63 г/л. К 7-м суткам изучаемый показатель вернулся к контрольным значениям. На 14-е сутки наблюдения содержание иммуноглобулина G в сыворотке крови экспериментальных животных снизилось и составило 3,94 ± 0,25 г/л. В группе животных с карциносаркомой,
подвергшихся воздействию ОГ, на 1-е сутки постгипертермического периода отмечалось снижение содержания иммуноглобулина G в сыворотке крови экспериментальных животных до 4,13 ± 0,32 г/л. На 3-и сутки наблюдения данный показатель повысился на 25 % и составил 6,48 ± 0,51 г/л. На 7-е сутки наблюдения содержание
иммуноглобулина G в сыворотке крови продолжало повышаться и было равно 7,04 ±
0,53 г/л. К окончанию эксперимента изучаемый показатель вернулся к контрольным значениям.
Содержание иммуноглобулина А в сыворотке крови у экспериментальных животных контрольной группы составило 0,49 ± 0,031 г/л (табл. 3). У животных, подвергшихся воздействию ОГ, на 1-е сутки постгипертермического периода отмечалось снижение изучаемого показателя на 42 %. В остальные сроки наблюдения содержание иммуноглобулина А в сыворотке крови у экспериментальных животных не отличалось от контрольных значений.
Таблица 3
Динамика содержания иммуноглобулина А в сыворотке крови у экспериментальных животных на фоне экспериментального опухолевого роста, после применения ОГ и при сочетании опухолевого роста и ОГ (г/л)
Сроки исследования Г ипертермия (М ± т) Опухолевый рост (М ± т) Г ипертермия + опухолевый рост (М ± т)
Контроль 0,49 ± 0,031
1-е сутки 0,26 ± 0,019* 0,51 ± 0,029 0,42 ± 0,029
3-и сутки 0,41 ± 0,028 0,69 ± 0,042* 0,48 ± 0,034
7-е сутки 0,52 ± 0,039 0,43 ± 0,023 0,38 ± 0,031*
14-е сутки 0,45 ± 0,027 0,32 ± 0,019* 0,37 ± 0,028*
Примечание: * — обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля
В группе животных с перевиваемой карциносаркомой отмечалась волнообразная динамика изучаемого показателя: повышение содержания иммуноглобулина А
в сыворотке крови на 3-е сутки (0,69 ± 0,042 г/л) и снижение на 30 % к 14-м суткам (0,32 ±
0,019 г/л). В группе животных с карциносаркомой, подвергшихся воздействию ОГ, отмечалось снижение содержания иммуноглобулина А в сыворотке крови экспериментальных животных в период с 7-х суток (0,38 ± 0,031 г/л) по 14-е сутки (0,37 ±
0,028 г/л). В остальные сроки наблюдения содержание иммуноглобулина А в сыворотке крови не отличалось от контрольных значений.
Таким образом, воздействие ОГ на экспериментальных животных приводит к угнетению гуморального звена иммунной системы в раннем постгипертермическом периоде с последующим восстановлением и дальнейшим повышением
иммуноглобулинсекретирующей функции лимфоцитов. При экспериментальном опухолевом росте отмечалась волнообразная динамика исследуемых показателей с повышением к 3-м суткам наблюдения и последующем снижении. При сочетании гипертермии и опухолевого роста отмечалось менее выраженное подавление гуморального звена иммунной системы.
Список литературы
1. Пат. 2165105 Российская Федерация Способ экспериментального моделирования общей гипертермии у мелких лабораторных животных / Ефремов А. В., Пахомова Ю. В., Пахомов Е. А., Ибрагимов Р. Ш., Шорина Г. Н. ; опубл. 2001, Бюл. № 10.
2. Исмаил-заде Р. С. Использование общей управляемой гипертермии в лечении генерализованных опухолей у детей / Р. С. Исмаил-заде // Рос. онкол. журн. — 2004. — № 6. — С. 23-26.
3. Механизмы развития и пути преодоления химиорезистентности опухолей / О. К. Курпешов, А. Ф. Цыб, Ю. С. Мардынский, Б. А. Бердов // Рос. онкол. журнал. — 2003. — № 3. — С. 50-53.
4. Оборотова Н. А. Новые подходы к использованию термочувствительных липосом и локальной гипертермии / Н. А. Оборотова, Е. В. Тазина // Рос. биотерапевт. журн. — 2008. — № 4. — С. 71-79.
5. Пути практического использования интенсивного теплолечения (второе сообщение) / А. В. Сувернев, Г. В. Иванов, И. В. Василевич [и др.]. — Новосибирск : Академическое изд-во «Гео», 2009. — 109 с.
6. Тотолян А. А. Клетки иммунной системы / А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин. — СПб. : Наука, 2000. — 231 с.
7. Фрадкин С. З. Современное состояние гипертермической онкологии и тенденции ее развития / С. З. Фрадкин // Мед. новости. — 2004. — № 3. — С. 3-8.
8. Динамика опухолевого роста у крыс линии Brattleboro и Wag при введении разных доз карциносаркомы Walker-256 / И. И. Хегай, Н. А. Попова, Л. С. Ганилова [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2008. — Т. 145, № 1. — С. 88-90.
9. Chen S. C. Thermal regulation of lymphocyte trafficking : Hot spots of the immune response / S. C. Chen, S. S. Evans // Int. J. Hyperthermia. — 2005. — Vol. 21 (8). — P. 723-729.
10. Geehan D. M. Immunotherapy and whole-body hyperthermia as combined modality treatment of a subcutaneous murine sarcoma / D. M. Geehan, D. F. Fabian, A. T. Lefor // J. Surg. Oncol. — 1993. — Jul. — Vol. 53, N 3. — P. 180-3.
FEATURES OF THE STATE OF HUMORAL LINK OF IMMUNE SYSTEM AT EXPERIMENTAL ANIMALS AGAINST EXPERIMENTAL TUMORAL GROWTH, AFTER APPLICATION OF GENERAL HYPERTHERMIA AND AT THE COMBINATION OF TUMORAL GROWTH AND GENERAL HYPERTHER
I. A. Krivoshapkin, A. V. Efremov, E. N. Samsonova, M. G. Pustovetova, O. N. Logachyov
SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (c. Novosibirsk)
In the present research it is shown that the decrease of CD20+ lymphocytes and immunoglobulin secreting function of lymphocytes with subsequent increase by 14th days of supervision is registered in the early post-hyper thermal period. Wavy dynamics of studied indicators with increase by 3rd day of supervision and the subsequent decrease was pointed at experimental tumoral growth. Less expressed suppression of humoral link of immune system was noted at combination of hyperthermia and tumoral growth.
Keywords: general hyperthermia, immunoglobulins, circulating immune complexes, tumoral growth.
About authors:
Krivoshapkin Ivan Andreyevich — post-graduate student of physiopathology and clinical physiopathology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 8 (383) 225-39-78, e-mail: decoivan@yandex.ru
Efremov Anatoly Vasiliyevich — corresponding member of the RAMS, doctor of medical sciences, professor, head of pathological physiology and clinical physiology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 3(383) 225-39-78, e-mail: eav48@yandex.ru
Pustovetova Maria Gennadiyevna — doctor of medical sciences, professor of pathological physiology chair, head of Central research laboratory SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail:
patophi siolog@mail.ru
Samsonova Elena Nikolaevna — doctor of medical sciences, professor of pathological physiology and clinical physiology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 225-39-78, e-mail: Elena-samsonova@mail.ru
Logacheva Olga Nikolaevna — post-graduate student of physiopathology and clinical physiopathology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 8 (383) 225-39-78, e-mail: Elena-samsonova@mail.ru
List of the Literature:
1. Patent. 2165105 Russian Federation. Way of experimental modeling of the general hyperthermia at small laboratory animals / Efremov A. V, Pakhomova Y. V, Pakhomov E. A. Ibragimov R. S., Shorina G. N.; publ. 2001, Bulletin № 10.
2. Ismail back R. S. Use of the general operated hyperthermia at children/Ruble S. Ismail back//Grew in treatment of generalized tumors. онкол. журн. — 2004 . — No. 6. — Page 23-26.Исмаил-заде Р. С. Использование общей управляемой гипертермии в лечении генерализованных опухолей у детей / Р. С. Исмаил-заде // Рос. онкол. журн. — 2004. — № 6. — С. 23-26.
3. Mechanisms of development and way of overcoming of chemoresistance of tumors / O. K. Kurpeshov, A. F. Tsyb, Y. S. Mardynsky, B. A. Berdov // Rus. ocnol. journal. — 2003 . — № 3. — P. 50-53.
4. Oborotova N. A. New approaches to use of thermosensitive liposomes and local hyperthermia / N. A. Oborotova, E. V. Tazina//Rus. biotherapist. journ. — 2008 . — № 4. — P. 71-79.
5. Ways of practical use of intensive heattreatment (the second message) / A. V. Suvernev, G. V. Ivanov, I. V. Vasiliyevich [etc.]. — Novosibirsk: «Geo’s» academic publishing house, 2009. — 109 P.
6. Totolyan A. A. Cells of immune system / A. A. Totolyan, I. S. Phreydlin. — SPb. : Science, 2000. — 231 P.
7. Phradkin S. Z. Current state of hyper thermal oncology and tendency of its development /
S. Z. Fradkin // Medical news. — 2004. — № 3. — P. 3-8.
8. Dynamics of tumoral growth at rats of the Brattleboro and Wag line at introduction of different doses Walker-256 carcinosarcoma / I. I. Khegay, N. A. Popova, L. S. Ganilova [etc.] // Bulletin the experiment. biology and medicine. — 2008 . — V. 145, № 1. — P. 88-90.
9. Chen S. C. Thermal regulation of lymphocyte trafficking : Hot spots of the immune response / S. C. Chen, S. S. Evans // Int. J. Hyperthermia. — 2005. — Vol. 21 (8). — P. 723-729.
10. Geehan D. M. Immunotherapy and whole-body hyperthermia as combined modality treatment of a subcutaneous murine sarcoma / D. M. Geehan, D. F. Fabian, A. T. Lefor // J. Surg. Oncol. — 1993. — Jul. — Vol. 53, N 3. — Р. 180-3.
