CC BY
124
УДК 579
Д. О. Юдина, Н. Н. Митрофанова, В. Л. Мельников
ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА АЛЛОХТОННОЙ И АУТОХТОННОЙ МИКРОФЛОРЫ ВОД ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ
Аннотация. Проблема загрязнения окружающей среды - одна из актуальных проблем, влияющих на жизнедеятельность человека и других живых организмов.
Представлены результаты анализа микробиологического спектра водоемов в Пензенской области. Образцы вод тестировались на соответствие гигиеническим нормам по санитарно-микробиологическим показателям. Проведен качественный и количественный анализ по определению различных микроорганизмов - представителей аутохтонной и аллохтонной микрофлоры в водах Пензенской области различной категории.
Ключевые слова: аллохтонная микрофлора, аутохтонная микрофлора, водоем, инфекционные заболевания, микроорганизмы, кишечные инфекции.
Введение
На территории Пензенской области насчитывается более 3000 рек общей протяженностью около 15 458 км. В области насчитывается 240 озер, самый крупный водоем в регионе - Сурское водохранилище. Водохозяйственная система представлена прудами и водохранилищами, системами технического и хозяйственно-питьевого водоснабжения промышленных и коммунальных предприятий, системами очистки и сброса сточных вод, мелиоративными системами.
Для правильной оценки процессов самоочищения водоемов особенно важны регулярные санитарно-бактериологические исследования. За последние 6 лет санитарное состояние водоемов 1 категории оставалось нестабильным как по микробиологическим, так и по санитарно-химическим показателям.
На территории Пензенской области наблюдается нестабильность эпидемиологической ситуации по острой кишечной инфекции (ОКИ) - заболеваемость в 2014 г. составила 524,5 на 100 тыс. населения, имеется рост суммарной заболеваемости - на 17,1 % по отношению к 2013 г. Сравнительный анализ выявляет превышение среднероссийских показателей заболеваемости ОКИ на 10,2 % [1].
В возникновении эпидемий инфекционных заболеваний особая роль принадлежит водоемам. Заболевания могут возникать не только в результате использования загрязненной воды открытых водоемов для питьевых и хозяйственных целей, но и при использовании их в культурно-бытовых целях. Избежать появления эпидемий возможно только при постоянном санитарном надзоре за водоемами, расположенными в черте населенных пунктов [1-4].
Характер микрофлоры водоемов определяется особенностями конкретной водной среды. Микрофлору водоемов образуют две группы: аутохтонные (собственно водные) и аллохтонные (попадающие извне при загрязнении) микроорганизмы.
Аутохтонная микрофлора - совокупность микроорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде. Микробный состав воды напоминает микрофлору почвы, с которой вода соприкасается (придонные и прибрежные почвы).
В состав специфической водной микрофлоры входят Micrococcus candicans и M. roseus, Sarcina litea, Bacterium aquatilis communis, Pseudomonas fluorescens, различные виды Proteus и Leptospira. Среди анаэробов в незагрязненных водоемах выделяют Вacillus cereus, B. mycoides, Chromobacterium violaceum, виды Clostridium.
Аллохтонная микрофлора - совокупность микроорганизмов, случайно попавших в воду и сохраняющихся в ней сравнительно короткое время. Количественные соотношения микроорганизмов в открытых водоемах варьируются в широких пределах, что зависит от типа водоема, степени его загрязнения, смены метеорологических условий сезона и т.д.
В воде обитают все известные группы микробов, но наиболее существенный компонент населения водоемов - бактерии [5]. Возбудителями кишечных инфекций могут быть различные бактерии; наиболее важное значение среди них занимают бактерии из семейства Enterobacteriaceae (сальмонеллы, шигеллы, эшерихии, иерсинии, а также клебсиеллы) [6, 7]. Наиболее надежная профилактика инфекционных заболеваний - это ранняя и быстрая индикация загрязнения воды и исследование ее микрофлоры [1-4].
Цель работы - количественное и качественное исследование аутохтонной и ал-лохтонной микрофлоры вод Пензенской области и обоснование мероприятий по профилактике острых кишечных инфекций.
Объекты и методы исследования
В 2016 г. проводилось исследование проб воды по микробиологическим показателям.
В соответствии с требованиями СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод» об отсутствии патогенных микроорганизмов в местах водопользования, контроль воды осуществляется по определению бактерий рода Salmonella семейства Enterobacteriaceae и учету их отсутствия в 1000 мл.
Для проведения текущего контроля качества исследовались воды из колодца, родника в черте города Пензы, водопроводная, талая вода, а также пробы воды из сети «Ключ здоровья».
Изучение исследуемого материала проводилось с использованием микроскопического и бактериологического методов. Исследуемый материал изучался под микроскопом в мазках, окрашенных по Граму.
При использовании бактериологического метода первичный посев каждой категории воды проводился на следующие субстраты: мясо-пептонный агар (МПА), жел-точно-солевой агар (ЖСА) и среду Эндо.
Засеянные среды выдерживались в термостате в течение 24 ч при температуре 37 °С.
Выделение чистой культуры проводилось путем пересева выросших микроорганизмов в пробирки со скошенным агаром.
Для установления принадлежности бактерий к определенному роду, виду или разновидности определялись их биохимические свойства [3].
У стафилококков на желточно-солевом агаре определялось наличие факторов пато-генности - лецитиназы и коагулазы - в коагулазном тесте. Для его проведения засеяли изолированную колонию стафилококка в пробирку с 0,5 мл кроличьей плазмы, инкубировали в термостате при 35-37 °С до 24 ч. Образование сгустка в пробирке, не разрушающегося при встряхивании, говорит о положительном результате. Для проведения каталазного теста нанесли две капли 3 % перекиси водорода непосредственно на исследуемую колонию. Появление пузырьков свидетельствовало о выделении бактериями ка-талазы. Оксидазный тест проводили с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной реактивом для определения оксидазной активности, на поверхность которой петлей наносили бактериальную массу. Результат определялся как отрицательный. Тест на редукцию нитратов выявлял способность к восстановлению нитратов до нитритов. Для этого культуру микроорганизма засеяли в мясо-пептонный бульон, содержащий 0,2 % нитрата калия, инкубировали в термостате 72 ч, затем в опытную и контрольную пробирки добавили по 1 мл реактива с крахмалом. К этому раствору перед постановкой реакции добавили несколько капель 10 % раствора соляной кислоты. Темно-синее окрашивание говорит о положительном результате. Для определения способности образовы-
вать сероводород использовали узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные в 5 % растворе ацетата свинца. Культуру микроорганизма засеяли в питательную среду в пробирке, после чего индикаторную бумагу поместили в пробирку и закрепили пробкой. Почернение бумаги говорит о положительном результате.
Представители рода актиномицетов выращивались на желточно-солевом агаре. Наличие каталазы определялось с помощью каталазного теста. При постановке оксидаз-ного теста результаты были отрицательными. Уреазную активность определяли с помощью среды Кристенсена, на которую засевали исследуемую культуру и выращивали в термостате 4 сут при температуре 37 °С. Наличие уреазной активности определилось по покраснению среды.
Сарцины выращивались на мясо-пептонном агаре. При постановке теста на оксида-зу давали положительный результат. Также проводился тест на желатиназу. Для этого культуру микроорганизма засеяли уколом в столбик питательного бульона, содержащего 12 % желатины. После культивирования опытную и контрольную пробирки охладили под холодной водой и сделали заключение о наличии фермента.
На среде Эндо выращивалась E. coli. Для определения лактозы, каталазы использовались соответствующие тесты, давшие положительный результат. Для определения ок-сидазы и коагулазы применялись оксидазный и коагулазный тесты соответственно, показавшие отрицательные результаты. Тест для определения способности восстанавливать нитраты показал положительный результат. Для определения продукции бактериальной культурой индола применялся способ Мореля. Культуру засеяли в мясо-пептонный бульон и под пробку поместили фильтровальную бумагу, пропитанную щавелевой кислотой. Покраснение нижней части бумажки говорит о положительном результате.
Представители рода дифтероидов выращивались на мясо-пептонном агаре. Для определения цистиназной активности проводилась проба Пизу. Для этого в столбик питательного агара с циститом уколом засеяли исследуемую культуру. Посевы инкубировали при 37 °С 24 ч. Результаты учитывались как отрицательные. Уреазная активность при проведении соответствующего теста не проявлялась [3].
Результаты исследования
В процессе исследования образцы талой, водопроводной воды и воды из системы «Ключ здоровья» тестировались на соответствие гигиеническим нормам по санитарно-микробиологическим показателям.
В результате исследования установлено, что количество проб воды, в которых обнаружены микроорганизмы, составило 53,33 %.
В водопроводной воде в 33,33 % проб обнаружены микроорганизмы.
На среде МПА наблюдалось появление колоний в количестве 266 КОЭ/мл. Обнаружены колонии 1 типа, светло-желтого цвета, с ровными краями. При микроскопии составляющих колонию микроорганизмов были обнаружены грамположительные кокки, расположенные гроздьями. При биохимическом анализе ферментативной активности выделенных стафилококков у них выявлено наличие устойчивости к содержанию NaCl концентрацией от 5 до 10 %. Обнаружена высокая биохимическая активность: способность к восстановлению нитратов, выделение сероводорода, разложение мочевины, ферментация углеводов с образованием кислоты. Выделенные кокки являлись плазмо-коагулаза-отрицательными, каталаза-положительными, оксидаза-отрицательными. В результате анализа ферментативной активности идентифицирован S. epidermidis.
В ходе количественного анализа колодезной воды обнаружены микроорганизмы в 66,66 % проб.
После культивирования исследуемого материала на среде МПА наблюдалось появление колоний в количестве 69 КОЭ/мл. Обнаружены колонии двух типов. Для колоний 1 типа характерна белая окраска с губчатой структурой, вязкая консистенция, выпуклый центр и ровные края. Колонии 2 типа имеют желтую окраску, вязкую консистенцию и ворсинчатые края. При микроскопии мазков, окрашенных по методу Грама, были обнаружены стафилококки и неподвижные короткие Гр (+) палочки, не имеющие спор и расположенные беспорядочно. При изучении биохимических свойств выявлены Гр (+) палочки, не разлагающие мочевину, ферментирующие глюкозу и сахарозу без выделения газа; у них наблюдалось отсутствие цистиназной активности. По результатам анализа биохимической активности идентифицированы микроорганизмы, являющиеся представителями рода дифтероидов.
После культивирования исследуемого материала на среде Эндо на поверхности среды наблюдалось появление колоний в количестве 134 КОЭ/мл. Обнаружено наличие колоний 1 вида, S-типа, малиново-красных с металлическим блеском. При микроскопическом исследовании содержимого колоний были обнаружены грамотрицательные палочки, расположенные беспорядочно. При изучении биохимической активности Гр (—) палочки разлагали глюкозу, лактозу, маннит с выделением углекислого газа. Выделенные микроорганизмы не утилизировали цитрат, являлись оксидаза-отрицательными, ка-талаза-положительными; восстанавливали нитраты, образовывали индол. По результатам анализа ферментативной активности идентифицированы E. coli.
В пробах воды из системы «Ключ здоровья» рост микроорганизмов наблюдался в 100 % случаев. После культивирования на среде Эндо наблюдалось появление колоний в количестве 1 КОЭ/мл. Обнаружены колонии 1 типа, бледно-зеленого цвета, с пушистыми краями. При микроскопии исследуемого материала обнаружены участки мицелия, состоящие из гиф, окрашенных по Граму положительно. По характерному строению ко-нидиеносцев, напоминающих носик лейки, идентифицированы грибы Aspergillus spp.
При культивировании исследуемых проб воды из системы «Ключ здоровья» на среде МПА наблюдалось появление колоний в количестве 98 КОЭ/мл. Обнаружены колонии 1 типа, лимонно-желтые, с вязкой консистенцией, выпуклым центром и ровными краями.
При микроскопии содержимого колоний были обнаружены грампозитивные неподвижные бактерии шаровидной формы, расположенные в виде скоплений кубической формы.
При изучении биохимической активности грамположительные, кубовидно расположенные кокки не разлагали мочевину, разжижали желатин, являлись оксидаза-положительными. В их клетках обнаружено наличие пигмента каротина. Идентифицированы сарцины.
В результате микробиологического анализа талой воды в 66,66 % исследуемых проб обнаружены микроорганизмы трех видов. После культивирования на среде МПА наблюдалось появление колоний в количестве 208 КОЭ/мл. Обнаружены колонии 1 типа, светло-желтые, гладкие, с ровными краями и с вязкой консистенцией.
В результате анализа морфологических, тинкториальных и биохимических свойств идентифицирован S. epidermidis.
После культивирования на среде ЖСА наблюдалось появление колоний в количестве 32 КОЭ/мл. На поверхности среды обнаружены колонии двух типов: желтые, вязкие с выпуклым центром и бело-зеленые, губчатые, с неровными краями.
При микроскопии колоний 1 типа были обнаружены грампозитивные кокки, расположенные гроздьями. При изучении биохимической активности выделенных стафилококков у них обнаружено наличие лецитиназной активности и плазмокоагулазы. Идентифицирован S. aureus.
При микроскопическом исследовании колоний 2 типа были обнаружены неподвижные нитевидные грампозитивные бактерии. При анализе биохимических свойств Гр (+) нитевидных бактерий у них выявлено наличие ферментации маннозы, отсутствие ферментации маннита, наличие уреазной активности, наличие каталазы, отсутствие ок-сидазы. В результате идентифицированы представители рода актиномицетов.
В результате микробиологического анализа проб родниковой воды обнаружены микроорганизмы в 83,33 % исследуемых проб.
После культивирования проб родниковой воды на среде Эндо наблюдалось появление колоний в количестве 16 КОЭ/мл. Обнаружено наличие колоний двух типов. В результате изучения морфологических, тинкториальных и биохимических свойств выделенных микроорганизмов идентифицированы Aspergillus spp. и E. coli.
После культивирования исследуемых проб родниковой воды в среде ЖСА на поверхности питательной среды наблюдалось появление колоний в количестве 134 КОЭ/мл. Обнаружены колонии 1 типа, светло-желтые, вязкой консистенции, с ровными краями и выпуклым центром. Идентифицирован S. epidermidis.
Заключение
Санитарное состояние вод и водоемов в Пензенской области, являющихся источниками водопользования, остается в санитарно-эпидемиологическом отношении неудовлетворительным.
В пробах обнаруживаются представители аутохтонной и аллохтонной микрофлоры воды, относящиеся к родам стафилококков, эшерихий, актиномицетов, дифтероидов, сарцин и грибов рода аспергиллус. Данные микроорганизмы могут стать причиной вспышечной заболеваемости острыми кишечными инфекциями.
Выявлено, что особенностью водоносных горизонтов Пензенской области является присутствие бактерий, относящихся к видам S. epidermidis, E. coli, S. aureus, что приводит к подаче населению питьевой воды ненадлежащего качества.
Необходимо проводить профилактические мероприятия по улучшению санитарного состояния зон рекреации, а именно по их доведению до нормативных требований и дальнейшее проведение лабораторных исследований воды в соответствии с требованиями санитарных норм и правил.
Библиографический список
1. Материалы государственного доклада «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2014 году» по Пензенской области. - Пенза, 2015.
2. МУК 4.2.1884-04 «Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов». - М., 2005.
3. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М. О. Биргера. - 3-е изд., перераб. и доп. - М. : Медицина, 1982. - 464 с.
4. Кулагина, Г. М. Санитарно-эпидемиологические проблемы загрязнения водоемов / Г. М. Кулагина, О. Е. Фалова // Фундаментальные исследования. - 2004. - № 1. - С. 61-62. - URL: https://fundamental-research.ru
5. Микробиоценозы водоемов. - URL: http://nsau.edu.ru
6. Мельников, В. Л. Эпидемиологическая и клиническая характеристика ОКИ на территории Пензенской области / В. Л. Мельников, Н. Н. Митрофанова, Е. П. Балашова // Современные проблемы инфекционной патологии человека : сб. науч. тр. / Министерство здравоохранения Республики Беларусь, Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии ; под ред. Л. П. Титова. - Минск : ГУ РНМБ, 2012. — Вып. 6. - С. 61-65.
7. Сергевнин, В. И. Эпидемиологическое обследование очага острых кишечных инфекций с единичным заболеванием / В. И. Сергевнин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003. - № 5. - С. 77-81.
Юдина Дарья Олеговна, клинический интерн, кафедра «Микробиология, эпидемиология и инфекционные болезни», Пензенский государственный университет. E-mail: meidpgumi@yandex.ru
Митрофанова Наталья Николаевна, старший преподаватель, кафедра «Микробиология, эпидемиология и инфекционные болезни», Пензенский государственный университет. E-mail: meidpgumi@yandex.ru
Мельников Виктор Львович, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой «Микробиология, эпидемиология и инфекционные болезни», Пензенский государственный университет. E-mail: meidpgumi@yandex.ru
УДК 579 Юдина, Д. О.
Особенности состава аллохтонной и аутохтонной микрофлоры вод Пензенской области /
Д. О. Юдина, Н. Н. Митрофанова, В. Л. Мельников // Вестник Пензенского государственного университета. - 2017. - № 3 (17). - С. 33-38.
