CC BY
129
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 9 1
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616-006.446.8-036.11:577.21.088
13 2 13 13 3 13
B.А. Мисюрин' , А.Е. Лукина , A.B. Мисюрин' , Л.А. Кесаева' , E.H. Мисюрина , Ю.П. Финашутина' ,
13 13 4 3 5 6
И.Н. Солдатова ' , A.A. Крутое ' , И.В. Санникова , М.Н. Романова , В.А. Лапин , O.A. Рукавицын ,
6 7 7 8 8 8
C.B. Шаманский , Н.К. Хуажева , В.Л. Иванова , Н.В. Архипова , Ю.А. Лесная , О.В. Шитова , Е.А. Борисенкова9, Т.М. Толстокорая9, E.H. Голубева9, H.A. Бычкова9, H.A. Вопилина10,
И.И. Гущанская11, Г.Н. Михайлова11, А.Ю. Барышников1
ОСОБЕННОСТИ СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ PRAME И PML/RARA В ДЕБЮТЕ ОСТРОГО ПРОМИЕЛОЦИТАРНОГО ЛЕЙКОЗА
1ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. Москва; 2ФГБУ Гематологический научный центр МЗ РФ, Москва 3Медицинский центр «ГеноТехнология», Москва; 4БУЗВО «Воронежская областная клиническая больница №1», Воронеж 3ГБУЗ «Ярославская областная клиническая больница», Ярославль
6ФГКУ «Главный военный клинический госпиталь имени академика Н.Н.Бурденко», Москва
7ГБУЗ «Городская клиническая больница им. С.П. Боткина», Москва
8ГБУЗ «Городская клиническая больница №40», Москва
9ГБУЗ «Калужская областная клиническая больница №1», Калуга
10ГБУЗ «Тамбовская областная клиническая больница», Тамбов
11ГБУЗ «Брянская областная клиническая больница №1», Брянск
Контактная информация
Мисюрин Всеволод Андреевич, младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной химиотерапии НИИ ЭДиТО
адрес: 115478 Москва, Каширское ш., 24, тел. +7(985)436-3019 e-mail: vsevolod.misvurin@gmail.com
Статья поступила 15.01.2014, принята к печати 27.01.2014.
Резюме
Причиной развития ОПЛ является появление химерного онкогена РМЬ/ЯЛЯа, экспрессия которого наблюдается при данном заболевании во всех опухолевых клетках и используется в качестве молекулярного маркера для установления диагноза и определении минимальной остаточной болезни. Кроме того, при ОПЛ, так же, как и при многих других злокачественных новообразованиях, экспрессируется неспецифический онкомар-кер РЯЛМЕ, относящийся к группе канцер-тестис антигенов. В настоящей работе экспрессия гена РЯЛМЕ нами исследовалась у больных ОПЛ в сопоставлении с уровнем экспрессии гена РМЬ/ЯЛЯа, а также с данными о клиническом течении этого заболевания. Выяснилось, что в дебюте ОПЛ обязательно наблюдается коэкспрес-сия генов РЯЛМЕ и РМЬ/ЯЛЯа. По отношению уровня экспрессии гена РЯЛМЕ к РМЬ/ЯЛЯа в дебюте заболевания пациентов с ОПЛ можно разделить на две группы - с высоким и низким отношением РЯЛМЕ к РМЬ/ЯЛЯа. Больные ОПЛ, имевшие в дебюте низкое соотношение РЯЛМЕ к РМЬ/ЯЛЯа, были склонны к более раннему развитию рецидива, чем лица с высоким соотношением уровней экспрессии данных генов.
Ключевые слова: острый промиелоцитарный лейкоз, РЯЛМЕ, канцер-тестис гены, экспрессия генов.
13 2 13 13 3 13
V.A. Misyurin ' , A.E. Lukina , A.V. Misyurin ' , L.A. Kesaeva ' , E.N. Misyurina , Yu.P. Finashutina ' ,
12 72 A ^ S A
I.N. Soldatova ' , A.A. Krutov' , I.V. Sannikova , M.N. Rotanova , V.A. Lapin , O.A. Rukavitsyn ,
H / R R R
S. V. Shamanskiy , N.K. Huazheva , V.L. Ivanova , N.V. Arhipova , Y.A. Lesnaya , O.V. Shitova ,
O O Q O Ii)
E.A. Borisenkova , T.M. Tolstokoraya , E.N. Golubeva , N.A. Bychkova , N.A. Vopilina , I.I. Guschanskaya11, G.N. Mihaylova11, A.Yu. Baryshnikov1 A RATIO BETWEEN GENE EXPRESSION LEVELS OF PRAME AND PML/RARA AT THE ONSET OF ACUTE PROMYELOCYTIC LEUKEMIA AND CLINICAL FEATURES OF THE DISEASE
1FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow; 2FSBI Hematological Research Center, Moscow 3«GeneTechnology» LLC, Moscow; 4Regional Clinical Hospital №1, Voronezh 5Yaroslavl Regional Hospital, Yaroslavl
6Academician N.N. Burdenko Main Military Clinical Hospital, Moscow
7S.P. Botkin City Clinical Hospital, Moscow
8City Clinical Hospital № 40, Moscow
9Kaluga Regional Clinical Hospital №1, Kaluga
10Tambov Regional Hospital, Tambov
11Bryansk regional hospital №1, Bryansk
Abstract
An appearance of a chimeric oncogene PML/RARa is a reason of an APL. This molecular marker is used for diagnosis and minimal residual disease monitoring in patients with APL. PRAME gene related to a group of cancer-testis genes is expressed in APL and a lot of other malignancies. We studied the ratio between expression levels of genes PRAME and PML/RARa and compared it with a clinical data of patients with APL. According to this dividing there
№ 1/tom 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
10 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ...
were two groups of APL patients: with a high and low ratio respectively. Furthermore patients with a low ratio had had a leukemia relapse earlier than patients with the high ratio values. We suggest that the ratio between their expression levels accurately determines a risk of relapse. Key words: acute promyelocytic leukemia, PRAME, cancer-testis genes, gene expression. Введение Таким образом, при ОПЛ зрелый PML/RARa ингибирует активность генов, отвечающих за диффе-ОПЛ был выделен в качестве отдельного ва- ренцировку и блокирование онкогенных транскрип-рианта острого миелоидного лейкоза в 1957 г. ционных факторов, что приводит нарушению даль-шведским автором L.K. Hillestad, который описал нейшего созревания промиелоцитов, накоплению их в три клинических случая чрезвычайно агрессивного костном мозге, препятствует естественной гибели течения острого миелоидного лейкоза, окончив- клеток путем апоптоза. Основой лечения больных шихся фатально в течение нескольких недель. За- ОПЛ является комбинация ATRA с химиопрепарата-болевание характеризовалось склонностью к разви- ми (антрациклиновые- идарубицин, даунорубицин - с тию геморрагического диатеза, жизнеугрожающих цитарабином или без него). Специфичность воздейст-кровотечений, «казалось, это был наиболее злока- вия ATRA связана с тем, что последняя нарушает чественный вариант острого лейкоза». Во всех слу- связь PML/RARa с корепрессорами и снимает блок чаях в миелограмме среди лейкоцитов доминиро- клеточной дифференцировки [10]. ATRA входит в вали промиелоциты [13]. состав терапии на всех этапах лечения ОПЛ: в период Ключевым событием, позволившим прийти к индукции ремиссии, консолидации ремиссии и под-пониманию механизмов лейкемогенеза, стало от- держивающего лечения. Препаратом выбора в лече-крытие транслокации t(15,17), встречающейся у нии рецидивов ОПЛ является тиоксид мышьяка, спо-подавляющего большинства заболевших ОПЛ. собствующий деградации зрелого PML/RARa [8]. Данная перестройка приводит к формированию В отличие от хронического миелоидного гена PML/RARa, образованного из генов PML (ген лейкоза, демонстрирующего нарастающую рези-промиелоцитарного лейкоза) и RARa (ген рецепто- стентность к ингибиторами тирозинкиназы за счёт ра ретиноевой кислоты, тип а) [20]. Описаны три накопления мутаций [16; 17; 22-25], для ОПЛ ха-варианта точек разрыва в гене PML: bcr1, bcr2 и рактерна высокая геномная стабильность, что по-bcr3, определяющие длину транскрипта гена зволяет практически не менять тактику лечения в PML/RARa. Наличия любого из трёх вариантов пе- течение многих лет [26]. Однако состояние ремис-рестройки достаточно для трансформации клеток- сии остаётся временным, так как транс-ретиноевая предшественников миелоидного ряда и начала за- кислота не способна повлиять на процессы самооб-болевания, причём у каждого пациента может быть новления лейкемических стволовых клеток [15]. только один тип слияния генов PML и RARa [19]. Выявление опухолевого транскрипта PML/RARa Ретиноевая кислота участвует в разнообраз- методом ПЦР в клетках костного мозга/периферической ных регуляторных каскадах в качестве сигнальной крови больного является важнейшим критерием эффек-молекулы. В частности, с её помощью регулируют- тивности терапии у больных ОПЛ, а также чувствитель-ся процессы морфогенеза, клеточной дифференци- ным маркером факта развития рецидива [2; 3]. Молеку-ровки и самоподдержания стволовых клеток [14]. лярный рецидив, как правило, диагностируется на неБелок RARa -ядерный рецептор ретиноевой кисло- сколько недель раньше, чем клинический рецидив [3]. ты, он является финальным звеном в её сигнальных К факторам риска развития рецидива ОПЛ путях. В здоровой клетке RARa выполняет функ- относят: лейкоцитоз в дебюте заболевания и выяв-ции транскрипционного репрессора. ление экспрессии транскрипта гена PML/RARa по-С молекулой ДНК он связывается в точке, еле консолидирующей терапии [1]. Худший ответ содержащий мотив AGGTCA. В отсутствие своего на терапию ATRA при экспрессии в клетках паци-лиганда - ретиноевой кислоты, RARa связывает ента изоформы bcr3 белка PML/RARa связывают с молекулы корепрессоров, подавляя активацию меньшей чувствительностью опухолевых клеток к транскрипции. В случае присоединения к RARa ретиноидам [3; 7]. Учитывая, что в настоящий мо-ретиноевой кислоты корепрессор диссоциирует, и к мент в мире применяется тактика комбинированно-комплексу присоединяется коактиватор, запускаю- го лечения ОПЛ (ATRA+химиопрепараты), оче-щий транскрипцию гена [11]. видно, что механизмы резистентности к лечению В результате транслокации 15 и 17 хромосом при ОПЛ изучены недостаточно, возможно, необ-транскрибируется ген PML/RARa, кодирующий ходим поиск дополнительных факторов, опреде-химерный белок PML/RARa. Данный белок, вне ляющих прогноз заболевания. зависимости от точки разрыва, за счёт домена, об- Ген PRAME из группы канцер-тестис генов разованного полипептидной цепью RARa, сохраня- ранее рассматривался в качестве дополнительного ет способность связывать молекулу корепрессора и маркера для мониторинга МОБ при ОПЛ [21]. Спон-присоединяться к мотиву AGGTCA [9]. танная активация этого канцер-тестис гена, а воз-Таким образом, химерный белок сохраняет можно, и некоторых других, происходит в лейкеми-функцию подавления транскрипции генов, регули- ческой клетке из-за нарушений, которые вносит бе-руемых нативным белком RARa. лок PML/RARa в регуляцию экспрессии генов. Однако конформационные изменения, вы- Известно, что экспрессия гена PRAME при званные наличием в химерном белке фрагмента солидных опухолях напрямую связана с неблагопри-полипептидной цепи PML, приводят к потере спе- ятным прогнозом и снижением выживаемости боль-цифичности связывания с ДНК, и спектр репресси- ных. В процессе опухолевой прогрессии его уровень руемых генов расширяется [9]. В результате этого нарастает [18; 19]. При остром миелоидном лейкозе белок PML/RARa в отличие от RARa теряет спо- высокий уровень мРНК PRAME указывает на хоро-собность в присутствии ретиноевой кислоты раз- ший прогноз и длительный безрецидивный период рывать связь с корепрессорами и присоединять мо- [12]. Но на сегодняшний день понимание биологиче-лекулу коактиватора. ских причин данного феномена так и не достигнуто.
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 11 1
Согласно последним работам, при онкогема- «Ohkockphh-2-1Q», «Ohkockphh-2-2Q», «Ohkock-лологических расстройствах экспресссируются ге- phh-9Q» и «Ohkockphh-14Q» (ООО «ГеноТехноло-ны GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, гпя», Россия) для определения уровней экспрессии SEMG1, SPANXA и, SSX1, однако в литературе нет генов PML/RARa изотипа bcr1, PML/RARa изотипа никаких данных об исследовании профиля экспрес- bcr3, PRAME и контрольного гена ABL соответст-сии этих генов при ОПЛ. венно. Для определения уровня экспрессии генов В этом исследовании мы провели поиск экс- GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, прессии канцер-тестис генов GAGE1, NY-ESO-1, SPANXA1 и SSX1 использовался 2-кратный буфер MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и для ПЦР в реальном времени (ООО «ГеноТехноло-PRAME в образцах костного мозга пациентов со впер- гия», Россия). вые выявленным ОПЛ, не-М3 ОМЛ, лимфомой Ход- Системы праймеров и зондов для оценки жкина и неходжкинскими лимфомами. Большая ре- уровня экспрессии GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, ференсная группа была создана с целью сравнения PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1 были разра-ОПЛ с другими онкозаболеваниями по признаку на- ботаны на основании данных по геномным после-личия либо отсутствия экспрессии мРНК перечислен- довательностям, предоставленным on-line ресурсом ных выше генов. Помимо этого, мы определили нали- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Синтез специ-чие связи уровня экспрессии мРНК PRAME с клини- фических праймеров и зондов был заказан в компа-ческими проявлениями как у первичных пациентов с нии «ДНК-технология», Россия. ОПЛ, так и у лиц, достигших ремиссии. Данные о последовательностях праймеров и зондов представлены в табл. 1. Материалы и методы Результаты Исходным материалом исследования служили образцы костного мозга 90 взрослых пациентов Экспрессия генов PML/RARa, PRAME, с диагнозом ОПЛ. 30 пациентов наблюдалось нами GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD, с момента первичной постановки диагноза, остав- SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1 шиеся 60 в момент начала работы уже находились в В костном мозге у каждого из 30 пациентов, состоянии клинической ремиссии. Среди пациентов ещё не получивших специфического лечения ОПЛ, первой группы, наблюдавшихся нами с момента были обнаружены транскрипты химерного гена постановки диагноза, было 14 женщин и 16 мужчин PML/RARa и мРНК гена PRAME. в возрасте от 19 до 64 лет (медиана 28 лет). Во вто- Изотип bcr1 химерного гена был обнаружен рой группе больных, проходящих под нашим на- у 16 пациентов (53 % от общего числа пациентов), с блюдением мониторинг патологии, было 33 жен- медианным уровнем экспрессии относительно гена щины и 27 мужчин в возрасте от 20 до 72 (медиана ABL 353 % (разброс значений был от 230 % до 985 30) лет. Диагноз ОПЛ установлен в соответствии со %). У остальных 14 (46 %) первичных пациентов стандартными критериями. Лечение всех пациентов был выявлен тип перестройки гена bcr3, со средне-проводилось согласно протоколу итальянских ав- медианным уровнем экспрессии относительно кон-торов AIDA [1; 4]. Для получения проб отрица- трольного гена 107 % (при разбросе значений от 12 тельного контроля мы отобрали кровь у 15 здоро- до 482 %). вых доноров. Кроме этого, для формирования ре- У всех пациентов, находящихся в дебюте за-ференсной группы мы исследовали пробы костного болевания, в клетках костного мозга была обнару-мозга в дебюте заболевания: жена мРНК PRAME. Среднемедианный уровень ■ 65 пациентов с диагнозом ОМЛ (не М3- экспрессии PRAME для пациентов, имеющих перевариант); стройку в точке bcr1, составил 2,9 % (при наблю- ■ 9 пациентов с диагнозом экстранодаль- даемых значениях от 0,001 до 200 %). Для пациен-ная B-клеточная лимфома из клеток мар- тов с перестройкой bcr3 медиана уровня экспрессии гинальной зоны; гена PRAME составила 48,4 % (разброс значений от ■ 22 пациентов с диагнозом ДВККЛ; 0,5 до 460 %). ■ 9 пациентов с диагнозом ЛБ; Ни одна проба клеток костного мозга, полу- ■ 18 пациентов с диагнозом ЛХ; ченная от пациентов в дебюте заболевания, не со- ■ 9 пациентов с диагнозом ЛКМЗ; держала мРНК генов GAGE1, NY-ESO-1, MAGEA1, ■ 10 пациентов с диагнозом ПМВККЛ; PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и SSX1. ■ 22 пациентов с диагнозом ФЛ; В образцах костного мозга у 23% пациентов ■ и 35 пациентов с диагнозом Т-клеточная (15/64) из референсной группы была обнаружена лимфома. экспрессия гена PRAME. Все участники исследования были заранее Среднемедианное значение уровня экспрес-информированы и подписали бланки добровольно- сии этого гена составило 3,26 % (при разбросе по-го согласия. казаний от 0,2 до 141 %). Кроме того, в костном мозге некоторых пациентов с диагнозом ОМЛ (не Выделение матричной РНК М3-вариант) экспрессировались гены GAGE1, NY- и синтез комплиментарной ДНК ESO-1, MAGEA1, PASD, SCP1, SEMG1, SPANXA1 и Тотальная РНК из образцов крови и костного SSX1. С различной частотой и уровнем экспрессии мозга была выделена при помощи набора реактивов эти гены проявляли спонтанную активность и при «RNA-3KcrpaKT-1» (ООО «ГеноТехнология», Рос- других заболеваниях. сия). Этот же набор использовался для получения В крови здоровых доноров не было обнару-кДНК. Вся работа проводилось в полном согласии жено присутствия мРНК гена PML/RARa (изофор-с инструкцией, предложенной разработчиком. мы bcr1, bcr2 и bcr3), и не было выявлено никаких признаков экспрессии генов GAGE1, NY-ESO-1, Определение уровня экспрессии генов. MAGEA1, SCP1, SEMG1, SPANXA1, SSX1 и PRAME. Проведение реакции количественной ПЦР Данные об экспрессии всех генов представ-проходило с использованием наборов реактивов лены в табл. 2.
№ 1/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ОСОБЕННОСТИ СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ...
Таблица 1
Системы праймеров и зондов, разработанных для определения уровня экспрессии генов ОЛОБ1, МУ-ЕБО-1, МЛОЕЛ1, РЛББ, БСР1, БЕМ01, БРЛЫХЛ1 и ББХ1.
Ген Праймер/зонд Нуклеотидная последовательность, 5'-З'
GAGE1 «Прямой» праймер AGC TGC TCA GGA GGG AGA GGA T
«Обратный» праймер GGT GAC CCT GTT CCT GGC TA
Зонд R6G-CAT CTG CAG GTC AAG GGC CGA AGC CTG AA-BHQl
NY-ESO1 «Прямой» праймер TCT GAA GGA GTT CAC TGT GT
«Обратный» праймер AGA CAG GAG CTG ATG GAG AG
Зонд R6G-AAC ATA CTG ACT ATC CGA CTG ACT GCT GCA-BHQl
MAGEA1 «Прямой» праймер GAA GGA ACC TGA CCC AGG CT
«Обратный» праймер AAT CCT GTC CTC TGG GTT GG
Зонд R6G-TGT GAG GAG GCA AGG TTT TCA GGG GAC-BHQl
PASD «Прямой» праймер GTG GGA AAT GTT TGC ATT CT
«Обратный» праймер AGC TTC ATC ACT GAC TGC CT
Зонд R6G-TCA GCT CCT GCA GCA ACT TTA CAC TTC-BHQl
SCP1 «Прямой» праймер AAA AGG AAC AGA ACA AGA AC
«Обратный» праймер TGT GGT AAT GGC AGT TAA CT
Зонд R6G-CCA AGC CAG AGA GAA AGA AGT ACA TGA TTT-BHQl
SEMG1 «Прямой» праймер TCC TCA TCT TGG AGA AGC AA
«Обратный» праймер TGG GAA AAT TCA CTT GGT AA
Зонд R6G-ATG GGA CAA AAA GGT GGA TCA AAA GGC C-BHQl
SPANXA1 «Прямой» праймер GAG GAG CGT CCC CTG TGA TT
«Обратный» праймер AGC AGG TTG CGG GTC TGA GT
Зонд R6G-AGG CCA ACG AGA TGA TGC CGG AGA CCC CAA-BHQl
SSX1 «Прямой» праймер GTA TAT GAA GAG AAA CTA TAA GG
«Обратный» праймер TAT TAC ACA TGA AAG GTG GG
Зонд R6G-ATG ACT AAA CTA GGT TTC AAA GTC ACC-BHQl
Коэкспрессия генов PRAME и PML/RARa и риск развития рецидива
Начиная с момента установки диагноза, в течение 18 месяцев проводилось наблюдение за пациентами. Установлено, что пациенты, имевшие хромосомную перестройку в точке bcrl, достигали морфологической и молекулярной ремиссии в среднем на 35 день от начала терапии по протоколу AIDA. При экспрессии изоформы bcr3 химерного гена констатация костномозговой и молекулярной ремиссии происходила в среднем через 40 дней с момента начала терапии. Для каждого пациента было рассчитано соотношение уровня экспрессии генов PRAME и PML/RARa. В качестве граничного значения мы выбрали уровень соотношения равным 0,05, и разделили всех пациентов на четыре субгруппы (рис. 1).
Мы сопоставили соотношение уровня экспрессии PRAME к PML/RARa со временем развития клинического рецидива заболевания (рис. 2). Наибольшая частота развития рецидивов наблюдалась у пациентов, экспрессирующих изотип bcr3 гена PML/RARa и значением соотношения уровня экспрессии гена PRAME к гену PML/RARa находящимся ниже 0,05. В этой группе из 6 человек у половины развился рецидив (p=0,0231). Что же касается пациентов, имеющих хромосомную перестройку в точке bcrl, то среди них наблюдался всего один случай рецидива. У этого пациента из группы PML/RARa bcr1+ отношение уровня экспрессии гена PRAME к химерному гену было ниже 0,05.
Тестирование уровня экспрессии PRAME
и транскриптов PML/RARa
для проведения мониторинга МОБ при ОПЛ
Кроме данных 30 пациентов, рассмотренных выше, в наше исследование были включены образцы костного мозга 60 больных с диагнозом ОПЛ, проходящих мониторинг МОБ. Время наблюдения пациентов из этой группы составило в среднем 9 мес, в течение которых у четверых развили клинический рецидив. Изотип bcr3 гена PML/RARa экс-
прессировался у пяти пациентов. У оставшихся трёх химерный ген сформировался в точке Ьсг1.
С момента обнаружения молекулярного рецидива до момента выявления костно-мозгового рецидива проходило в среднем 3 мес. При выявлении экспрессии транскрипта PML/RARa констатировался молекулярный рецидив (п=8). Ни в одном из этих образцов мы не наблюдали экспрессии гена PRAME. Его мРНК появлялась в пробе костного мозг только в тот момент, когда рецидив проявлялся уже клинически. Не было зафиксировано экспрессии PRAME в PML/RЛRa - отрицательных пробах.
Динамика коэкспрессии гена РЯАМЕ
и транскриптов РМЬ/ЯАЯа
Исследования образцов, полученных при мониторинге ОПЛ, показали, что изменение соотношение количества матричной РНК гена PRAME и химерного PML/RЛRa различаются между началом заболевания и рецидивом. Все четыре пациента, имевшие рецидивы за время нашего наблюдения, в дебюте заболевания имели показатель отношения уровней экспрессии двух генов ниже 0,05. В момент обнаружения костно-мозгового рецидива это соотношение менялось, и у всех четверых превысило 0,05. Наблюдаемое изменение этого соотношения было вызвано повышением относительного уровня экспрессии PRAME. Это указывает на приобретение лейкемической клеткой в стадии рецидива новых качеств по сравнению с теми, что обладал злокачественный клон в начале заболевания.
Обсуждение
Уже много лет подряд в литературе накапливаются сведения о том, что экспрессия гена PRAME, участвующего в процессе сперматогенеза, в случаях солидных опухолей говорит об агрессивном характере необластического процесса и о снижении выживаемости больных [6].
№ 1/том 13/2G14
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
1 2014.¡ndd 12
03.03.2014 15:10:54
#
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 2
Экспрессия генов при различных онкогематологических заболеваниях
Гены
Материал PAn.-R.iRa (bcrl) PML-RiRa (bcrl) PRAME GAGE1 NY-ESO-1 MAGE AI PASD SCP1 SEMG1 SPANXA1 SSX1
диагноз» & @ & @ & @ & @ & @ & @ & @ & @ & @ & @ & @
JK s ОПЛ транскрипт bcrl К п= 16 100 353 - - 100 2,9 - - - - - - - - - - - - - - - -
транскрипт ЬсгЗ о п= 14 - - 100 107 100 48,4 - - - - - - - - - - - - - - - -
cä M <U r не-МЗ ОМЛ с п = 65 - - - - 23 3,3 12 0,9 11 1,23 1,5 5,8 6 0,16 11 0,34 22 37 21 15 5 1
MALT т п = 9 - - - - 11 141 - - - - - - - - 11 0.17 11 16.5 - - - -
о Ю ДВККЛ H п = 22 - - - - - - 13.5 1.46 9 1.45 - - - - 4 0.04 13.5 23.91 13.5 14 4 0.02
га « СЗ S о ЛБ ы п = 9 - - - - 22 0.34 - - - - - - - - - - 22 43 11 1.2 - -
3 G G & 1-4 ЛХ й п= 18 - - - - 22 2 5 1,8 22 0,2 - - il 0,3 5 0,1 28 21 17 1 5 0,1
S M ЛКМЗ M п = 9 - - - - 44 15 33 0.5 22 1.4 - - - - 11 0.3 66 34 44 15 11 0.1
t=! ПМВККЛ о п= 10 - - - - 30 7 30 0.9 - - - - - - - - 20 90 10 0.1 - -
ФЛ 3 п = 22 - - - - 19 0.2 - - 13.5 0.9 - - 9 0.1 4.5 0.1 23 80 4.5 0.5 9 0.1
Т-кл. г п = 35 - - - - 20 10 11,5 1 6 0,1 - - 11,5 0,4 23 0,3 17 24 17 5 14 0,2
Доноры Периферическая кровь 11= 15 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
#В случае ОПЛ указан тип экспрессируемого транскрипта РМЬ-ЯАЯя. Знаком «-» обозначена группа здоровых доноров ВВ - Встречаемость внутри @Уровень экспрессии, медиана, % & ВВ группы, %
PRAMEI PML-RARa (bcrl)
PRAME / PML-RARa (ЬсгЗ)
550%
E 500%
§ 450%
g 400%
§ 350%
Ё 300%
S 250%
Û 200%
0
=" 150%
1 100%
= 50%
Ü
5 0
f
275% 250% 225% 200% 175% 150% 125% 100% 75% 50% 25% 0
T
X
Уровень экспресаш PML-RARa
□ Уровень экспресаш PRAME
Рис. 1. Соотношение уровней экспрессии тепа PRAME к изоформам гена PML-RARa:
1 - PRAME / PML-RARa (bcrl) > 0,05;
2 - PRAME / PML-RARa (bcrl) < 0,05;
3 - PRAME / PML-RARa (ЬсгЗ) > 0,05;
4 - PRAME / PML-RARa (ЬсгЗ) < 0,05.
1.
2.
№ 1/том 13/2014
российский биотерапевтическии журнал
ф
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ОСОБЕННОСТИ СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ..
Транскрипт Ьсг1
Транскрипт ЬсгЗ
1,0 0,8 -0,60.4
о,г -
п -4
РЙДМе/Р-Яа(Ьсг11 ¿0,05; л = 11
1,0
0,80,60,40,2 -
Т 12
15
18
Т 21
—+н------
РКдмЕ/р-на(Ьсгз}>0,05 П =8
++-
РНДМЕ/Р-На(ЬсГЗ) <0,05 л = 6 I
1
12
~г
15
~г
13
т
21
Месяцы
Месяцы
Рис. 2. Зависимость времени развития рецидива ОПЛ от соотношения уровней экспрессии генов РЯЛМЕ и различных изоформ гена РМЬ—ЯЛЯа в дебюте заболевания.
Но при рассмотрении острых миелоидных лейкозов, и особенно, острого промиелоцитарного лейкоза, отметили, что активность этого гена, а именно - количественная характеристика его экспрессии, каким-то образом связана с более благоприятным исходом болезни [5].
В настоящее время информация о связи РЯЛМЕ с регуляторными путями клетки неполна. По этой причине можно только приближённо судить о вероятной причине положительного влияния этого маркера на прогноз заболевания при ОПЛ. Возможно, имеет место эффект участия белка РЯЛМЕ в метаболизме ретиноевой кислоты: клетки, в которых происходит его синтез, очень чувствительны к воздействию ретиноидов [6].
Указано, что белок РЯЛМЕ способен связываться с комплексом ЯЛЯа. Мы предполагаем, что при связывании РЯЛМЕ конкурирует с другими молекулами репрессоров транскрипции. И чем больше молекул белка РЯЛМЕ внутри клетки, тем сильнее может быть выражен эффект конкуренции. В результате лейкемическая клетка становится более чувствительной к терапии ретиноидами.
В работе 8аШ:ашаг1а е! а1. [21] для определения количественной характеристики уровня экспрессии гена РЯЛМЕ использовался метод ДДСТ, не отличающийся высокой точностью.
Используя специфические праймеры и зонды, мы не смогли обнаружить следы мРНК в клетках крови здоровых доноров, хотя 8аШ:ашаг1а е1 а1. сообщают, что им это удалось. Для создания надёжного положительного контроля мы использовали материалы большой референсной группы, и показали, что лишь у немногих больных, несмотря на онкогематологические расстройства, в кроветворной ткани происходит активация РЯЛМЕ.
При гематологических, а также солидных опухолях не было показано облигатной (у всех пациентов) экспрессии РЯЛМЕ опухолевыми клетками в дебюте или в рецидиве заболевания.
Даже в случае меланомы данный маркер наблюдается только у 88 % пациентов. 8аШатапа е! а1, изучая профиль экспрессии генов при ОПЛ, смогли показать, что РЯЛМЕ проявляет активность в дебюте заболевания у многих, но всё же не у всех пациентов.
Нами впервые показано, что при ОПЛ активация экспрессии гена РЯЛМЕ происходит с момента начала заболевания, что было характерно для всех рассмотренных нами случаев.
С другой стороны, нам не удалось подтвердить преимущество использования РЯЛМЕ как маркера для мониторинга МОБ при ОПЛ. Вероятная причина более раннего выявления изоформ гена РМЬ/ЯЛЯа связана с тем, что химерный ген экспрессируется на более высоком уровне. В связи с этим он практически всегда преодолевал порог чувствительности метода существенно раньше, чем транскрипты гена РЯЛМЕ. Использование этого нового маркера для мониторинга МОБ возможно, но только в качестве дополнительного. 8аШ:ашапа е! а1. в своей работе указывали на то, что мРНК РЯЛМЕ детектировалась за полгода до клинического развития рецидива. Однако они добавили, что в некоторых случаях результат оказывался ложноот-рицательным, что показывает невысокую надёжность использования метода ДДСТ.
В отличие от 8аШашаг1а е! а1., мы показали, как коэкспрессия генов РМЬ/ЯЛЯа и РЯЛМЕ влияет на прогноз заболевания. Наш результат не противоречит классическим исследованиям, в которых было установлено, что изотип ЬсгЗ связан с наихудшем прогнозом при ОПЛ [3; 7]. Мы можем добавить, что в действительности худший прогноз определяется количественным отношением РЯЛМЕ к РМЬ/ЯЛЯа изотипа ЬсгЗ. Таким образом, определение соотношения экспрессии РЯЛМЕ к РМЬ/ЯЛЯа поможет более эффективно выявить группу риска больных ОПЛ.
У больных ОПЛ в дебюте заболевания не происходило экспрессии других канцер-тестис генов, а именно: ОЛОЕ1, Ш-ЕБО-1, МЛОЕЛ1, РЛББ, БСР1, БЕМС1, БРЛЫХЛ1 и ББХ1. Но мРНК каждого из этих генов хотя бы несколько раз была обнаружена у пациентов референсной группы. Как сообщали ранее, трансформированные кроветворные клетки, имеющие перестройку !(15;17), отличаются своей генетической стабильностью [21]. Согласно этому предположению мы считаем, что при ОПЛ в трансформированной клетке не происходить инактивации репрессоров транскрипции канцер-тестис генов. Наблюдение экспрессии гена РЯЛМЕ в 100% случаях первичного ОПЛ говорит о том, что его активация практически неизбежна при появлении в клетке зрелого белка РМЬ/ЯЛЯа любой изоформы. Разницу в количественном соотношении кодируемых этими генами транскриптов мы объяснить не можем, но считаем, что регуляторный каскад, связавший эти два гена, достаточно специфичен и выполняет свои функции в здоровой клетке.
№ 1/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
14
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Заключение
РЯЛМЕ не экспрессируется в здоровых тканях за исключением немногочисленных иммуно-привелегированных областей. Параметры экспрессии этого представителя КТГ в дебюте ОПЛ имеют
прогностическое значение. Тотальная активность гена РЯЛМЕ при остром промиелоцитарном лейкозе даёт надежду на то, что в будущем больные смогут достигать полного излечения за счёт комбинации химиотерапии и специфической иммунотерапии, направленной против РЯЛМЕ клеток.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АТРА (ATRA) МОБ ОПЛ/APL ПЦР (PCR)
- полностью транс-ретиноевая кислота (all transretinoid acid)
- минимальная остаточная болезнь
- острый промиелоцитарный лейкоз/acute promyelocytic leukemia
- полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)
Лимфомы
ЛБ
ДВККЛ ЛКМЗ
пмвккл лх
ФЛ
■ лимфома Бёркитта
■ диффузная B-крупноклеточная лимфома
■ лимфома из клеток мантийной зоны
■ первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома
■ лимфома Ходжкина
■ фолликулярная лимфома
Гены
PRAME - Preferentially Expressed Antigen of Melanoma in Cancer
Литература
1. Паровичникова E.H., Троицкая В.В., Соколов А.Н. и др. Лечение взрослых больных острым промие-лоцитарным лейкозом по протоколу AIDA // Терапевтический архив. - 2013. - №7. - С. 10-7.
2. Шуравина Е.Н. Мисюрин А.В. Савченко В.Г. Молекулярный мониторинг PML/RARa у больных острым промиелоцитарным лейкозом // Проблемы гематологии и переливания крови. - 2003. - № 2. - С. 62.
3. Шуравина Е.Н., Паравичникова Е.Н., Демидова И.А. и др. Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных острым промиелоцитарным лейкозом // Тер. Архив. - 2006. - 78(7). - 25-31.
4. Avvisati G., Lo Coco F., Diverio D. et al. AIDA (all-trans retinoic acid + idarubicin) in newly diagnosed acute promyelocytic leukemia: a Gruppo Italiano Malattie Ematologiche Maligne dell'Adulto (GIMEMA) pilot study // Blood. - 1996. - 88(4). - P. 1390-8.
5. Bullinger L., Dohner K., Bair E. et al. Use of gene-expression profiling to identify prognostic subclasses in adult acute myeloid leukemia // N. Engl. J. Med. - 2004. - 350. - P. 1605-16.
6. Bullinger L., Schlenk R.F., Gotz M. et al. PRAME-induced inhibition of retinoic acid receptor signaling-mediated differentiation--a possible target for ATRA response in AML without t(15;17) // Clin Cancer Res. - 2013. - 19(9). - P. 2562-71.
7. Castro-Mujica Mdel C., Sullcahuamin-Allende Y. Molecular subtypes of PML/RARa in patients with acute promyelocytic leukemia // Rev. Peru. Med. Exp. Salud. Publica. - 2013. - 30(1). - P. 37-40.
8. Chen S.J., Zhou G.B., ZhangX.W. et al. From an old remedy to a magic bullet: molecular mechanisms underlying the therapeutic effects of arsenic in fighting leukemia // Blood. - 2011. - 117(24). - P. 6425-37.
9. de The H., Lavau C., Marchio A. et al. The PML-RAR alpha fusion mRNA generated by the t(15;17) translocation in acute promyelocytic leukemia encodes a functionally altered RAR // Cell. - 1991 - 66(4). - P. 675-84.
10. Degos L., Dombret H., Chomienne C. et al. All-trans retinoic acid as a differentiating agent in the treatment of acute promyelocytic leukemia // Blood. - 1995. - 85(10). - P. 2643-53.
№ 1/tom 13/2014 РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ОСОБЕННОСТИ СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ...
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Farboud B., Hauksdottir H., Wu Y., Privalsky M.L. Isotyperestricted corepressor recruitment: a constitu-tively closed helix 12 conformation in retinoic acid receptors beta and gamma interferes with corepressor recruitment and prevents transcriptional repression // Mol Cell Biol. - 2003. - 23(8). - P. 2844-58. Greiner J., Schmitt M., Li L. et al. Expression of tumor-associated antigens in acute myeloid leukemia: implications for specific immunotherapeutic approaches // Blood. - 2006. - 108. - P. 4109-17. HillestadL.K. Acute promyelocytic leukemia // Acta. Med. Scand. - 1957. - 159(3). - P. 189-94. Kastner P., Lawrence H.J., Waltzinger C. et al. Positive and negative regulation of granulopoiesis by endogenous RARalpha // Blood. - 2001. - 97(5). - P. 1314- 20.
Kogan S.C. Curing APL: Differentiation or destruction? // Cancer Cell. - 2009. - 15(1). - P. 7-8. Kremenetskaya O.S., Logacheva N.P., Baryshnikov A.Y. et al. Distinct effects of various p53 mutants on differentiation and viability of human K562 leukemia cells // Oncology Research. - 1997. - 9. - P. 155-66. Michor F., Hughes T.P., Iwasa Y. et al. Dynamics of chronic myeloid leukaemia // Nature. - 2005. -435(7046) - P. 1267-70.
Neumann E., Engelsberg A., Decker J. et al. Heterogeneous expression of the tumor-associated antigens RAGE-1, PRAME, and glycoprotein 75 in human renal cell carcinoma: candidates for T-cell-based immunotherapies? // Cancer. Res. - 1998. - 58(18). - P. 4090-5.
Oberthuer A. Hero B. Spitz R. et al. The tumor-associated antigen PRAME is universally expressed in high-stage neuroblastoma and associated with poor outcome // Clin. Cancer. Res. - 2004. - 10(13). - P. 4307-13. Pandolf P.P., Alcalay M., Fagioli M. et al. Genomic variability and alternative splicing generate multiple PML/RAR alpha transcripts that encode aberrant PML proteins and PML/RAR alpha isoforms in acute promyelocytic leukaemia // EMBO J. - 1992. - 11(4). - P. 1397-407.
Santamaria C., Chillón M.C., García-Sanz R. et al. The relevance of preferentially expressed antigen of melanoma (PRAME) as a marker of disease activity and prognosis in acute promyelocytic leukemia // Haematologica. - 2008. - 93(12). - P. 1797-805.
Stavrovskaya A.A., Sedyakhina N.P., Stromskaya T. et al. Prognastic value of P-glicoprotein and correlation with CD34 antigen // British J. Heamatology. - 1998. - 28(5-6). - C. 469-82.
Turkina A.G., Baryshnikov A.Y., Sedyakhina N.P. et al. Studies of P-glycoprotein in chronic myelogenou-sleukaemia patients: Expression, activity and correlations with CD34 antigen// British Journal of Haematol-ogy. - 1996. - 92. - P. 88-96.
Turkina A.G., Zabotina T.N., Kusnetzov S.V. et al. Studies of some mechanisms of drug resistence in chronic myeloid leukemia (CML)// Advances in Experimental Medicine and Biology. - 1999. - 457. - P. 477-88. Turkina A.G., Logacheva N.P., Stromskaya T.P. et al. Studies of some mechanisms of drug resistance in chronic myeloid leukemia (CML) / Book Editor(s): Kaspers, GJL; Pieters, R; Veerman, AJP. Conference: 3rd International Symposium on Durg Resistance in Leukemia and Lymphoma Location: Amsterdam, Netherlands, mar 04-07, 1998.Drug resistance in leukemia and lymphoma III Book Series. Welch T.J., Link D.C., Miller C.A. et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia // Cell. - 2012. - 150(2). - P. 264-78.
№ 1/tom 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
