CC BY
104
34
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
УДК 547.944/945
ОСОБЕННОСТИ СОДЕРЖАНИЯ ТЕРПЕНОВЫХ ИНДОЛЬНЫХ АЛКАЛОИДОВ
В КУЛЬТИВИРУЕМОМ В ИСКУССТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
CA THARANTHUS ROSEUS
С. Н. Ромашко
ассистент кафедры физиологии и биохимии растений БГУ
A. В. Янцевич
кандидат химических наук, заведующий лабораторией инженерии белка ГНУ «Ин-та биоорганической химии НАН Беларуси»
О. В. Молчан
кандидат биологических наук, доцент,
доцент кафедры физиологии и биохимии растений БГУ
B. М. Юрин
доктор биологических наук, профессор,
профессор кафедры физиологии и биохимии растений БГУ
В данной работе проведен качественный анализ терпеновых индольных алкалоидов, содержащихся в листьях и корнях Catharanthus roseus, культивируемого в искусственных условиях. Выявлены особенности накопления непосредственных предшественников
фармакологически ценных бис-индольных алкалоидов (виндолина и катарантина) в различных органах указанного растения. Установлено, что в корневой системе Catharanthus roseus содержится значительное количество бис-индольных алкалоидов.
Введение
Catharanthus roseus, принадлежащий к сем. Apocynaceae, является одним из ценных лекарственных растений, в котором содержатся терпеновые моно- и бис-индольные алкалоиды. Наибольший интерес представляют алкалоиды бис-индольной (димерной) природы - винбластин и винкристин, обладающие противоопухолевой активностью, а также моно-индольные алкалоиды - аймалицин и серпентин, используемые в качестве гипотензивных препаратов [1], [2].
Содержание и биосинтез терпеновых индольных алкалоидов (ТИА) в Catharanthus roseus изучены довольно полно по сравнению с другими представителями сем. Apocynaceae. Однако до сих пор нет четкого представления о локализации в растении отдельных компонентов биосинтеза ТИА, являющихся непосредственными предшественниками ценных бис-индольных алкалоидов. Такими компонентами являются моно-индольные соединения - виндолин и катарантин, из которых образуются димерные соединения. Накопление виндолина и катарантина в клетках Catharanthus roseus является одним из лимитирующих факторов биосинтеза и накопления винбластина и винкристина. Литературные данные о количественном соотношении виндолина и катарантина в листьях весьма противоречивы [3]-[5]. Кроме того, до настоящего времени нет четкого представления о том, где осуществляется биосинтез катарантина -в листьях и корнях, или же указанный моно-индольный алкалоид синтезируется только в корнях, а затем транспортируется в надземные ткани растения для последующей его димеризации с виндолином [6].
Неясна также и локализация димерных алкалоидов индольного ряда. Считается, что клетки только листьев, но не корней Catharanthus roseus - компетентны к биосинтезу и накоплению бис-индольных алкалоидов [7]-[10]. Однако в литературе встречаются и противоположные мнения [11], [12].
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
35
Кроме того, известно, что состав и количество алкалоидов могут существенно изменяться в зависимости от органа, возраста растения, условий культивирования и т. д. Так, например, было выявлено, что культивирование катарантуса розового в искусственных условиях приводило к существенному снижению содержания ценных бис-индольных соединений [13]. Поскольку катарантус розовый является представителем тропических регионов произрастания, культивирование его в Беларуси возможно только в искусственных условиях in vivo и in vitro.
Таким образом, несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению содержания и биосинтеза ТИА катарантуса розового, все еще остается ряд спорных и не изученных до конца вопросов. Изучение накопления алкалоидов в культивируемом в искусственных условиях Catharanthus roseus представляется актуальной задачей в свете возможности создания сырьевой базы для производства цитостатиков и гипотензивных препаратов в Беларуси.
Хромато-масс-спектрометрическая детекция является одним из наиболее современных и точных методов, позволяющих анализировать сложные экстракты и устанавливать их состав. Результатов исследований, посвященных масс-спектрометрической характеристике экстрактов листьев и корней катарантуса розового, очень мало [14]-[16].
В данной работе с использованием жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией проведен качественный анализ терпеновых индольных алкалоидов, содержащихся в листьях и корнях Catharanthus roseus, культивируемого в искусственных условиях.
Методы исследования. Объектом исследования являлось растение семейства Apocynaceae рода Catharanthus G. Don. - Catharanthus roseus (катарантус розовый).
Экстракция и очистка терпеновых индольных алкалоидов. Выделение алкалоидов из корней и листьев проводили согласно методике, описанной ранее [17], с небольшими изменениями. Сухие корни и листья измельчали, просеивали через сито с диаметром пор 1 мм. К измельченному сырью массой 2 г добавляли 50 мл 70% этилового спирта и нагревали при температуре 100° С в течение 2-х часов. Полученную суспензию центрифугировали при 10 000 g 30 мин. Супернатант упаривали на водяной бане при температуре 50° С, растворяли в 20 мл 50% этилового спирта и использовали для дальнейшей очистки. Экстракты подкисляли добавлением соляной кислоты до рН 1,0, после чего выдерживали при 25° С в течение 15 часов, затем центрифугировали. Супернатант промывали гексаном (3 х 20 мл), а затем охлаждали до 10° С и добавляли 3%-ный раствор аммиака до рН результирующего раствора равного 8,0. Далее алкалоиды экстрагировали хлороформом (3 х 30 мл). Хлороформные экстракты промывали водой и выпаривали на водяной бане при температуре 40° С. Полученный сухой остаток растворяли в 1 мл метанола и использовали для анализа.
Хромато-масс-спектрометрический анализ. ВЭЖХ-МС анализ проводили
с использованием хроматографа Accela (США), оснащенного диодноматричным и масс-спектрометрическим (Thermo Scientific LCQ-Fleet, США) детекторами. Анализ проводили на колонке с обращенной фазой Nucleodur C18 Isis (4,6 х 50 мм; 1,8 мкм). В качестве мобильной фазы использовали смесь - 25 мМ ацетат аммония (раствор А) (pH 6,8) и ацетонитрил (раствор В). Градиентную элюцию проводили со скоростью 0,4 мл/мин при температуре 40° С. В процессе хроматографии состав мобильной фазы меняли согласно следующей схеме: 0-20 мин - линейный градиент от 80:20 до 20:80 (соотношение объемов раствора А и В соответственно); 20-25 мин - изократическая элюция 20:80, промывка колонки; 25-30 мин -изократическая элюция 80:20, уравновешивание колонки. Регистрацию проводили при двух длинах волн 220 и 300 нм. Режим ионизации - химическая ионизация при атмосферном давлении со следующими параметрами источника ионизации: напряжение на конусе - 22 V, скорость потока осушающего газа (азот), 30 A. U.; скорость потока вспомогательного газа (азот), 5 A. U.; сила тока и напряжение при разряде, 5 нА и 4,2 В; температура капилляра - 272° С; напряжение на капилляре - 22 В; температура десольвации - 350° С; диапазон сканирования, 50-1500 Да.
36
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно результатам проведенного нами анализа, наиболее интенсивный пик, обнаруживаемый в масс-спектре экстракта листьев катарантуса розового, соответствует молекулярному иону виндолина (457,5 m/z, таблица 1). Ион с гораздо меньшей интенсивностью соответствует молекулярному иону катарантина (337,7 m/z, таблица 1). Интенсивность пика, соответствующего молекулярному иону виндолина, почти в 100 раз больше чем интенсивность пика, соответствующего молекулярному иону катарантина. Это может быть связано, с одной стороны, с более низкой способностью к образованию ионов при данных условиях ионизации катарантина по сравнению с виндолином или, с другой стороны, что более вероятно (учитывая сходство химических свойств веществ), - с существенно более низким содержанием катарантина по сравнению с виндолином в растении.
Таблица 1 - Масс-спектрометрическая характеристика компонентов экстракта листьев
Catharanthus roseus
Предполагаемое Моноизотопная масса, Массовое число иона,
соединение а. е. м. [18], [19] m/z, [M + H]+
катарантин 336,184 337,7
дегидросерпентин 347,155 348,6
альстонин 348,147 349,1
серпентин 349,155 350,2
катенамин 350,163 351,3
аймалицин 352,179 353,3
лохнерицин 352,179
йохимбин 354,194 354,4
виндолин 456,226 457,4
резерпин 608,273 609,9
дегидро-а-3',4'-ангидровинбластин 790,409 791,6
леурозин 808,405 809,9
винбластин 810,420 810,5
катарин 822,384 823,7
винкристин 824,400 825,6
В масс-спектре экстракта также были обнаружены молекулярные ионы при 350,2 m/z, 351,3 m/z, 353,3 m/z, 349,1 m/z, 609,9 m/z, соответствующие серпентину (349,155 а. е. м.), катенамину (350,163 а. е. м.), аймалицину и (или) лохнерицину (352,179 а. е. м.), альстонину (348,147 а. е. м.), резерпину (608,273 а. е. м.) и др. (таблица 1).
Кроме того, были идентифицированы молекулярные ионы, соответствующие бис-индольным соединениям: леурозину (809,9 m/z, 808,405 а. е. м.), винкристину (825,6 m/z, 824,400 а. е. м.), винбластину (810,4 m/z, 810,420 а. е. м.), дегидро-а-3',4'-ангидровинбластин (791,6 m/z, 790,959 а. е. м.), а также некоторые другие (таблица 1). Нужно отметить, что интенсивность отдельных пиков, соответствующих молекулярным ионам соединений димерной природы, довольно высокая (примерно 50% от наиболее интенсивного пика в масс-спектре). Это так же, как и в первом случае, может свидетельствовать либо о высокой способности данных соединений к ионизации, либо о высоком содержании их в листьях.
Масс-спектрометрический анализ экстракта корней Catharanthus roseus показал, что наиболее интенсивный пик обнаруживался для иона с m/z, равным 349,7. Так как молекулярная масса серпентина составляет 349,155 а. е. м., указанный ион, вероятно, является молекулярным ионом данного алкалоида (таблица 2). Эти результаты согласуются с результатами ТСХ, где было показано, что одним из преобладающих соединений в экстракте является именно серпентин, который детектировался по наличию специфической бледно-голубой флуоресценции. Эти данные соответствуют результатами других исследователей, которые показали, что содержание серпентина в корневой системе было значительно больше, чем в листьях [8].
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
37
Таблица 2 - Масс-спектрометрическая характеристика компонентов экстракта корней
Catharanthus roseus
Предполагаемое Моноизотопная масса, Массовое число иона,
соединение а. е. м. [18], [19] m/z, [M + H]+
катарантин 336,184 337,7
таберсонин 336,184
перивин 338,163 339,3
серпентин 349,155 349,7
катенамин 350,163 350,7
аймалицин 352,179 353,8
лохнерицин 352,179
хорхаммерицин 368,174 369,7
виндолин 456,226 457,6
стриктозидин 530,226 531,6
дегидро-а-3',4'-ангидровинбластин 790,409 791,4
леурозин 808,405 809,4
дегидровинбластин 808,420
катарин 822,384 823,3
дегидровинкристин 822,400
винкристин 824,400 825,4
Менее интенсивные пики обнаруживались при следующих значениях массовых чисел: 337,7 m/z (катарантин, 336,184 а. е. м.; таберсонин, 336,184 а. е. м.), 350,7 m/z (катенамин,
350,163 а. е. м.), 353,8 m/z (аймалицин, 352,179 а. е. м.), 369,7 m/z (хорхаммерицин,
368,174 а. е. м.), 457,6 m/z (виндолин, 456,226 а. е. м.), 531,6 m/z (стриктозидин, 530,226 а. е. м.)
(таблица 2). Обнаруженные соединения являются монотерпеновыми алкалоидами индольного ряда, из которых наиболее ценными, с фармакологической точки зрения, являются серпентин и аймалицин.
Интересно отметить, что в корнях Catharanthus roseus, культивируемого в искусственных условиях, были обнаружены непосредственные монотерпеновые предшественники бис-индольных алкалоидов - виндолин и катарантин. Однако ранее многими авторами отмечено, что биосинтез виндолина осуществляется только в хлорофилл-содержащих органах катарантуса розового (в листьях, стеблях и цветочных почках) [20], [2].
Интенсивность пика, соответствующего молекулярному иону катарантина в масс-спектре корней катарантуса розового, существенно больше, чем интенсивность пика со сходным значением массового числа в листьях. Таким образом, вероятно, катарантин все же синтезируется в корнях, а затем транспортируется в надземные ткани растения, где сразу конденсируется с виндолином, что объясняет его низкое содержание в листьях, в то время как накопление последнего осуществляется в избытке.
Как уже упоминалось выше, большинством авторов не было обнаружено димерных алкалоидов в клетках корня Catharanthus roseus [7]—[10], [14]. Так, например, в результате последних исследований, касающихся изучения состава ТИА корней катарантуса розового путем хромато-масс-спектрометрического анализа, не было показано присутствие бис-индольных алкалоидов [14]. Другой группой исследователей было выявлено, что в клетках корня катарантуса розового, культивируемого в условиях открытого грунта, все же накапливаются винбластин и винкристин [11].
Нами показано, что в масс-спектре экстракта корня все-таки обнаруживаются ионы, соответствующие соединениям бис-индольной природы: 791,4 m/z (дегидро-а-3',4'-ангидровинбластин, 790,409 а. е. м), 809,4 m/z (леурозин, 808,405 а. е. м. и (или)
дегидровинбластин, 808,420 а. е. м.), 823,4 m/z (дегидровинкристин, 822,400 а. е. м. и (или) катарин, 822,384 а. е. м.), 825,4 m/z (винкристин, 824,400 а. е. м.) (таблица 2, рисунок 2).
Кроме того, был обнаружен ион со значением массового числа 805,5 m/z, который, вероятно, соответствует метаболиту винкристина, у которого отсутствуют молекула воды (таблица 2, рисунок 1).
38
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
Sample_02 F: ITMS + c
#51-83 RT: 0.29-0.47 AV: 33 NL: 1.95E3 ESI Full ms [50.00-1000.00]
m/z
Рисунок 1 - Отдельный диапазон масс-спектра (665-907 m/z) экстракта корней Catharanthus roseus
Sample_02_alc1 #4382-4492 RT: 19.18-19.63 AV:27 NL:1.97E3 F: ITMS + c APCI corona Full ms [50.00-1000.00]
353.23
1900-E
1800^
1700^
1600^
1500^
1400^
1300^
1200^
1100^
^ =
1000=
Ш =
^ 900§ 800E 700§ 600E 500E 400E 300E 200E 100§
A-
100
144.33
I ' I 150
354.27
351.27
319_.38 349.36 300 35
355.33
200
250
m/z
414.99
“1 I-1-!
400
450
501.04 .......... 57509
500 550 600
А
А - аймалицин, выделенный из корней Catharanthus roseus Рисунок 2 - Масс-спектр аймалицина
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
39
sample05_110728195622 #290-378 RT: 4.13-5.26 AV:89 NL:2.23E4 F: ITMS + c APCI corona Full ms [50.00-1500.00]
22000-= 21000^ 200007 190007 180007 170007 160007 150007 140007 130007 ■&> 120007
(Л _
Ф 11000^
“ 100007 90007 80007 70007 60007 50007 40007 30007 20007 10007 0^
145.24
144_07|^46.41
TlVi'i'Vl'lil'|l!,!|"l''TiTiiTrr
150
210.80 221.76
VinriimfvmjVnrfHvm
200
32119
ГІТІ'Ч'ІТІТ7ітп
300
^8318 423.25 447.20
'""Г| ...................
400 450
572.74
..I..............
550 600
353.36
355.07
351.91
271.52
250
350
500
m/z
Б
Б - стандартный образец Рисунок 2 - Масс-спектр айма. шцііііа
Таким образом, было впервые установлено, что в клетках корня катарантуса розового накапливается значительное количество различных бис-индольных соединений. Вероятно, синтезируемые в хлорофилл-содержащих тканях монотерпеновые предшественники бис-индольных соединений, а также сами димерные алкалоиды транспортируются в корневую систему катарантуса розового, создавая там запасной пул данных метаболитов.
При изучении качественного состава экстрактов листьев и корней Catharanthus roseus были проанализированы также масс-спектры основных фармакологически ценных алкалоидов -аймалицина, серпентина и викристина, предварительно разделенных хроматографически. Так, на рисунке 2 видно, что химическая ионизация молекулы аймалицина, выделенного из корней катарантуса розового, приводит к образованию основного молекулярного иона со значением массового числа - 353,2 m/z (100%). При сравнительном анализе масс-спектров коммерческого стандарта аймалицина и аймалицина, выделенного из растительного сырья, было показано, что спектры двух данных образцов практически не различаются (рисунок 2А, Б). Так, наиболее интенсивный ион среди всех прочих, обнаруживаемый в масс-спектре стандарта аймалицина, детектируется при 353,3 m/z.
Анализ характера фрагментации стандартного образца аймалицина показал, что фрагментация осуществляется с образованием наиболее интенсивного вторичного иона со значением массового числа, равным 144,2 m/z (100%), а также других осколочных ионов при 210,2 m/z (46,15%), 222,2 m/z (23,07%), 178,2 m/z (13,07%), 321,2 m/z (14,6%), 336,2 m/z (2,3%), 293,2 m/z (1,5%) (рисунок 3).
40
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
4600^| 4400: 4200^ 4000: 3800: 3600^ 3400: 3200: 3000: 2800-2600-і 1*2400: £ 2200^ 2000: 1800: 1600^ 1400: 1200: 1000^ 800: 600: 400: 200^
3 RT: 0.16-0.27 AV:4 NL: 4.61E3 :і corona Full ms2 353.40@cid35.00 [95.00-500.00] 144.27
117.38 i|
8.5311 I 127.36 N 158.31
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
Рисунок 3 - Вторичный масс-спектр айма. шцііііа (353,3 m/z, [M+H]+)
210.22
222.24
284.20
234.25 251.22 266.28 . I Д93 28
194.32
100
m/z
При анализе масс-спектра серпентина, выделенного из корней катарантуса розового, было показано, что химическая ионизация данной молекулы приводит к образованию молекулярного иона 349,2 m/z (100%), а также ионов меньшей интенсивности со значениями массовых чисел - 317,3 m/z (3,8%), 263,3 m/z (2,5%) (рисунок 4). Масс-спектрометрический анализ второго порядка серпентина показал, что фрагментация осуществляется с образованием основного иона со значением массового числа равным 317,2 m/z (100%), а также прочих фрагментарных ионов: 263,4 m/z (29,7%), 350,1 m/z (17,8%), 289,5 m/z (3,6%) и др. (рисунок 5).
sample02 #486-536 RT: 7.33-8.09 AV: 51 NL: 6.71 E2 T: ITMS + c APCI corona Full ms [50.00-1500.00]
650^
600^
550^
500^
450^
400^
Sr -Ъ 350-
c -
I
“ 300f 250^
200^
150-E
100-
50^
0^......I-
100
150.42 169.33 196.40 221.3°
..Ц......1..................
150 200
349.24
350.24
263.28 255.38 I
317.29
295.29 I 347.45
390.19
, I 404.32 419.18
250 300
wavelength (nm)
365.26
350
400
450
Рисунок 4 - Масс-спектр серпентина
494.29
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
41
sample02 #10-21 RT: 0.17-0.24 AV:2 NL:2.21E4
F: ITMS + c APCI corona Full ms2 349.40@cid35.00 [95.00-500.00]
317.20
m/z
Рисунок 5 - Вторичный масс-спектр серпентина (349,2 m/z, [M + H]+)
Далее были проанализированы масс-спектры первого и второго порядка бис-индольного алкалоида винкристина. В качестве стандартов использовался раствор винкристина. Как видно на рисунке 6А, химическая ионизация молекулы стандарта винкристина приводит к образованию молекулярного иона со значением массового числа -826,0 m/z (молекулярная масса винкристина составляет 824,400 а. е. м.), в то время как фрагментация молекулы винкристина, выделенного из листьев Catharanthus roseus, приводила к образованию молекулярного иона - 823,9 m/z (рисунок 6Б). Данный ион может являться дегидрированным ионом либо винкристина, либо производного винкристина. Таким образом, в экстрактах листьев катарантуса розового винкристин, вероятно, присутствует в дегидрированной форме, что может быть связано с особенностями биосинтеза бис-индольных алкалоидов в искусственных условиях, с влиянием органических растворителей или других ТИА, присутствующих в экстракте.
42
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
sample08
F: ITMS +
100
95
90/
85/
80
75/
70/
65
S 60^
с -
CO Z
-о 55з
< 50/
ш
■М 45
_со
£ 40 35/ 30/ 25 20/ 15/ 10/ 50-
#11-18 RT: 0.16-0.23 AV:4 NL:3.93E4 c APCI corona Full ms [50.00-1500.00]
133/77....184.05
I'.ГГ"'..I ""I''' [ I"
100 200
339.36
300 400
811.37
499_84 586.12 635.81 763_02
905.37
800
m/z
826.00
828.39
500
600
700
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
А
sample13 #1048-1103 RT: 15.12-15.83 AV:56 NL:1.88E4 F: ITMS + c APCI corona Full ms [50.00-1500.00]
18000z
17000/ 16000/ 15000/ 14000/ 13000/ 12000/ 11000/ ■f’ 10000/
c. z
f 9000/
8000/
7000/
6000/
5000/
4000/
3000/
2000/
1000/
0^
823.93
310.43 368.92 457.12
631.39 702.37
826.29
903.15 1036.10
400
800
m/z
Б
822.52
144.76
200
600
1000
1200
1400
А - стандартный образец; Б - образец, выделенный из листьев Catharanthus roseus Рисунок 6 - Масс-спектр винкристина
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
43
Масс-спектрометрический анализ коммерческого стандарта винкристина показал, что фрагментация осуществляется с образованием основного характерного иона - 807,6 m/z (100%) (потеря молекулы воды), а также осколочных ионов со значениями массовых чисел -765,6 m/z (50%), 705,6 m/z (9,4%), 748,7 m/z (4,7%) и некоторых других (рисунок 7А). Полученные результаты согласуются с данными, опубликованными в работах других исследователей [21]. Так, например, в работе С. Дамэн было установлено, что фрагментация молекулы винкристина осуществлялась с образованием таких ионов, как 807 m/z (100%), 765 m/z и 825 m/z.
В масс-спектре второго порядка винкристина, выделенного из растительного сырья, обнаруживались следующие ионы: 763,2 m/z (100%), 805,3 m/z (10%), 731,3 m/z (6,6%), 554,2 m/z (10%), 703,4 m/z (1,1%) и 661,3 m/z (1,4%) (рисунок 7Б). Сравнительный анализ масс-спектров второго порядка винкристина, выделенного из растительного сырья (рисунок 7Б) и стандарта винкристина (рисунок 7А), подтверждает вышеуказанное предположение о том, что вещество, химическая ионизация молекул которого приводит к образованию иона со значением массового числа 823,9 m/z, является предшественником или метаболитом винкристина.
sample08 #10-23 RT: 0.14-0.29 AV: 7 NL: 2.04E4
F: TMS + c APCI corona Full ms2 825.90@cid35.00 [225.00-1000.00]
m/z
А
А - стандартный образец (826,0 m/z, [M + H]+) Рисунок 7 - Вторичный масс-спектр винкристина
44
ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА
samplel 3 #8-32 RT: 0.11-0.38 AV:5 NL:8.82E2
F: ITMS + c APCI corona Full ms2 823.90@cid35.00 [225.00-900.00]
763.25
m/z
Б
Б - образец, выделенный из листьев Catharanthus roseus (823,9 m/z, [M + H]+) Рисунок 7 - Вторичный масс-спектр винкристина
Выводы
Получены и проанализированы масс-спектры очищенных экстрактов, содержащие сумму алкалоидов листьев и корней Catharanthus roseus, культивируемого в искусственных условиях. Выявлены масс-спектрометрические характеристики отдельных фармакологически ценных алкалоидов (аймалицин, серпентин, винкристин), выделенных из растительного сырья. Характеристики исследованных соединений, полученные при интерпретации результатов, могут послужить основой метода идентификации ТИА в лекарственных растениях. Масс-спектрометрия значительно упрощает анализ качественного состава алкалоидов индольного ряда, а также делает интерпретацию масс-спектров ТИА в экстрактах более точной и однозначной, чем и отличается от других методов (ТСХ, ВЭЖХ).
Показано, что в корневой системе Catharanthus roseus происходит аккумулирование целого ряда бис-индольных алкалоидов, биосинтез и накопление которых, по мнению большинства авторов [7]-[10], осуществляется исключительно в надземных органах. Кроме того, установлено, что содержание виндолина и катарантина, конденсация которых приводит к образованию ценных бис-индольных алкалоидов в листьях C. roseus, культивируемого в искусственных условиях, значительно различается. Накопление виндолина в листьях осуществляется в 100 раз интенсивнее, чем катарантина. В корнях, напротив, содержание катарантина существенно больше, чем виндолина.
Перечень принятых в статье обозначений и сокращений
ТИА - терпеновые индольные алкалоиды
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
МС - масс-спектрометрия
ТСХ - тонкослойная хроматография
БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ
45
Литература
1. Schmeller, T. Utilization of alkaloids in modem medicine / T. Schmeller // Alkaloids. Biochemistry, ecology, and medicinal applications / M. F. Roberts. - New York, 1998. - P. 435-459.
2. Catharanthus biosynthetic enzymes: the road ahead / V. M. Loyola-Vargas [et al.] // Phytochemistry reviews. - 2007. - Vol. 6. - P. 307-339.
3. Isolation of indole alkaloids from Catharanthus roseus by centrifugal partition chromatography in the pH-zone refining mode / J-H. Renault [et al.] // Journal of chromatography. - 1999. - Vol. 849. - P. 421-431.
4. Effect of plant growth regulators on the biosynthesis of vinblastine, vindoline and catharanthine in Catharanthus roseus / Q. Pan [et al.] // Plant growth regulators. - 2010. - Vol. 60. - P. 133-141.
5. Genetic diversity and alkaloid production in Catharanthus roseus, C. trichophyllus and their hybrids / M. Sevestre-Rigouzzo [et al.] // Euphytica. - 1993. - Vol. 66. - P. 151-159.
6. Emerging trends in research on spatial and temporal organization of terpenoid indole alkaloid pathway in Catharanthus roseus: a literature update / A. Verma [et al.] // Protoplasma. - 2012. - Vol. 249. - P. 255-268.
7. The Catharanthus roseus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology / R. Heijden [et al.] // Current medicinal chemistry. - 2004. - Vol. 11. - P. 1241-1253.
8. Cellular and sub-cellular organisation of the monoterpenoid indole alkaloid pathway in Catharanthus roseus / S. Mahroug [et al.] // Phytochemistry reviews. - 2007. - Vol. 6. - P. 363-381.
9. Emergence of periwinkle of Catharanthus roseus as a model system for molecular biology of alkaloids: phytochemistry, pharmacology, plant biology and in vivo and in vitro cultivation / P. Mishra [et al.] // Journal of medicinal and aromatic plant sciences. - 2000. - Vol. 22. - P. 306-337.
10. Transcriptome analysis in Catharanthus roseus leaves and roots for comparative terpenoid indole alkaloid profiles / A. K. Shukla [et al.] // Journal of experimental botany. - 2006. - Vol. 57. - P. 3921-3932.
11. Supercritical fluid extraction and liquid chromatography-electrospray mass analysis of vinblastine from Catharanthus roseus / Y. H. Choi [et al.] // Chem. Pharm. Bull. - 2002. - Vol. 50. - P. 1294-1296.
12. Вита, П. Фармакогностическое изучение различных форм катарантуса розового флоры анголы : автореф. дис. ... канд. фармацев. наук : 15.00.02 / П. Вита ; Рос. экон. акад. - Пятигорск, 1995. - 370 с.
13. Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques / A. Pietrosiuk [et al.] // Phytochemistry reviews. - 2007. - Vol. 6. - P. 459-473.
14. Simple and reproducible HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of alkaloids in Catharanthus roseus roots / F. Ferreras [et al.] // Journal of pharmaceutical and biochemical analysis. - 2010. - Vol. 51. - P. 65-69.
15. Liqud chromatography time of flight mass spectrometry (LC/TOF-MS) analysis of water extract of Catharanthus roseus (C. roseus) leaves and stem / R. Abas [et al.] // UMTAS. - 2011. - Vol. 30. - P. 190-197.
16. Rapid identification of vinca alkaloids by direct-injection electrospray ionization tandem mass spectrometry and confirmation by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry / H. Zhou // Phytochemical analysis. - 2005. - Vol. 16, № 5. - P. 328-333.
17. Symmetry C18 column: a better choice for the analysis of indole alkaloids of Catharanthus roseus / G. C. Uniyal [et al.] // Phytochemical analysis. - 2001. - Vol. 12. - P. 206-210.
18. Chembase - Chemical Compounds Database [Electronic resource]. - Mode of access : http://www.chembase.com. - Date of access : 29.12.2011.
19. Chemical Entities of Biological Interest (ChEBI): Database [Electronic resource] / EMBL-EBI: European Bioinformatics Institute. - Cambridge, UK, 2011. - Mode of access : http://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do. -Date of access : 28.12.2011.
20. Plant cell biotechnology for the production of alkaloids: present status and prospects / R. Verpoorte [et al.] // Journal of natural products. - 1993. - Vol. 56. - P. 186-207.
21. Damen, C. Bioanalysis of vinca-alkaloids and monoclonal antibodies / C. Damen. - The Netherlands : Encschede, 2009. - 276 p.
Summary
Qualitative content of terpenoid indole alkaloids in the leaves and roots of Catharanthus roseus, cultivated in artificial conditions was analyzed by HPLC-MS analysis. The features of the accumulation of vindoline and catharanthine, which are immediate precursors of pharmacologically valuable bis-indole alkaloids, in plant organs were determined. It was also found that the roots of Catharanthus roseus contain significant quantities of bis-indole alkaloids.
Поступила в редакцию 14.05.12.
