CC BY
39
Д.И. ШЕГУРОВА, В.В. С0ФР0Н0В, И.Г. МУСТАФИН, С.А. ЛЮБИН УДК 612.112.94-053.3
Казанский государственный медицинский университет Городская детская больница №1, г. Казань
Особенности содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов у новорожденных детей различного гестационного возраста с клинической картиной срыва адаптации в раннем неонатальном периоде
|Шегурова Диана Ильдаровна
врач отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных
420034, г. Казань, ул. Декабристов, д.125а, тел. (843) 562-52-59, e-mail: [email protected]
В статье приведены результаты исследования функционального состояния лимфоцитарного звена у новорожденных с различной перинатальной патологией. Выявлены особенности содержания гиподиплоидных (апоптотических) и гиперплоидных (пролиферирующих) лимфоцитов в зависимости от перинатальной патологии у новорожденных с различным гестационным возрастом.
Ключевые слова: новорожденные, перинатальная патология, гиподиплоидные лимфоциты, гиперплоидные лимфоциты.
D.I. SHEGUROVA, V.V. SOFRONOV, I.G. MUSTAFIN, S.A. LYUBIN
Kazan State Medical University City Children's Hospital № 1, Kazan
Features of the maintenance hypodiploidic and hyperploidic lymphocytes at newborn children of various gestational age with clinical signs of adaptationfailure in the early neonatal period
The article presents results of studying the functional state of a lymphocytic link at newborns with a various perinatal pathology. Features of the maintenance hypodiploidic (apoptotic) and hyperploidic (proliferating) lymphocytes depending on a perinatal pathology at newborns with various gestational age are revealed.
Keywords: newborns, perinatal pathology, hypodiploidic lymphocytes, hyperploidic lymphocytes.
Многие патологические процессы в периоде новорожден- ном периоде остается актуальной проблема влияния апопто-
ности оставляют глубокий след и могут проявиться на любом за и пролиферации клеток на становление адаптационных
возрастном этапе всей последующей жизни [1-4]. В неонаталь- процессов у новорожденного ребенка. Известно, что характер
адаптационных реакций определяется состоянием нуклеиновых кислот: РНК определяет характер кратковременной адаптации, а ДНК - долгосрочной [5]. С учётом данного положения оценка параметров клеточной (ядерной) ДНК позволяет разработать методы долговременного прогнозирования исходов срыва адаптации у новорожденного ребенка в раннем неонатальном периоде. Работ, посвящённых изучению ядерной ДНК лимфоцитов, крайне мало. Имеются единичные работы, посвященные исследованию ядерной ДНК у новорожденных [6-9], но информация, содержащаяся в них, разноречива в силу различных методических подходов с использованием рутинных (качественных и полуколичественных) методов определения нуклеиновой кислоты.
Цель работы
Определить особенности параметров ядерной ДНК в зависимости от клинической картины срыва адаптации в раннем неонатальном периоде у новорожденных различного гестаци-онного возраста.
Материал и методы исследования
Под наблюдением находились 110 новорожденных детей различного гестационного возраста с различной перинатальной патологией. Все новорожденные были разделены на 5 групп. Первую группу составили 12 новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее, вторую группу - 14 новорожденных с гестационным возрастом 32-34 недели, третью группу -17 новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель, четвертую группу - 51 новорожденный с гестационным возрастом 38-42 недели. Пятую группу (группу сравнения) составили 16 условно здоровых доношенных новорожденных.
Перинатальная патология была представлена следующими заболеваниями: перинатальное поражение центральной нервной системы (в том числе, церебральная ишемия различного генеза и спинальная травма), гнойно-воспалительные заболевания, пневмопатии, конъюгационная гипербилирубинемия (табл. 1). Всем пациентам проводился традиционный комплекс лабораторно-инструментальных исследований, включающий общий анализ крови, биохимический анализ крови (общий билирубин и его фракции), по показаниям нейросо-нография, ультразвуковое исследование внутренних органов, рентгенография органов грудной клетки и брюшной полости.
В качестве субстрата для исследования использовалась венозная кровь новорожденных детей. Выделялись лимфоциты стандартным методом A.Boyum [10]. Исследование популяций лимфоцитов проводилось с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием пропидиума йодида —
I. Nicoletti [11].
На гистограммах оценивалось процентное содержание ги-подиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов. Гиподиплоидные клетки вследствие потери части ДНК в процессе апоптоза [12] находятся в зоне с низкой интенсивностью флуоресценции (фракция слева от основного пика G0, соответствующего диплоидным клеткам). Правее диплоидного пика находится пик G1-G2 содержащий удвоенное количество ДНК, т.е. тетрапло-идные клетки, которые в определенной степени характеризуют активность пролиферативного процесса. На рисунке 1 приведен пример одной из типичных гистограмм.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью табличного редактора Microsoft Excel
2003, Statistica 6.0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения, представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения. Уровень статистической значимости (р) считался меньше 0,05.
Результаты исследования
Установлена нелинейная зависимость количества определенной популяции лимфоцитов от гестационного возраста (рис.
2, табл. 2). В группе сравнения содержание гиподиплоидных лимфоцитов составило 2,1±0,4% (57,8±11,2 клеток/нл), гиперплоидных лимфоцитов — 1,7±0,5% (57,9±19,2 клеток/нл). Во
II, III и IV группах новорожденных, по сравнению со средними показателями содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов у детей группы сравнения, отмечается достоверное повышение среднего процентного и абсолютного количества гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови.
Максимальное количество лимфоцитов с гиподиплоид-ным содержанием ядерной ДНК наблюдалось у новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель - 9,1±0,8% (259,0±47,1 клеток/нл; р<0,01). У доношенных новорожденных с лабораторно-клиническими признаками осложнений периода адаптации апоптотических лимфоцитов в 2,5 раза больше по сравнению с условно здоровыми новорожденными (р<0,01).
Максимальное количество гиперплоидных лимфоцитов наблюдалось у новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее, что, возможно, указывает на интенсивное течение процессов деления, пролиферации лимфоцитов. У новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель, наоборот, зафиксировано минимальное процентное и абсолютное содержание лимфоцитов с повышенным количеством ядерной ДНК (р<0,01).
Выявленная нелинейная зависимость содержания гиподи-плоидных и гиперплоидных лимфоцитов от сроков гестации может служить отражением изменений интенсивности процессов апоптоза и пролиферации в различные периоды внутриутробного созревания плода: активность апоптоза постепенно нарастает с 28 недель гестации, достигая максимальных значений в период 35-37 недель, после чего, к моменту рождения, постепенно снижается, а интенсивность процессов пролиферации с максимумом в период 31 неделя и менее снижается к 35-37 неделям гестации и нарастает к моменту рождения.
Нами выведен сводный коэффициент отношения абсолютного содержания гиперплоидных лимфоцитов к абсолютному содержанию гиподиплоидных лимфоцитов (к). Результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, в группе условно здоровых доношенных новорожденных коэффициент к равен единице: количество апоптотических и пролиферирующих лимфоцитов должно быть одинаковым (соответственно, 57,8±11,2 и 57,9±19,2 клеток/нл в раннем неонатальном периоде). Максимальное значение коэффициента (2,2±0,6) зафиксировано у недоношенных новорожденных со сроком гестации 31 неделя и менее, минимальное значение у детей со сроком гестации 35-37 недель (0,2±0,1).
Из данных, представленных в таблице 4 и на рисунке 3, видно, что наиболее интенсивно процессы апоптоза протекают при наличии конъюгационной гипербилирубинемии у доношенных новорожденных и новорожденных со сроком гестации 35-37 недель. При этом варианте осложнения периода адаптации наблюдается достоверно наибольшее количество гиподиплоидных лимфоцитов (максимум зафиксирован у детей со сроком гестации 35-37 недель - 11,8±1,5%, или 424,2±113,8 клеток/нл; р<0,01).
Наименьшее содержание гиподиплоидных лимфоцитов было зафиксировано при пневмопатиях у доношенных новорожденных (1,3±0,4%, или 30,2±10,2 клеток/нл; р<0,01) и при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей со сроком гестации 31 неделя и менее (1,3±0,3%, или 47,4±11,5 клеток/нл; р<0,01). При наличии пневмопатий или гнойно-воспалительных заболеваний процентное содержание лимфоцитов с гиподи-плоидным набором ядерной ДНК достоверно повышается
Таблица 1.
Распределение новорожденных по основному заболеванию
Перинатальная патология Удельный вес детей в группе, %
I п=12 II п=14 III п=17 IV п=51 V п=16
Перинатальное поражение центральной нервной системы 16,7±10,8 28,6±12,1 11,8±7,8 37,3±6,8 0
Пневмопатии 16,7±10,8 35,7±12,8 11,8±7,8 9,8±4,2 0
Гнойно-воспалительные заболевания 66,7±13,6 35,7±12,8 47,1±12,1 23,5±5,9 0
Конъюгационная гипербилирубинемия 0 0 29,4±11,1 29,4±6,4 0
Рисунок 1.
Двухмерная гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови по интенсивности флуоресценции
Рисунок 2.
Процентное содержание гиподиплоидных (темные столбики) и гиперплоидных (светлые столбики) лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного геста-ционного возраста (по оси Х - группы новорожденных, по оси У - содержание лимфоцитов, %)
II III V V
Таблица 2.
Сравнение абсолютного содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста
Изучаемый параметр I п=12 II п=14 III п=17 IV п=51 V п=16 Р
1 2 3 4 5 6 7
Гиподиплоидные клетки, абс. кол-во клеток в 1 нл 64,0±12,8 128,7±22,6 259,0±47,1 138,4±22,1 57,8±11,2 Р3-6<0,05 Р4-5<0,05 Р4-6<0,01 Р5-6<0,01
Гиперплоид-ные клетки, абс. кол-во клеток в 1 нл 89,2±19,0 42,3±14,6 22,2±4,0 34,4±5,0 57,9±19,2 Р2.4<0,01 Р2-5<0,05
с увеличением гестационного возраста, достигая максимального уровня в 35-37 недель, а потом, ближе к моменту рождения, резко снижается. При перинатальном поражении центральной нервной системы количество гиподиплоидных лимфоцитов
достигает максимального уровня уже в 32-34 недели гестации (8,1±2,3%, р<0,05), а потом постепенно снижается.
Абсолютное количество апоптотических лимфоцитов в группе доношенных новорожденных с перинатальным поражением
Таблица 3.
Коэффициент отношения абсолютного количества гиперплоидных лимфоцитов к абсолютному количеству гиподиплоидных лимфоцитов (к) в исследуемых группах новорожденных детей
I п=12 II п=14 III п=17 IV п=51 V п=16 Р
1 2 3 4 5 6
2,2±0,6 1,3±0,8 0,2±0,1 0,3±0,1 1,0±0,4 Р13<0,01 Рм<0,01
Таблица 4.
Абсолютное содержание гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основного заболевания
Изучаемый параметр I п=12 II п=14 III п=17 IV п=51 V п=16 Р
1 2 3 4 5 6 7
Перинатальные поражения ЦНС, клеток/нл 98,9±61,6 109,4±32,9 132,0±6,6 138,9±32,9 57,8±11,2 Р4-6<0,01 Р5-6<0,05
Пневмопатии, клеток/нл 95,5±4,2 164,9±28,6 81,1 ±62,9 30,2±10,2 57,8±11,2 Р26<0,01 Р3.6<0,01
Г нойно-воспалительные заболевания, клеток/нл 47,4±11,5 107,8±51,6 231,9±42,1 110,9±39,4 57,8±11,2 Р4-6<0,01
Конъюгационная гипербилирубин-емия, клеток/нл - - 424,2±113,8 192,5±47,1 57,8±11,2 Р4-6<0,01 Р5-6<0,05
Рисунок 3.
Процентное количество гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основного заболевания (по оси Х- исследуемые группы новорожденных, по оси У-количество гиподиплоидных лимфоцитов,%)
■ ППЦНС □ Пневмопатии □ ГВЗ □ КГБ И Контроль
II III IV V
ЦНС (138,9±32,9 клеток/нл) достоверно (р<0,05) выше, чем у здоровых новорожденных (57,8±11,2 клеток/нл). При пневмопатиях этот параметр имеет достоверно (р<0,01) максимальное значение (164,9±28,6 клеток/нл) у новорожденных со сроком гестации 32-34 недели.
При гнойно-воспалительных заболеваниях самое большое абсолютное количество апоптотических лимфоцитов зафиксировано у детей с гестационным возрастом 35-37 недель (231,9±42,1 клеток/нл; р<0,01).
У всех недоношенных новорожденных (I, II, III группы) при любом осложнении течения периода адаптации процентное количество гиперплоидных лимфоцитов возрастает по сравне-
Рисунок 4.
Процентное количество гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основной перинатальной патологии (по оси Х - исследуемые группы, по оси У - количество гиперплоидных лимфоцитов, %)
нию с количеством этих клеток у условно здоровых доношенных новорожденных (рис. 4).
В I и II группах новорожденных уровень гиперплоидных лимфоцитов резко повышен у детей с гнойно-воспалительными заболеваниями (максимальный уровень зафиксирован у новорожденных со сроком гестации 32-34 недели - 18,3±1,8%;
р<0,01). У детей со сроком гестации Зб-З7 недель самое большое содержание пролиферирующих лимфоцитов отмечалось у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы (б,8±0,8%, р<0,0б).
Выводы
1. В группе условно здоровых новорожденных детей установлены нормативы содержания гиподиплоидных лимфоцитов -2,1±0,4%, или б7,8±11,2 клеток/нл, гиперплоидных лимфоцитов - 1,7±0,б%, или б7,9±19,2 клеток/нл.
2. У новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее преобладают гиперплоидные лимфоциты (2,З±0,4%, или 89,2±19,0 кл/нл). С увеличением гестационного возраста уровень гиперплоидных лимфоцитов снижается, достигая минимальных значений к Зб-З7 неделям гестации (1,2±0,З%, или 22,2±4,0 кл/нл), а содержание гиподиплоидных лимфоцитов к Зб-З7 неделям гестации возрастает до максимума (9,0±0,8%, или 2б9,0±47,1 кл/нл).
3. При наличии клинико-лабораторных признаков осложнений периода адаптации в раннем неонатальном периоде наблюдается однонаправленная динамика изменения уровня гиподиплоидных лимфоцитов в сторону увеличения независимо от вида перинатальной патологии.
4. Максимальные значения гиперплоидных лимфоцитов у новорожденных с гестационным возрастом менее 3б недель и у доношенных новорожденных отмечаются при гнойновоспалительных заболеваниях; в группе новорожденных с гестационным возрастом Зб-З7 недель - при перинатальном поражении ЦНС.
ЛИТЕРАТУРА
1. Володин Н.Н. Неонатология. Национальное руководство / Под ред. Н.Н.Володина // М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2008. — 749 с.
2. Чистякова Г.Н. Иммунологические особенности периода ранней постнатальной адаптации новорожденных от женщин с пато-
логически протекающей беременностью // Мать и дитя в Кузбассе.
— 2005. — № 3 (22). — С. 17-22.
3. Аронскинд Е.В., Уфимцева Л.А., Курова Э.Г. и др. Состояние здоровья детей, перенесших критические состояния в периоде новорожденности // Педиатрия: Журнал им. Г. Н. Сперанского. —
2004. — № 1 . — С. 39-42.
4. McCormick, Marie C., Jeanne Brooks-Gunn et. al. The health and developmental of very low-birth-weight children at school age // JAMA. — 1992. — Vol. 267. — P. 2204-2208.
5. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии. — М.: Медицина. — 1993. — 486 с.
6. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Мазепа В.Н., Талаева Е.Б. Индуцированный активацией апоптоз лимфоцитов крови новорожденных. Зависимость характера ответа от клинического состояния новорожденных // Иммунология. — 1997. — №1. — С. 47-50.
7. Талаев В.Ю. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов новорожденных к активационному апоптозу // Педиатрия. — 2000.
— № 3. — С. 8-11.
8. Софронов В.В., Туаева Н.О., Винтер В.Г. и др. Изменение содержания ядерной и внеклеточной ДНК у новорождённых с клиническими проявлениями нарушения адаптации в раннем неонатальном периоде // Вопросы современной педиатрии. — 2006.
— Т. 5. — № 6. — С. 28-31.
9. Громада Н.Е. Цитокиновый профиль и количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови у новорожденных с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы // Цитокины и воспаление. — 2008.
— Т. 7, № 3. — С. 14-18.
10. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. — 1968. — Vol. 21. — № 97. — P. 1-9.
11. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C. et. al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol Methods. — 1991. — Vol. 139. — P. 271-280.
12. Mac Closkey T. W., Oyaizi N., Coronezi M., Pahwa S. Use of flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes // Clin. Immunol. Immunopathol. — 2004. — Vol. 71. — P. 14-18.
НОВОЕ В МЕДИЦИНЕ. ИНТЕРЕСНЫЕ ФАКТЫ
НИЗКИЕ УРОВНИ ВИТАМИНА D У ДЕТЕЙ АССОЦИИРУЮТСЯ С ТЯЖЕСТЬЮ АСТМЫ
Низкие сывороточные уровни витамина D у детей с астмой ассоциируются с более высокими уровнями иммуноглобулинов IgE и плохим ответом на ингаляционные кортикостероиды, согласно результатам исследования, представленного на Ежегодном Собрании Американской Академии Аллергии, Астмы и Иммунологии (AAAAI) 2012.
«Наше исследование позволило предположить, что у детей есть терапевтическое окно, во время которого дополнительный прием витамина D может повлиять на степень аллергической чувствительности организма», — сказала доктор Елена Голева (Elena Goleva) (Department of Pediatrics at the National Jewish Health in Denver, Colorado).
Исследование включило 103 пациентов с астмой. Средние сывороточные уровни витамина D составляли 22 нанограмм/мл для детей (n = 53) и 17 нанограмм/мл для взрослых (n = 50); 47,6 % когорты имели дефицит витамина D (сывороточные уровни ниже 20 нанограмм/мл).
Исследователи обнаружили обратное отношение между сывороточными уровнями IgE и витамином D у детей, но не у взрослых, и обратное отношение между дозой ингаляционных кортикостероидов и сывороточными уровнями витамина D у детей, но не у взрослых. Многомерная регрессия показала положительные корреляции между уровнями витамина D и экспрессией нескольких генов, показательные для ответа на стероиды - Cyp24a у детей, но не у взрослых, и LL-37 и у детей, и у взрослых.
Результаты исследований in vitro также показали, что экспрессия Cyp24a коррелировалась с супрессией дексаметазоном интерлeйкина 13 и фактора некроза опухоли альфа у детей, но не у взрослых.
«Мы предполагаем, что дополнительный прием витамина D у пациентов с астмой может снизить потребность в стероидах и улучшит ответ на стероиды», — сказала доктор Голева.
Источник: Abbottgrowth.ru Опубликовано 26-04-2012
