CC BY
69
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.351-006.04-07:616.155.34-078.33
*И. В. Нестерова, С. В. Ковалева, Г. А. Чудилова, Л. В. Ломтатидзе, А. А. Евглевский,
Н. В. Колесникова, Е. В. Фомичева, Е. А. Коков
особенности ремоделирования фенотипа и функциональных возможностей нейтрофильных гранулоцитов пациентов с колоректальным раком под влиянием G-CSF в системе in vitro
Центральная научно-исследовательская лаборатория ГБОУ ВПО Кубанский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России (350063, г Краснодар, ул. Седина, 4), * ГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов Министерства образования и науки РФ (117198, г Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6)
В реакциях противоопухолевого иммунитета презентация нейтрофильных гранулоцитов (НГ) в качестве потенциального ресурса цитотоксических эффекторных клеток тесно ассоциирована с их регуляторной ролью и привлечением посредством запуска цитокинового и хемокинового каскада к работе других клеток иммунной системы. При ремоделировании фенотипа периферических НГ в системе in vitro существенно различается у здоровых субъектов и у пациентов с колоректальным раком (КРР) ответ субпопуляций СD64-cDз2+CD16+CD11b+НГ и СD64+СD32+CD16+CD11b+НГ на гра-нулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF). У пациентов с КРР установлены разнонаправленные влияния (супрессирующие, стимулирующие, модулирующие) G-CSF на фенотипические характеристики как в субпопуляции CD64-CD32+CD16+CD11b+Hn так и более выраженные в CD64+CD32+CD16+CD11b+HF В то же время у пациентов с КРР преинкубация с G-CSF в основном позитивно влияла на первые этапы реализации фагоцитарного акта, однако при этом не реставрировала внутриклеточные процессы киллинга, переваривания и механизмы цитотоксичности.
Ключевые слова: нейтрофильные гранулоциты, иммунофенотип, цитотоксичность, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, неопластические заболевания
I.V Nesterova, S.V Kovaleva, G. A. Chudilova, L. V Lomtatidze, A. A. Evglevckiy, N.V Kolesnikova, E.V Fomicheva,
E.A. Kokov
FEATURES OF THE REMODELING OF THE PHENOTYPE AND THE FUNCTIONAL CAPABILITIES OF THE NEUTROPHILIC GRANULOCYTES OF PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER UNDER THE INFLUENCE OF G-CSF IN THE IN VITRO
In the reactions of antitumor immunity presentation of neutrophilic granulocytes (NG) as a potential resource of cytotoxic effector cells is closely associated with their regulatory role and involvement through cytokine and chemokine launch stage in the work of other immune system cells. When remodeling phenotype of peripheral LH in in vitro system differs significantly from healthy subjects and in patients with colorectal cancer (CRC) response of subpopulations of CD64-CD32+CD16+CD11b+NG and CD64+CD32+CD16+CD11b+NG on G-CSF. In patients with established CRC multidirectional influence (suppressor, stimulating, modulating) G-CSF on the phenotypic characteristics of both subpopulations CD64-CD32+CD16+CD11b+NG, and more pronounced in the CD64+CD32+CD16+CD11b+NG. At the same time in patients with CRC pre-incubation with G-CSF is mainly a positive influence on the first stages of the phagocytic act, however, is not refurbished intracellular killing processes, digestion and mechanisms of cytotoxicity.
Keywords: neutrophil granulocytes, immunophenotype, cytotoxicity, granulocyte colony-stimulating factor, neoplastic disease
Нейтрофильные гранулоциты (НГ) ранее рассматривались только как клетки - эффекторы, участвующие в осуществлении фагоцитарной функции, инициации и реализации прямой и антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ), при этом подчеркивалось, что в периферическую кровь они попадают, конечно, дифференцированными клетками с ограниченными возможностями к белковому синтезу. Тем не менее в настоящее время убедительно доказано, что НГ могут повышать экспрессию генов, вовлекаемых в реализацию фагоцитарной функции, а также отвечать на воздействие провоспалительных цитокинов (TNF-a, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), INF-y), дифференцировкой, выражающейся экспрессией рецепторов, присущих антигенпрезентирую-щим клеткам (АПК) [10]. Они могут становиться участниками формирования цитокиновой сети посредством секреции провоспалительных (IL-1a, IL-ip, CSF, IFN-y, TNF-a и т.д.) и противовоспалительных (IL-4, IL-10, ILIRa и т.д.) цитокинов,
Нестерова Ирина Вадимовна - д-р мед. наук, проф.; тел. 8(495) 438-52-94, e-mail: inesterova1@yandex.ru.
регулируя при этом экспрессию генов [12, 13]. Иными словами, в настоящее время НГ признан АПК, способной к диффе-ренцировке и активации ядра - реструктуризации хроматина [4, 5], экспрессии многочисленных генов, синтезу и секреции цитокинов, хемокинов, ростовых факторов, различных пептидов, в том числе участвующих в формировании экстра-целлюлярных нейтрофильных сетей и ряда других молекул, что дает нам новые представления об участии НГ в межклеточных взаимодействиях и выполнении ими регуляторных функций [3, 7, 14, 15].
В реакциях противоопухолевого иммунитета презентация НГ в качестве потенциального ресурса цитотоксических эффекторных клеток тесно ассоциирована с их регуляторной ролью и привлечением посредством запуска цитокинового и хемокинового каскада к работе других клеток иммунной системы [16]. Локальная продукция цитокинов клетками опухоли приводит к рекрутированию и активации НГ, тем самым усиливая противоопухолевую защиту. В то же время нарушение баланса между нейтрофильными медиаторами способствует или ингибированию, или прогрессии опухолевого роста; зачастую имеется смещение в сторону опухолевого роста вследствие превалирования стимулов в опухолевом микроокружении и угнетении функции НГ [6]. Накопленный
- 306 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
материал подтверждает наличие дефектов функциональной активности НГ при злокачественных заболеваниях [8]. Ранее в литературных источниках было описано влияние иммуномодулирующих факторов и цитокинов на функционирование НГ при различных неопластических процессах. Показано антипролиферативное действие ИФН-a через усиление TNF-опосредованного апоптоза НГ больных хроническим миело-лейкозом. Описано повышение АЗКЦ НГ под влиянием GM-CSF, коррелирующее с повышением экспрессии CD11b/CD18 адгезивных молекул [11]. При исследовании цитотоксических триггерных возможностей трех Fcg-рецепторов НГ под влиянием различных цитокинов наибольшими возможностями повышать АЗКЦ НГ обладал ИФН-у, однако GM-CSF, TNF также позитивно влияли на этот процесс [9].
Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей влияния G-CSF на функционирование НГ периферической крови пациентов с колоректальным раком (КРР) системе in vitro.
Материал и методы
Формирование группы пациентов, страдающих КРР, у которых изучали функционирование НГ, проводилось на базе ГУЗ Клинический онкологический диспансер №1 Департамента здравоохранения Краснодарского края (Краснодар). В группу исследования вошли 10 пациентов обоего пола в возрасте от 38 до 70 лет с впервые выявленным КРР II—III стадии развития неопластического процесса непосредственно перед хирургическим вмешательством, не получавших ранее лучевой терапии, курсов полихимиотерапии, а также иммунотерапии. Диагноз заболевания устанавливали с использованием комплекса методов, включающих клиническое, инструментальное и лабораторное обследование, соответствующее стандартам оказания медицинской помощи больным с данной патологией. Клинико-анамнестическое обследование проведено с использованием программы "иммунологический анамнез". У всех пациентов с КРР гистологически подтверждена аденокарцинома, при этом в 80% случаев имела место низкодифференцированная аденокарцинома. Контрольную группу, сопоставимую по полу и возрасту, составили 10 условно-здоровых добровольцев.
Забор периферической крови для иммунологических исследований осуществляли в утренние часы в вакуэты с К3ЭД-ТА как в контрольной группе, так и у пациентов с КРР.
Методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 ("Beckman Coulter", США) с панелью моноклональных антител, меченных различными флюорохромами CD64+-FITC, CD32+-PE, CD16+-ECD, CD11b+-PC5 ("Beckman Coulter", США) выделены двойным гейтированием по CD16+CD64-и CD16+CD64+ и исследованы 2 субпопуляции периферических НГ с фенотипом СD64-СD32+CD16+CDПb+НГ и СD64+СD32+CD16+CD11b+НГ соответственно. Оценивали относительное количество НГ (НГ, %) и уровень плотности экспрессируемых молекул по показателю интенсивности флюоресценции (MFI).
Изучение функциональных свойств НГ в нагрузочных тестах in vitro проводили после преинкубации с гранулоцитар-ным колониестимулирующим фактором (G-CSF). При этом исследовали как изменения фенотипа субпопуляций CD64-CD32+CD16+CD11Ь+НГ и CD64+CD32+CD16+CDnb+nr,
фагоцитарной функции с оценкой киллинговых возможностей НГ, так и особенности реализации цитотоксического потенциала НГ в нагрузочных тестах в системе in vitro (NADPH-оксидаза, миелопероксидаза (МП), катионный белок (КБ)). Для преинкубации в системе in vitro использовали G-CSF(нейпоген, "F. Hoffmann - La Roche Ltd.", Франция) в конечной концентрации 10-7 г/л. Время преинкубации составило 1 ч при Т 37оС.
Исследование фагоцитарной функции НГ проводили в соответствии с методическими рекомендациями, (И. В. Нестерова, Н. В. Колесникова, Г. А.Чудилова, 1996):
тестировали относительное и абсолютное содержание активно-фагоцитирующих НГ (ФАН, %, ФАН, абс.); для характеристики объема захваченного бактериального материала определяли фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ), для оценки киллинговой активности и уровня переваривания определяли процент переваривания (П, %), индекс переваривания (ИП), а также интегральный показатель киллинговой и переваривающей активности - ИППА.
Функциональную активность НГ с оценкой их способности к реализации цитотоксического и цитолитического кис-лородзависимого (NADPH-оксидаза, МП) и кислороднеза-висимого (КБ) потенциала тестировалась с использованием функциональных нагрузочных тестов в системе in vitro [2]. Спонтанную и индуцированную NADPH-оксидазную активность НГ периферической крови определяли по показателям NBT-теста спонтанного и стимулированного (индукция St. aureus, штамм 209), подсчитывая клетки с восстановленным формазаном (% формазанпозитивных клеток - % ФПК, и средний цитохимический индекс - СЦИ) с последующим расчетом коэффициента мобилизации (КМ СЦИ - СЦИст./ СЦИсп.). Активность МП и содержание КБ оценивали с использованием СЦИ как в спонтанных условиях (МПсп., КБсп.), так и при антигенной стимуляции St. aureus, штамм 209 (МПст., КБст.).
Весь материал подвергли статистической обработке с использованием методов вариационной статистики с использованием компьютерной программы Biostat 4.0 для Windows и DOS IBM-PC [Primer of Biostatistics, 4th Edition, S.A. Glantz, McGraw-Hill].
Результаты и обсуждение
Анализ одномоментной экспрессии нескольких рецепторов на поверхностной мембране НГ ^D64+, CD32+, CD16+, CD11b+) показал, что при КРР так же как и у здоровых лиц выявлены две субпопуляции НГ: мажорная - СD64-CD32+CD16+CDПb+НГ и минорная - СD64+СD32+CD16+CDПb+НГ. Субпопуляция СD64-
CD32+CD16+CDnb+n^ является существенной как у здоровых лиц, так и при КРР и составляет 91,5 ± 0,92 и 87,04 ± 2,68% соответственно. Плотность экспрессии этих рецепторов (MFI) различается у здоровых лиц и больных КРР. При КРР она наиболее высокая по экспрессии CD16+ и наименьшая - по экспрессии СD32+. Минорная субпопуляция СD64+СD32+ CD16+CDПb+НГ у здоровых лиц составляет 0,19 ± 0,02% от всех НГ, находившихся в циркуляции, у пациентов с КРР - 0,22 ± 0,02%. Достоверность различий при КРР по отношению к здоровому контролю установлена по MFI CD16+ (р < 0,01) и MFI CD11b+ (р < 0,001) (см. таблицу). Полагаем, что выявленный нами уровень плотности экспрессии соответствующих поверхностных мембранных маркеров в обоих изучаемых фенотипах НГ (СD64-СD32+CDl6+CDПb+ и СD64+СD32+CD16+CD11b+) явно недостаточен для адекватного проявления АЗКЦ НГ у пациентов с КРР, о чем свидетельствует наличие II-III стадии развития неопластического процесса.
После проведения преинкубации с G-CSF НГ здоровых лиц достоверных отличий в субпопуляции СD64-CD32+CD16+CDnb+n^ по исследуемым параметрам от исходных уровней в данной достаточно стабильной популяции НГ не выявлено (см. таблицу). Эти факты, вероятно, объясняются тем, что большинство НГ, входящих в эту субпопуляцию, находятся в покоящемся состоянии, и G-CSF при этом, по-видимому, проявляет свое модулирующее физиологическое влияние, которое не приводит к каким-либо значимым изменениям мембранной экспрессии НГ
При КРР преинкубация НГ с G-CSF выявляет разнонаправленные эффекты на мембранную экспрессию. Так, в 30% случаев установлено достоверное уменьшение количества СD64-CD32+CD16+CD11Ь+НГ (с 87,04 ± 2,68 до 65,23 ± 3,8%; р < 0,01), при этом у 70% пациентов - количество
- 307 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Варианты трансформации фенотипа двух субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при колоректальном раке и у здоровых лиц под влиянием G-CSF в системе in vitro
Группа СD64-СD32+CD16+CD11b+НГ CD64+CD32+CD16+CD11b+НГ
% MFI CD16 MFI CD32 MFI CD11b % MFI CD64 MFI CD16 MFI CD32 MFI D11b
Контроль 91,5 ± 0,92 66,92 ± 3,03 6,98 ± 0,52 13,23 ± 1,21 0,19 ± 0,02 12,5 ± 0,94 11,83±1,4 11,64±1,35 14,38±1,08
Контроль+G- CSF 90,7 ± 1,2 60,7 ± 2,86 7,12 ± 1,15 12,32 ± 1,66 0,39 ± 0,19 11,66 ± 0,56 7,4±0,66 р<0,05 11,54±1,3 9,76±0,99 р<0,05
КРР 87,04 ± 2,68 69,76 ± 3,71 4,87 ± 0,33 15,91 ± 0,84 0,22 ± 0,02 9,06 ± 0,7 22,5±2,06 р1<0,01 13,74±1,41 27,68±2,32 р <0,001
КРР+ G-CSF: 12,49 ± 1,39
1-я группа 65,23 ± 3,8 (30) р < 0,01 67,45 ± 4,1 (70) 3,27 ± 0,15 (50) р < 0,05 11,73 ± 1,14 (70) р < 0,05 0,09 ± 0,01 (30) р < 0,01 5,54 ± 0,29 (20) р < 0,05 5,28±0,73 (20) р<0,01 7,84±0,88 (20) р<0,01
2-я группа 94,3 ± 0,86 (70) 116,7 ± 8,6 (30) р < 0,001 7,03 ± 0,12 (50) р < 0,001 24,36 ± 1,4 (30) р < 0,001 0,37 ± 0,02 (70) р < 0,001 9,84 ± 0,43 (80) 18,94±2,64 (80) 20,92±1,43 (80)
Примечание. р - по отношению к данным без инкубации с G-CSF; р1 - по отношению к контролю. В скобках - %.
CD64'CD32+CD16+CDnb+HT после преинкубации не меняется. G-CSF влиял на плотность экспрессии молекул на СD64"CD32+CD16+CDПb+НГ следующим образом: увеличение у 30% пациентов MFI CD16+ - до 116,7 ± 8,6 (р < 0,001) и у 50% пациентов MFI CD32+ - до 7,03 ± 0,12 (р < 0,001), у 30 % пациентов MFI CD11b+ - до 24,36 ± 1,4 (р < 0,001), при этом в 50% случаев зарегистрировано снижение MFI CD32+ - 3,27 ± 0,15 (р < 0,05) и в 70% случаев MFI CD11b+ до 11,73 ± 1,14 (р < 0,05) и отсутствие достоверных колебаний по MFI CD16+ у остальных пациентов (см. таблицу).
По отношению к cD64+CD32+CD16+CD11b+HT у пациентов с КРР были выявлены два типа ответа на G-CSF: супрес-сирующий (1-я группа) - 0,09 ± 0,005% (р < 0,001) и стимулирующий (2-я группа) - 0,37 ± 0,02% (р < 0,001). При этом отмечено одновременное снижение плотности экспрессии нескольких рецепторов у 1/5 больных по MFI CD64+ - до 5,54 ± 0,29 (р < 0,05), по MFI CD16+ - до 5,28 ± 0,73 (р < 0,01), по MFI CD11b+ - до 7,84 ± 0,88 (р < 0,01) (см. таблицу).
Рис. 1. Фагоцитарная и микробицидная цитотоксическая активность нейтрофильных гранулоцитов при колоректальном раке (процент от здорового контроля).
Здесь и на рис. 2-4: К - контроль; КРР - колоректальный рак; L - количество лейкоцитов; %НГ - относительное количество НГ; НГ абс. - абсолютное содержание НГ; %ФАН - относительное количество активно-фагоцитирую-щих НГ; ФАНабс. - абсолютное количество активно-фагоцитирующих НГ; ФЧ - фагоцитарное число; ФИ - фагоцитарный индекс; %П - процент переваривания; ИП - индекс переваривания; ИППА - интегральный показатель переваривающей активности; %ФПК - процент формазанпозитивных клеток; СЦИ - средний цитохимический индекс; КМ СЦИ - коэффициент мобилизации; КБ - катионный белок; МП - миелопероксидаза; сп - спонтанный тест; ст - стимулированный тест.
Полученные данные продемонстрировали, что при КРР имеется значительное уменьшение количества активно работающих НГ - достоверное снижение ФАН, % (47,87 ± 2,14 против 71 ± 4,45 в контроле; р < 0,001), снижение процессов захвата АГ материала - ФЧ (2,78 ± 0,28 против 6,83 ± 0,45 в контроле;р < 0,001), ФИ (1,36 ± 0,18 против 4,96 ± 0,18 в контроле; р < 0,001), которые сопровождаются дефектом кил-линга и переваривания с достоверными различиями по ИП (1,41 ± 0,19 против 2,86 ± 0,24 в контроле;р < 0,001) (рис. 1). Следовательно, при КРР имеет место дефицит количества активно работающих НГ, нарушения их фагоцитарной активности, которые проявляются депрессией поглотительной, киллинговой и переваривающей способности (см. рис. 1).
При исследовании фагоцитарной активности НГ здоровых субъектов в системе in vitro после преинкубации с G-CSF достоверных изменений выявлено не было. В то же время преинкубация с G-CSF НГ пациентов с КРР привела к восстановлению количества активно работающих клеток, которое возросло по ФАГ, %, с 47,87% ± 2,14 до 62,75 ± 4,38% (р < 0,01), достоверно увеличился и объем захваченного АГ материала по ФЧ и ФИ (р < 0,001, р < 0,05 соответственно), однако при этом сохранялось угнетение процессов киллинга и переваривания (П, %, -р < 0,005; ИП -р < 0,001) (рис. 3).
Между тем следует отметить, что, несмотря на выявленные позитивные тенденции после преинкубации с G-CSF НГ
Рис. 2. Фагоцитарная и микробицидная цитотоксическая активность нейтрофильных гранулоцитов под влиянием G-CSF у здоровых субъектов (процент от здорового интактного контроля).
- 308 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
Рис. 3. Фагоцитарная и микробицидная цитотоксическая (МП, КБ) активность нейтрофильных гранулоцитов под влиянием G-CSF при колоректальном раке (процент от показателей при КРР без преинкубации).
пациентов с КРР, все же сохранялась достоверность негативных различий по основным изучаемым параметрам, контролирующим процесс фагоцитоза НГ, при сравнении с таковыми в группе контроля (рис. 2, см. рис. 3).
Спонтанная и стимулированная активность NADPH-оксидаз у здоровых субъектов увеличивалась в 2-4 раза под влиянием G-CSF (рис. 4). При этом отмечено более выраженное стимулирующее влияние G-CSF как на относительное количество ФПК, %, так и метаболическую активность каждого, отдельно взятого НГ (по СЦИ) в спонтанном и стимулированном тесте. Эти данные свидетельствуют об адекватной работе NADPH-оксидаз НГ после преинкубации с G-CSF, в том числе и после последующего воздействия индуцирующего стимула (St. aureus), и сохранении резервного потенциала NADPH-оксидаз, что подтверждается отсутствием достоверных колебаний КМ СЦИ.
При исследовании влияния G-CSF на ферментные (МП) и неферментные (КБ) цитотоксические механизмы НГ у здоровых субъектов отмечалось достоверное снижение активности МПсп. (р < 0,05) и содержания КБсп. (р < 0,05) после преинкубации с G-CSF (см. рис. 4). Это свидетельствовало о значительном расходовании МП и КБ посредством феномена внутриклеточной и трансмембранной дегрануляции во время инкубации с цитокином. При этом при воздействии G-CSF реализация МПсп. (р < 0,05) и КБсп. (р < 0,05) была несущественной. В то же время при проведении на следующем этапе дополнительной нагрузки в системе in vitro St. aureus сразу же после преинкубации G-CSF дальнейшего расходования как МП, так и КБ не наблюдали. Это связано, по-видимому, с максимальным расходованием МП и КБ на фоне преинкубации с G-CSF. Иными словами, под влиянием преинкубации с G-CSF в системе in vitro НГ здоровых лиц, большая часть работы по реализации, цитотоксического и цитолитического потенциала НГ принадлежит NADPH-оксидазам. При этом параллельно происходит выключение дальнейшего расходования, а возможно, и истощение запасов гранулярных МП и КБ, что связано, по-видимому, с максимальным их расходованием во время преинкубации с G-CSF.
У пациентов с КРР спонтанная активность NADPH-оксидаз была в 2,1 раза выше, чем здоровых субъектов, как по ФПКсп., % (р < 0,001), так и по сЦИсп. (р > 0,05), при этом сохранялся адекватный ответ на последующую дополнительную нагрузку бактериальным АГ в системе in vitro -КМ СЦИ 2,62 ± 0,32 против 2,04 ± 0,24 у здоровых лиц (р > 0,05) (см. рис.4).
Следует подчеркнуть, что после проведения преинкубации с G-CSF при КРР были получены разные по степени выраженности ответы НГ, как на воздействие самого G-CSF по
К Ш К+G-CSF Щ КРР
KPP+G-CSF (1-я группа) gg§j KPP+G-CSF (2-я группа)
Рис. 4. Особенности состояния кислородзависимой микробицидной системы (NADPH-оксидаза) нейтрофильных гранулоцитов под влиянием G-CSF в системе in vitro у здоровых лиц и при колоректальном раке (процент от здорового контроля).
СЦИсп., так и на последующие воздействия бактериального АГ по ФПКст., %, и СЦИст. (см. рис. 4). Были выявлены 2 группы пациентов, чьи НГ после преинкубации с G-CSF отвечали разнонаправленно. НГ пациентов 1-й группы ответили резким возрастанием ФПК, %, с 2,66 ± 0,75 до 27,6 ± 4,0 (р < 0,001) после воздействия бактериального АГ. При анализе динамики СЦИ активность NADPH-оксидаз менялась следующим образом: возрастала почти в 3 раза с 0,1 ± 0,03 до 0,29 ± 0,05 (р < 0,01) после преинкубации с G-CSF, а далее продолжала возрастать до 0,8 ± 0,12 (р < 0,001). НГ пациентов 2-й группы не ответили по ФПК, %, ни на преинкубацию с G-CSF, ни на последующую нагрузку бактериальным АГ (р > 0,05). В то же время оценка активности NADPH-оксидаз по СЦИ продемонстрировала снижение их активности в 2 раза после преинкубации с G-CSF (р < 0,05), при сохранении ответа на дополнительную бактериальную нагрузку в системе in vitro (р < 0,05).
Установлено, что уровень КБ в спонтанном тесте в НГ у пациентов с КРР ниже, чем у здоровых субъектов - соответственно 2,1 ± 0,12 против 2,51 ± 0,1 (р < 0,05) (см. рис. 4). При предварительной инкубации с G-CSF НГ лиц, страдающих КРР, не выявлено достоверных различий по влиянию G-CSF на уровень КБсп. (см. рис.3). При этом отмечено, что последующая нагрузка бактериальным АГ, проведенная после преинкубации НГ с цитокином, вызывала выраженное дополнительное расходование КБ. Таким образом, у пациентов с КРР имеет место дефицит спонтанного КБ с сохранением на уровне контроля способности к расходованию белка под влиянием бактериальной нагрузки.
Активность МП пациентов с КРР была несколько повышена по отношению к контролю 2,7 ± 0,06 против 2,24 ± 0,11 (р < 0,01) (см. рис.2). Инкубация с G-CSF приводила к достоверному снижению активности МП (р < 0,01), что свидетельствовало о внутриклеточном и/или трансмембранном расходовании МП. Тем не менее при проведении в последующем нагрузочных тестов с бактериальным АГ в отличие от НГ здоровых субъектов в НГ пациентов КРР наблюдалось дополнительное расходование МП (см. рис. 3).
При проведении сопоставительного анализа обращает на себя внимание факт обнаружения различного реагирования как самой минорной субпопуляции НГ, так и активности NADPH-оксидаз на воздействие G-CSF при КРР. При оценке влияния G-CSF сформированы 2 группы пациентов: 1-я
- 309 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
группа (60% пациентов) - со снижением относительного количества CD64+CD32+CD16+CD11b+Hr на фоне повышения MFI по CD64+, CD16+, CD11b+, что было ассоциировано с активацией спонтанных и стимулированных бактериальным АГ NADPH-оксидаз в 30% случаев или отсутствием ответа NADPH-оксидаз в 20% случаев; 2-я группа (40% пациентов) - с повышенным количеством CD64+CD32+CD16+CD11b+Hr (в %) и повышением по MFI экспрессии CD64+, CD16+ и CD11b+ при значительном повышении метаболической активности спонтанных NADPH-оксидаз (СЦИ), но с дальнейшим снижением ответа NADPH-оксидаз на дополнительную индукцию St. aureus. Принимая во внимание, что CD64+ является активационным маркером, можно предположить, что субпопуляция CD64+CD32+CDl6+CD11b+Hr должна обладать более выраженными функциональными свойствами, в том числе и свойствами прямой и опосредованной противоопухолевой цитотоксичности.
Таким образом, установлено, что у пациентов с КРР как и у здоровых субъектов в циркуляции находится 2 субпопуляции НГ с фенотипом CD64-CD32+CD16+CD11b+ НГ и минорной - CD64+CD32+CD16+CD11b+Hr, отличающиеся друг от друга как фенотипически, так и ответом на воздействие G-CSF в системе in vitro.
При ремоделировании фенотипа периферических НГ в системе in vitro существенно различается у здоровых субъектов и у пациентов с КРР ответ субпопуляций CD64-CD32+CD16+CD1 lb+НГ и CD64+CD32+CD16+CDПb+HГ на G-CSF. Так, у здоровых субъектов воздействие G-CSF на субпопуляцию CD64-CD32+CD16+CDnb+HT носит модулирующий характер и не влияет ни на количественные характеристики, ни на плотность экспрессируемых рецепторов, а в минорной субпопуляции CD64+CD32+CDl6+CDnb+HT при инкубации с G-CSF имело место достоверное уменьшение MFI CD16+ и CD11b+. В то же время у пациентов с КРР установлены разнонаправленные влияния (супрес-сирующие, стимулирующие, модулирующие) G-CSF на фенотипические характеристики как в субпопуляции CD64-CD32+CD16+cDnb+HT, так и более выраженные в CD64+CD32+CD16+CDnb+HT. Выявленные изменения в количественных и качественных характеристиках НГ при КРР под влиянием G-CSF, с одной стороны, свидетельствуют о возможности цитокинового регулирования трансформации фенотипа НГ, с другой стороны, предположительно о дефектах восприятия НГ регулирующих стимулов, что подтверждается прогрессированием опухолевого роста.
Под влиянием преинкубации с G-CSF в системе in vitro в НГ здоровых лиц большая часть работы по реализации процессов киллинга, цитотоксического и цитолитического потенциала НГ принадлежит NADPH-оксидазам, однако при этом параллельно происходит выключение дальнейшего расходования МП и КБ в ответ на дополнительную бактериальную нагрузку в системе in vitro, что связано, по-видимому, с максимальным расходованием МП и КБ на фоне цитокино-вого воздействия.
В то же время у пациентов с КРР преинкубация с G-CSF, восстанавливая количество активно фагоцитирующих клеток, в основном позитивно влияла на первые этапы реализации фагоцитарного акта, однако при этом не реставрировала внутриклеточные процессы киллинга, переваривания и механизмы цитотоксичности. По всей видимости, это в первую очередь связано с выявленным нами базисным дефицитом КБ НГ при КРР, уровень которых значительно снижался при воздействии G-CSF, хотя при этом и сохранялась некоторая их способность к дополнительной реализации в нагрузочных тестах in vitro. Однако этого уровня, по-видимому, недостаточно для проявления киллинговых и цитотоксических свойств КБ. Высокая активность базисной NADPH-оксидазы имела место примерно у 50% пациентов с КРР Она значительно повышалась в последующем на фоне дополнительной бактериальной нагрузки in vitro после преинкубации с G-CSF,
что, однако, не оказывало позитивного влияния на процессы киллинга и переваривания во время реализации фагоцитарной функции. В этих условиях, по-видимому, проявляется внеклеточное цитотоксическое действие NADPH-оксидазы, которое, возможно, будет в дальнейшем зависеть от влияния in vivo цитокинового микроокружения опухоли.
Инкубация с G-CSF приводила к достоверному снижению активности МП, что свидетельствовало о сохранении внутриклеточного и/или трансмембранного расходовании МП. Тем не менее при проведении в последующем нагрузочных тестов с бактериальным АГ в отличие от НГ здоровых субъектов в НГ пациентов КРР наблюдалось дополнительное расходование МП. В непосредственной реализации механизмов, обеспечивающих цитопатические эффекты, задействована МП, при этом действие МП может быть реализовано только после возникновения "метаболического взрыва", который возможен лишь после активации NADPH-оксидазы. Cледовательно, в НГ с отсутствием реагирования NADPH-оксидазы на преинкубацию с G-CSF имеет место нарушение цитотоксических и цитопатических свойств МП, с дефектом активности которой можно также связать снижение противоопухолевой активности НГ. бедует подчеркнуть, что активность NADPH-оксидазы тесно ассоциирована с повышением или снижением количества НГ в субпопуляции CD64+CD32+CD16+CD1 lb+НГ
Принимая во внимание полученные данные, просматривается насущная необходимость в проведении дальнейших исследований, направленных на разработку новых подходов, которые позволят в будущем ремоделировать функциональные возможности НГ и таким образом регулировать реакции противоопухолевой прямой и АЗКЦ НГ при неопластических процессах, тем самым препятствуя росту и метастазирова-нию опухоли не только в системе in vitro, но и в клинической практике. Результаты настоящих изысканий важны для разработки новых методов иммунопрофилактики и иммунотерапии гнойно-воспалительных осложнений в послеоперационном периоде у пациентов с неопластическими процессами органов пищеварения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Долгушин И. И., Бухарин О. В. Нейтрофилы и гомеостаз. -Екатеринбург, 2001.
2. Нестерова И. В., Колесникова И. В., Чудилова Г. А. Комплексное трехуровневое исследование системы нейтрофильных гранулоцитов с возможной диагностикой иммунодефицитных состояний при различной патологии: Метод. рекомендации № 96/11. - Краснодар, 1996.
3. Нестерова И. В., Швыдченко И. Н., Роменская В. А. и др. Ней-трофильные гранулоциты - ключевые клетки иммунной системы // Аллергол. и иммунол. - 2008. - T. 9, № 4. - C. 432-435.
4. Нестерова И. В., Евглевский А. А., Фомичева Е. В. и др. Особенности спонтанной и индуцированной реструктуризации хроматина и функционирования кислородзависимых цитотоксических механизмов нейтрофильных гранулоцитов при колоректальном раке // Рос. иммунол. журн. - 2011. - Т. 5(14), № 3-4. - C. 254 - 261.
5. Нестерова И. В., Ковалева С. В., Евглевский А. А. и др. Нарушения реструктуризации хроматина ядер и фенотипические особенности нейтрофильных гранулоцитов при колоректальном раке // Рос. аллергол. журн. - 2011. - № 4 (вып.1).
- C. 253-255.
6. Balkwill F., Mantovani A. Inflammation and cancer: Back to Virchow? // Lancet. - 2001. - Vol. 357. - Р. 539.
7. Cassatella M.A. The neutrophil an emerging regulator of inflammatory and immune response // Chem. Immunol. Allergy. - 2003.
- Vol. 83. - P. 232.
8. Di Carlo E., Forni G., Musiani P. Neutrophils in the antitumoral immune response // Chem. Immunol. Allergy. - 2003. - Vol. 83.
- P. 182-203.
9. Erbe D. V., Collins J. E., Shen L. et al. The effect of cytokines on the
- 310
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
expression and function of Fc receptors for IgG on human myeloid cells // Mol. Immunol. - 1990. - Vol. 27, N 1. - P. 57-67.
10. Iking-Konert C., Cseko C., Wagner C. et al. Transdiffereatiation of polymorphonuclear neutrophils: Acquisition of CD83 and other functional characteristics of dendritic cells // J. Mol. Med.
- 2001. - Vol. 79. - P. 464-474.
11. Kushner B. H., Cheung N. K. Absolute requirement of CD11/ CD18 adhesion molecules, FcRII and the phosphatidylinosi-tollinked FcRIII for monoclonal antibody-mediated neutrophil antihuman tumor cytotoxicity // Blood. - 1992. - Vol. 79, N 6.
- P. 1484-1490.
12. Lord P C., Wilmoth L. M, Mizel S. B., McCall C.E. Expression of interleukin-la, Ip, genes by human blood polymorphonuclear leukocytes // J. Clin. Invest. - 1991. - Vol. 87, N 4. - P. 1312-1321.
13. Metani C., Mattia G. F., Silvani A. et al. Interleukin-6 expression
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
in human neutrophil and eosinophil peripheral blood granulocytes // Blood. - 1993. - Vol. 81, N 10. - P. 2744-2749.
14. RadsakM, Iking-Konert C, Stegmaier S. et al. Polymorphonuclear neutrophils as accessory cells for T-cell activation: Major histocompatibility complex class II restricted antigen-dependent induction of T-cell proliferation // Immunology. - 2000. - Vol. 101. - P. 521-530.
15. Scapini P., Lapinet V.A., Gasperini S. et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines // Immunol. Rev. - 2000. - Vol. 177. - P. 195-203.
16. Van EgmondM., van Spriel A. B., Vermeulen H. et al. Enhancement of polymorphonuclear cell-mediated tumor cell-mediated tumor cell killing on simultaneous engage meant of fcgammaRI(CD64) and fcal-phaRI (CD89) // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61, N 40. - P. 55-60.
Поступила 25.06.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
М. В. Плеханова, В. Ю. Талаев, О. Н. Бабайкина, И. Е. Зайченко, Е. И. Ефимов ДЕЙСТВИЕ ВАКЦИН ПРОТИВ ТУБЕРКУЛЕЗА И ГЕПАТИТА В НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ
и функциональные свойства дендритных клеток новорожденных in
VITRO
ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора, (г Нижний Новгород, ул. Грузинская, д. 44)
Вакцина БЦж in vitro индуцирует фенотипическое созревание дендритных клеток (дК) новорожденных и взрослых и значительно усиливает их способность стимулировать продукцию интерферона (IFN)-y лимфоцитами. БЦЖ увеличивает способность ДК взрослых стимулировать продукцию фактора некроза опухолей a (TNFa) лимфоцитами и практически не влияет на данный параметр у ДК новорожденных. Рекомбинантные вакцины против гепатита B индуцируют фенотипическое созревание ДК, вызывают слабое усиление их способности стимулировать продукцию IFNy и не влияют на способность ДК стимулировать продукцию TNFa, интерлейкина (IL)-5 и IL-17 лимфоцитами.
Ключевые слова: вакцины, дендритные клетки, лимфоциты, цитокины M.VPlekhanova, V.Yu Talayev, O.N. Babaykina, I.Ye. Zaichenko, E.I. Ephimov
THE ACTION OF BCG AND HEPATITIS B VACCINES ON PHENOTYPIC AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF THE NEWBORN'S DENDRITIC CELLS IN VITRO
BCG vaccine induces the phenotypic maturation of adult and newborn dendritic cells in vitro and strong increases their ability to stimulate interferon-Y production by lymphocytes. BCG enhances the ability of adult's dendritic cells to stimulate tumor necrosis factor-a production by lymphocytes and has not any effect on current parameter of newborn dendritic cells. Hepatitis B vaccines induce the phenotypic maturation of dendritic cells, weakly increase their ability to stimulate interferon-Y production and do not influence upon dendritic cell ability to stimulate production of tumor necrosis factor-a, IL-5 and IL-17 by lymphocytes.
Keywords: vaccine, dendritic cells, lymphocyte, cytokines
Введение. Эффективность вакцин определяется их способностью активировать специфичные к антигенам инфекционного агента лимфоциты, вызывая их размножение и созревание в клетки иммунологической памяти. Как известно, активация Т-лимфоцитов антигенами осуществляется с помощью анти-генпрезентирующих клеток (АПК), причем при индукции первичного иммунного ответа эту роль должны выполнять наиболее активные АПК, именуемые дендритными клетками (ДК) [2, 10, 23, 25]. Основной задачей незрелых миелоидных ДК, рассеянных по различным тканям организма, является
Плеханова Мария Владимировна - науч. сотр., тел. 8(831) 434-24-82, e-mail: talaev@inbox.ru
сбор антигенного материала за счет фагоцитоза и макропино-цитоза [10, 12, 19]. Для обнаружения признаков инфекции ДК снабжены рецепторами к молекулярным паттернам патогенов (МПП) - относительно немногочисленным, но высококонсервативным и соответственно широко распространенным молекулам микроорганизмов [3, 11]. Поглощение микроорганизмов и сопутствующее этому распознавание МПП ведут к созреванию ДК, в результате чего они приобретают необходимые для презентации антигенов свойства и мигрируют с током лимфы в Т-клеточные зоны лимфатических узлов для последующей идентификации собранных антигенов Т-лимфоцитами. Активация лимфоцитов вызывает запуск иммунного ответа, после завершения которого остается значительное количество функционально зрелых антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов, которые будут обеспечивать иммунологическую память [4].
- 311 -
