CC BY
46
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 6l6.36-002.4:6l6-006.3-091.8]:6l6-002.2
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ФИБРОЗА ПЕЧЕНИ НА ФОНЕ ФОРМИРОВАНИЯ СИНДРОМА ДИСТРОФИЧЕСКИ-ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ
И.П. Жураковский, С.А. Архипов, М.Г. Пустоветова, Т.А. Кунц, М.В. Битхаева, И.О. Маринкин
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России
E-mail: [email protected]
FEATURES OF LIVER FIBROSIS DEVELOPMENT IN FORMING OF DYSTROPHIC DEGENERATIVE MESENCHYMAL DERIVATIVES CHANGES IN LOCAL CHRONIC INFLAMMATORY PROCESS
I.P. Zhurakovsky, S.A. Arkhypov, M.G. Pustovetova, T.A. Kunts, M.V. Bitkhaeva, I.O. Marinkin
Novosibirsk State Medical University
Изучено развитие фиброза печени на фоне формирования синдрома дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе у 12 крыс-самцов Вистар с моделью вторичной дезорганизации соединительной ткани. В качестве контроля использовали 6 интак-тных животных. Полученные данные свидетельствуют о возможности существования дополнительного механизма развития фиброза печени при наличии фокальной персистирующей инфекции. Так, наряду с классическим вариантом развития фиброза, реализующимся вследствие активации макрофагами звездчатых клеток печени, присутствует альтернативный механизм, заключающийся в активировании фибробластов портальных трактов тучными клетками.
Ключевые слова: фиброз печени, коллаген, гликозаминогликаны, пролиферация фибробластов, тучные клетки, Ki-67.
Liver fibrosis development in forming of dystrophic degenerative mesenchymal derivatives changes in local chronic inflammatory process was investigated in 12 male Wistar rats with secondary disorganization connective tissue model. 6 intact animals were used as a control. Findings suggest possibility that additional fibrosis development mechanism exists at the presence of focal persisting infection. Besides classic variant of fibrosis development realized through stellate cells activation by macrofages we suppose alternative mechanism that consists in fibroblasts activation in portal tracts by means of mast cells.
Key words: liver fibrosis, collagen, glicosaminoglicans, fibroblasts proliferation, mast cells, Ki-67.
Введение
Фиброз печени характеризуется избыточным развитием соединительной ткани в результате повторных и/или длительных повреждений, воздействующих на орган. При его развитии преимущественно нарастает содержание коллагенов I, V, VI типов, ламинина, эластина, гликозаминогликанов [3].
В настоящее время является установленной следующая последовательность развития фиброза печени. Так, при гепатитах различной этиологии в результате повреж-
дения гепатоцитов из них выделяются различные биологически активные вещества, включающие перекиси и протеазы. Эти вещества активируют макрофаги печени, а также эндотелий синусоидов. Активированные клетки, в свою очередь, начинают секретировать биологически активные вещества, вызывающие активацию звездчатых клеток. К разряду подобных веществ относятся провос-палительные цитокины - интерлейкин-1 (К-1), фактор некроза опухоли альфа (ШБа), перекиси, оксид азота, эндотелин, но главная роль в активации звездчатых клеток принадлежит тромбоцитактивирующему фактору
(РБОБ), активатору плазминогена, трансформирующему фактору роста бета 1 (ТОБр1). Под их воздействием звездчатые клетки выходят из состояния покоя, становятся активированными и трансформируются в миофиброб-ластоподобный фенотип, приобретая способность к продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагена и протеогликанов. Однако вопрос возможности развития фиброзных изменений на фоне формирования синдрома дистрофически-дегенератив-ных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе остается открытым, поскольку в этом случае выраженных деструктивных изменений гепатоцитов не наблюдается. В этой связи является актуальным изучение возможности развития фиброза печени путем задействования дополнительных альтернативных механизмов.
Материал и методы
Эксперимент проведен на 18 половозрелых крысах-самцах Вистар с исходной массой 180-220 г, у 12 из которых с помощью Золотистого стафилококка (штамм 209) воспроизведена адаптированная для мелких лабораторных животных модель вторичной дезорганизации соединительной ткани [1]. Животных выводили из эксперимента через 2 и 3 мес. Группу контроля составляли 6 интактных животных. Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.
Объекты печени фиксировали в 12% формалине и жидкости Теллесницкого. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм. Коллагеновые волокна выявлялись пикрофуксином по Ван Гизону; сульфатированные гликозаминогликаны - альциановым синим при рН 1,0; популяция тучных клеток оценивалась после окраски препаратов альциановым синим при рН 1,25 без или с последующей докраской кармалюмом Майера. Популяция звездчатых клеток печени оценивалась
на полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим. Для изучения маркера пролиферации Ki-67 (белка, эксп-рессирующегоуся на всех стадиях клеточного цикла, кроме G0) использовали двухэтапный иммуногистохимичес-кий метод.
С помощью программного обеспечения ImageJ 1.42g (National institutes of Health, USA) определялась площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами и сульфатирован-ными гликозаминогликанами в области триад, образованных вокругдольковыми и междольковыми сосудами. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICA 6.0: высчитывали средние величины (M) и их стандартные ошибки (m). Достоверность различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при 95-процентном уровне значимости.
Результаты и обсуждение
На срезах печени через 2 мес. после воспроизведения очага хронического воспаления, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону, отмечалось достоверное увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми) сосудами на 161,4%, так и более крупными (междольковыми) сосудами - на 98,8% по сравнению с интактными животными, таблица.
При окраске альциановым синим отмечалось достоверное увеличение площади сульфатированных гликоза-миногликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных междольковыми сосудами на 37,6% по сравнению с интактными животными. При этом достоверных отличий в распределении хонд-роитинсульфатов в области триад, образованных более мелкими (вокругдольковыми) сосудами не отмечалось.
Необходимо отметить, что в печени данной группы крыс отмечалось достоверное увеличение популяции звездчатых клеток по сравнению с интактными животными (на 220,0%), рисунок 1.
Таблица
Площади коллагеновых волокон и сульфатированных гликозаминогликанов в области портальных трактов, стенках и окружении центральных вен в мкм2 (M±m)
Площади Интактные животные Через 2 мес. после создания модели Через 3 мес. после создания модели
Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в портальных трактах, образованных вокругдольковыми сосудами 155,64+17,54 406,8732,96* 1584,12+105,46*
Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в портальных трактах, образованных междольковыми сосудами 910,97+98,03 1810,86+193,49* 5606,39+496,87*
Площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами в стенках и окружении центральных вен 188,70+18,10 457,8540,08* 2654,30+314,46*
Площадь, занимаемая сульфатированными гликозаминогликанами в портальных трактах, образованных вокругдольковыми сосудами 225,92+14,97 209,4815,07 273,16+13,91*
Площадь, занимаемая сульфатированными гликозаминогликанами в портальных трактах, образованных междольковыми сосудами 991,65+85,44 1364,0481,49* 1278,82+104,83*
Площадь, занимаемая сульфатированными гликозаминогликанами в стенках и окружении центральных вен 87,00+5,44 209,18+15,58* 235,53+18,88*
Примечание: * - значимость различий с интактными животными при р<0,05.
и кг В 2 мес В Змее
Рис. 1. Количество звездчатых клеток печени у интактных животных и при воспроизведении модели вторичной дезорганизации соединительной ткани на площади 500000 мкм2
Вместе с тем при изучении экспрессии маркера пролиферативной активности клеток отмечалось некоторое увеличение количества фибробластов, экспрессирующих Ю-67 в ядрах, что могло свидетельствовать о начале развития фиброзных процессов. При оценке популяции тучных клеток на срезах, окрашенных альциановым синим при рН 1,25, было отмечено возросшее, по сравнению с контролем, количество масто-цитов в области триад.
Через 3 мес. после воспроизведения модели на срезах печени, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону, отмечалось выраженное, более чем в 10 раз увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных мелкими (вокругдольковыми) сосудами. В междольковых сосудах площадь коллагеновых волокон возрасла более чем в 6 раз по сравнению с интактными животными. На срезах, окрашенных альциановым синим, в отличие от предыдущего срока отмечалось достоверное увеличение площади сульфатированных гликозаминоглика-нов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных вокругдольковыми сосудами на 20,9% по сравнению с интактными животными. Распределение хондроитинсульфатов в области триад, образованных более крупными (междольковыми) сосудами также было достоверно увеличенным (на 29,0%). Морфометрическая оценка популяции звездчатых клеток позволила выявить их достоверное увеличение по сравнению с интактными животными (на 230,1%).
При оценке маркера пролиферативной активности клеток отмечалось существенное увеличение количества фибробластов, экспрессирующих Ю-67 в ядрах, что может свидетельствовать о развитии фиброзных процессов. При этом количество тучных клеток в области триад сохранялось существенно повышенным.
Достаточно существенным является тот факт, что при персистенции бактериальной инфекции наблюдается морфологическая картина сочетания венулярного и пе-рипортального фиброза. Не исключено, что это может быть связано как с теми биологически активными веществами, которые в большом количестве присутствуют в крови при воспалительном процессе, так и с цитокина-ми клеток воспалительных инфильтратов, локализованных в портальных трактах. При других вариантах развития фиброза печени, когда синтез коллагена осуществляется преимущественно клетками Ито, расположенных в пространстве Диссе, отмечается, особенно на начальных этапах, перицеллюлярный фиброз [3].
Определенную роль в развитии фиброза печени при персистенции бактериальной инфекции, по-видимому, играет наблюдаемая нами рекрутизация тучных клеток в портальные тракты. На эту возможность обращается внимание в ряде исследований, посвященных изучению взаимодействия мастоцитов и фибробластов при других па-
тологических состояниях [5, 8], при этом отмечается, что тучные клетки могут стимулировать как пролиферативную активность фибробластов, так и выработку ими внеклеточного матрикса [4, 6, 7].
Заключение
Таким образом, настоящее исследование позволило выявить некоторые особенности развития фиброза печени при формировании синдрома дистрофически-де-генеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе. Так, наряду с классическим вариантом развития фиброза, реализующимся вследствие активации макрофагами звездчатых клеток печени, присутствует альтернативный механизм, заключающийся в активировании фибробла-стов портальных трактов тучными клетками. Это может быть связано, с одной стороны, с умеренными деструктивными процессами в паренхиме печени, что не позволяет в полной мере реализоваться классическому варианту. С другой стороны, при наличии очага хронического воспаления происходят вторичные изменения мезенхимальных производных, выражающиеся в разрастании соединительной ткани в органах с достаточной васкуля-ризацией, в отличие от брадитрофных тканей, где преобладают дистрофически-дегенеративные изменения [2]. Полученые данные подтверждают возможность участия тучных клеток в процессе развития фиброза печени при наличии отдаленного очага хронической инфекции. Это может служить поводом к поиску специальных методов защиты паренхиматозных органов при развитии синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе.
Литература
1. Жураковский И.П., Рыжов А.И., Мичурина С.В. Способ моде-
лирования вторичной дезорганизации соединительной ткани : пат. 2307397 Рос. Федерации ; опубл. 27.09.2007, Бюл. № 27.
2. Команденко Н.И., Рыжов А.И., Жураковский И.П. Остеохондроз позвоночника : монография. - Новосибирск : Сибмед-издат НГМУ, 2006. - 246 с.
3. Павлов Ч.С., Шульпекова Ю.О., Золотаревский В.Б. и др. Современные представления о патогенезе, диагностике и лечении фиброза печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2005. - № 2. -С. 13-20.
4. Berton A., Levi-Schaffer F., Emonard H. et al. Activation of fibroblasts in collagen lattices by mast cell extract: a model of fibrosis // Clin. Exp. Allergy. - 2000. - Vol. 30. - P. 485-492.
5. Diegelmann R.F, Evans M.C. Wound healing: an overview of acute, fibrotic and delayed healing // Front Biosci. - 2004. -Vol. 9. - P. 283-289.
6. Garbuzenko E., Nagler A., Pickholtz D. et al. Human mast cells stimulate fibroblast proliferation, collagen synthesis and lattice contraction: a direct role for mast cells in skin fibrosis // Clin. Exp. Allergy. - 2002. - Vol. 32. - P. 237-246.
7. Garbuzenko E., Berkman N., Puxeddu I. et al. Mast cells induce activation of human lung fibroblasts in vitro // Exp. Lung. Res. - 2004. - Vol. 30. - P. 705-721.
8. Gruber B.L. Mast cells in the pathogenesis of fibrosis // Curr. Rheumatol. Rep. - 2003. - Vol. 5. - P. 147-153.
Поступила 31-03-2011
