CC BY
66
© ЖУРАКОВСКИЙ И. П., АРХИПОВ С.А., ПУСТОВЕТОВА М. Г., КУНЦ Т. А., БИТХАЕВА М.В., МАРИНКИН И.О.
УДК 616-006.3-091.8-615.357] :616-002.2
АНТИФИБРОТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ МЕЛАТОНИНА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ СИНДРОМА СОЧЕТАННЫХ ДИСТРОФИЧЕСКИ-ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛИТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ И. П. Жураковский, С. А. Архипов, М. Г. Пустоветова, Т. А. Кунц,
М.В. Битхаева, И.О. Маринкин Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; Центральная научно-исследовательская лаборатория НГМУ, рук. - д.м.н., проф. М.Г. Пустоветова.
Резюме. На 24 половозрелых крысах-самцах Вистар, у которых была воспроизведена адаптированная для мелких лабораторных животных модель вторичной дезорганизации соединительной ткани, изучено влияние мелатонина на развитие фиброзных изменений в печени. В качестве группы контроля служили интактные животные аналогичного возраста. Определялась площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами (после окраски пикрофуксином по Ван Гизону) и сульфатированными гликозаминогликанами (после окраски альциано-вым синим при рН 1,0) в области триад, стенках и окружении центральных вен. Для изучения маркера пролиферации К1-67 использовали двухэтапный им-муногистохимический метод. Полученные данные свидетельствуют, что применение мелатонина препятствует пролиферации фибробластов и синтезу ими коллагена и хондроитинсульфатов.
Ключевые слова: мелатонин, фиброз печени, хондроитинсульфаты, коллаген, фибробласты, К1-67.
Жураковский Игорь Павлович - к.м.н., ст.н.с. ЦНИЛ НГМУ; e-mail: murash2003 @yandex.ru.
Архипов Сергей Алексеевич - д.м.н., ст.н.с. ЦНИЛ НГМУ e-mail: [email protected].
Пустоветова Мария Геннадьевна - д.м.н., проф., зав ЦНИЛ НГМУ e-mail: [email protected].
Длительное существование фокальной персистирующей инфекции вызывает определенное изменение функционирования основных гомеостатических систем и, как следствие, структурную перестройку органов и тканей организма. Описан синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе [2], основным составляющим компонентом которого является реакция соединительной ткани [3]. Как показывает клиническая практика, при наличии очагов хронической инфекции часто диагностируется полиорганная патология, связанная с усиленным фиброгенезом на фоне неспецифических реактивных воспалительных процессов.
В настоящее время на моделях острого повреждения печени показано, что гормон эпифиза - мелатонин оказывает цитопротективный эффект за счет своей антиоксидантной способности, препятствуя гибели гепатоцитов, что в свою очередь ведет к меньшей выраженности фиброза печени [7,8], однако вопрос применения мелатонина для профилактики поражения печени при формировании синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе остается не изученным.
Цель исследования: изучить возможность использования
антифибротического эффекта мелатонина при формировании синдрома
сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе.
Материалы и методы
Исследования были проведены на 30 половозрелых крысах-самцах Вистар. Первую группу составляли интактные животные. У остальных животных с помощью золотистого стафилококка была воспроизведена адаптированная для мелких лабораторных животных модель вторичной дезорганизации соединительной ткани [5]. Во 2-ю группу вошли животные через два месяца от момента воспроизведения у них хронического воспаления; в 3-ю - животные через два месяца от момента воспроизведения у них хронического воспаления, которым внутрибрюшинно вводили мелатонин в дозе 1 мг/кг веса в течение семи дней; в 4-ю - животные через три месяца от момента воспроизведения у них хронического воспаления; в 5-ю - животные также через три месяца от момента воспроизведения у них хронического воспаления, но в отличие от предыдущей группы, через месяц после окончания введения мелатонина по схеме аналогичной для третьей группы.
Печень фиксировали в 12% формалине и жидкости Теллесницкого. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм. Состояние паренхимы печени оценивалось при обзорной микроскопии после окраски срезов гематоксилином Эрлиха и эозином. Коллагеновые волокна выявлялись пик-рофуксином по Ван Гизону, сульфатированные гликозаминогликаны - альциа-новым синим при рН 1,0. Для изучения маркера пролиферации Ki-67 (белка экспрессирующегося на всех стадиях клеточного цикла, кроме G0) использовали двухэтапный иммуногистохимический метод. С помощью программного обеспечения ImageJ 1,42g (National institutes of Health, USA) определялась площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами и сульфатированными гликоза-миногликанами в области триад, образованных вокругдольковыми, междолько-выми сосудами, стенках и окружении центральных вен. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Statistica v.6»: определяла средние величины (M) и их стандартные ошибки (± m). Достоверность
различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни при 95% уровне значимости.
Результаты и обсуждение
При изучении срезов печени, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином через 2 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции, обращали на себя внимание имевшие место микроциркуляторные нарушения, сопровождающие застойные явления в системе печеночных вен; умеренные дистрофические изменения паренхиматозных клеток; легкая воспалительная реакция, проявлявшаяся в концентрации лимфоидных элементов в местах скопления дистрофически измененных гепатоцитов.
Кроме того, на срезах печени, окрашенных альциановым синим, отмечалось достоверное увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных меж-дольковыми сосудами (табл. 1). Обращало на себя внимание, что значимых различий между группами 1 и 2 в распределении хондроитинсульфатов в области триад, образованных более мелкими (вокругдольковыми) сосудами, не отмечалось. Площадь сульфатированных гликозаминогликанов в стенках и окружении центральных вен была достоверно выше (на 140,4% от соответствующей площади в группе интактных животных).
На срезах печени, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону (табл. 2), отмечалось достоверное, по отношению к контрольной группе, увеличение площади, занимаемой коллагеновыми волокнами в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми) сосудами, так и более крупными (междоль-ковыми) сосудами. Было выявлено достоверное возрастание площади, занимаемой коллагеновыми волокнами в стенках и окружении центральных вен у животных 2-й группы по сравнению с контролем на 142,6%. При оценке маркера пролиферативной активности клеток, отмечалось некоторое увеличение количества фибробластов, экспрессирующих К1-67 в ядрах, что может свидетельствовать о начале развития фиброзных процессов.
При изучении морфологической картины срезов печени в аналогичный срок у группы с проведенным курсом введения мелатонина (3 группа), отмечалась нормализация микроциркуляции на фоне улучшения кровообращения в системе печеночных вен; уменьшение признаков тканевой гипоксии, сопровождающейся лишь незначительными дистрофическими изменениями гепатоцитов; отсутствие воспалительной реакции.
В 3-й группе на срезах печени, окрашенных альциановым синим, площадь сульфатированных гликозаминогликанов в стенках и окружении центральных вен достоверно не отличалась от контроля. Указанная площадь в группе животных, которым вводился мелатонин (3-я группа), достоверно снизилась по отношению к группе животных без введения мелатонина (группа 2) и составила 50,7% от нее.
В 3-й группе животных на срезах, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизо-ну, отмечается достоверное по отношению ко 2-й группе снижение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми), так и более крупными (междольковыми) сосудами. Указанная площадь в 3-й группе не отличается достоверно от показателей 1-й группы, что свидетельствует об эффективность воздействия мелатонина. На срезах 3-й группы также было выявлено достоверное по отношению ко 2-й группе снижение площади коллагеновых волокон в стенках и окружении центральных вен. При этом в области триад отмечалось уменьшение количества фибробластов, экспрессирующих Ki-67 в ядрах, что свидетельствовало о снижении пролиферативной активности этих клеток.
При оценке паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в печени через 3 месяца после воспроизведения очага хронической инфекции (4 группа) отмечались следующие изменения: сохранялись выраженные микроциркуляторные нарушения, сопровождающие застойные явления в системе печеночных вен; умеренные дистрофические изменения паренхиматозных клеток; легкая воспалительная реакция; выраженное разрастание соединительной ткани в области триад и окружении центральных вен.
Так, на срезах 4-й группы, окрашенных альциановым синим, отмечалось достоверное по отношению к 1-й группе увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных вокругдольковыми, междольковыми сосудами, а также в стенках и окружении центральных вен. На срезах 4-й группы, окрашенных пик-рофуксином по Ван Гизону, отмечалось достоверное по отношению к 1-й группе увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных вокругдольковыми, междоль-ковыми сосудами, а также в стенках и окружении центральных вен. При оценке маркера пролиферативной активности клеток, отмечалось существенное увеличение количества фибробластов, экспрессирующих Ki-67 в ядрах, что может свидетельствовать о развитии фиброзных процессов.
Через 1 месяц после проведенного курса введения мелатонина, в группе животных с воспроизведенным 3 месяца назад хроническим воспалительным процессом (группа 5), при изучении срезов печени, окрашенных гематоксилином Эрлиха и эозином, на фоне общего сохранения структуры печени отмечалась сохраняющаяся нормализация микроциркуляции на фоне улучшения кровообращения в системе печеночных вен; отсутствие признаков тканевой гипоксии; наличии репаративной реакции в виде увеличении количества двуядерных ге-патоцитов; отсутствие воспалительной реакции.
На срезах, окрашенных альциановым синим, площадь, занимаемая сульфа-тированными гликозаминогликанами в стенках и окружении центральных вен, была достоверно ниже аналогичного показателя у животных, не получавших курс коррекции мелатонином, и составляла 67,8% от него.
На срезах 5-й группы, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону, наблюдается достоверное по отношению к 4-й группе снижение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных мелкими (вокругдольковыми), более крупными (междольковыми) сосудами, а также в стенках и окружении центральных вен. Причем указанные
площади в группе 5 настолько приближаются к контролю (группа 1), что различия между ними не являются достоверными.
При этом в области триад не отмечалось увеличения количества фибробла-стов, экспрессирующих Кь67 в ядрах, что может свидетельствовать об отсутствии стимуляции фиброзных процессов в печени. Кроме того, отмечено, что в печени крыс 5-й группы, по сравнению с 4-й, возрастает количество гепатоци-тов, экспрессирующих цитоплазматический Кь67. Также выявлялись гепатоци-ты с ядерной окраской на этот маркер, в том числе и диплокариоциты. При этом необходимо учитывать, что экспрессия Кь67 в ядрах характерна для позднего периода 02-фазы клеточного цикла пролиферирующих клеток. Это может свидетельствовать об активизации регенераторных восстановительных процессах в печени.
Таким образом, приведенные данные показывают, что применение мелатонина не только предотвращает поражение печени в виде дисциркуляторных нарушений, ведущей к дистрофии гепатоцитов, но и препятствует разрастанию соединительной ткани в области триад, склерозированию сосудов печеночных вен, которые наблюдаются при развитии синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе.
Необходимо отметить, что в классическом случае развития фиброза печени, когда этиологический фактор действует непосредственно на орган, пусковым фактором является гибель паренхиматозных элементов [1]. В результате повреждения гепатоцитов из них выделяются биологически активные вещества, включающие перекиси и протеазы. Эти вещества активируют макрофаги печени, а также клетки эндотелия синусоидов. Активированные клетки, в свою очередь, начинают секретировать биологически активные вещества, вызывающие активацию клеток Ито. Под их воздействием звездчатые клетки печени выходят из состояния покоя и трансформируются в миофибробластоподобный фенотип, приобретая способность к продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагена и протеогликанов [4, 6].
При развитии синдрома дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном воспалительном процессе наблюдается несколько иная ситуация, поскольку выраженной гибели клеточных элементов печени не отмечается. В этом случае происходит активация фибробластов с последующей их пролиферацией и повышенном синтезом ими коллагена.
В данных условиях, как показано в настоящем исследовании, применение мелатонина также сопровождается замедлением скорости разрастания соединительной ткани в области триад и предупреждением склерозирования сосудов печеночных вен.
ANTIFIBROTIC EFFECT OF MELATONIN DURING THE COMBINE DYSTROPHIC AND DEGENERATIVE PATHOLOGY DEVELOPMENT IN LOCAL CHRONIC INFLAMMATORY PROCESS
I. P. Zhurakovsky, S. A. Arkhypov, M. G. Pustovetova, T. A. Kunts, M.V.
Bitkhaeva, I. O. Marinkin Novosibirsk State Medical University Abstract. We studied influence of melatonin on development of fibroses in liver of 24 mature Vistar male rats. The model of secondary disorganization in connective tissue was adapted for small laboratory animals. Intact age-matched animals were the control group. We determined area occupied by collage fibers (after Van Gieson’spicrofuchsin staining) and sulfated glycosaminoglycanes (after alcian blue staining in pH=1.0) in the regions of triads, vessels walls and surroundings. The two stage immunochistochemical method was applied to study proliferation marker Ki-67. Our data showed that melatonin prevents fibroblasts proliferation, collagen and chondroitinsulfat synthesis.
Key words: melatonin, liver fibrosis, chondroitinsulfats, collagen, fibroblasts, Ki-67.
Литература
1. Айдагулова С.В., Капустина В.И. Полиморфизм звездчатых клеток печени и их роль в фиброгенезе / Бюлл. СО РАМН. - 2008. - Т. 134, №6. - С. 93-97.
2. Команденко Н.И., Жураковский И.П., Рыжов А.И. Синдром сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений в производных мезенхимы при воздействии фокальной персистирующей инфекции / Свидетельство об интеллектуальной собственности, зарегистрированное ВНТИЦ 07.08.2002г. №72200200029.
3. Команденко Н.И., Рыжов А. И., Жураковский И.П. Остеохондроз позвоночника. - Новосибирск: Сибмедиздат НГМУ, 2006. - 246с.
4. Павлов Ч.С., Шульпекова Ю.О., Золотаревский В.Б. и др. Современные представления о патогенезе, диагностике и лечении фиброза печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. - 2005. - №2. - С. 1320.
5. Пат. 2307397 Рос. Федерация. Способ моделирования вторичной дезорганизации соединительной ткани / И.П. Жураковский, А.И. Рыжов, С.В. Мичурина. - №205110004; опубл. 27.09.2007. - Бюл. №27. - 3с.
6. Gutierrez-Ruiz M.C., Gomez-Quiroz L.E. Liver fibrosis: searching for cell model answers // Liver Intern. - 2007. - №10. - Р. 434-439.
7. Hong R.T., Xu J.M., Mei Q. Melatonin ameliorates experimental hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats // World J. Gastroenterol. - 2009. -Vol. 15, №12. - P.1452-1458.
8. Tahan G., Akin H., Aydogan F. Melatonin ameliorates liver fibrosis induced by bile-duct ligation in rats // Can. J. Surg. - 2010. - Vol. 53, №5. - P.313-318.
