CC BY
75
Н. А. Костин, Н. Г. Сафарьянц
ОСОБЕННОСТИ РАННЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА НЕОкортексА мозга крысы Введение
Проблема формирования мозга в онтогенезе — одна из приоритетных в медицине и биологии. Большое число клинических наблюдений и экспериментальных исследований на животных свидетельствуют о том, что воздействия неблагоприятных факторов среды в определенные периоды дифференцировки мозга (так называемые критические периоды) оставляют длительный след, создают основу для развития многообразных патологий ЦНС [1]. С появлением в арсенале нейроморфологов новых методов, возможности исследования мозга значительно расширились. В последние два десятилетия классификацию корковых нейронов успешно осуществляют с помощью молекулярных маркеров, которые позволяют не только выделять определенные морфотипы клеток, но и получать сведения об их функциональных особенностях. Так, морфологически единая популяция пирамидных клеток неоднородна по экспрессии генов и, соответственно, по синтезируемым белкам. Подобная гетерогенность позволяет отличать нейроны образующие кортико-фугальные (кортикоспинальные, кортикотектальные, кортикобульбарные, кортикоталамические) связи от нейронов, инициирующих кортико-кор-тикальные (внутрикорковые, внутри- и межполушарные) связи [2].
Принимая во внимание важное значение структурных признаков, характеризующих последовательные этапы кортикогенеза, целью настоящей работы было изучение особенностей цитоархитектоники и дифференцировки пирамидных нейронов неокортекса мозга крысы на ранних этапах постнатального развития.
материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужили фронтальные срезы мозга крыс возрастом 1, 7, 15 и 20 дней постнатального онтогенеза, по 4 мозга на каждый обозначенный срок. Мозг фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида на 0,1М фосфатном буфере, pН 7,4 и заливали в парафин. Срезы толщиной 12 мкм депарафинизировали и окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля по стандартной схеме. Исследовали развитие сенсомоторной коры правого и левого полушарий конечного мозга. Для идентификации области исследования использовали атлас мозга крысы [3].
Для выявления клеток, приступивших к дифференцировке, использовался непрямой метод иммуногистохимии с применением антител к белкам МАР2 и N200. Этот метод позволяет визуализировать реакцию антиген-антитело на гистологических срезах. Антитела, меченные флуорохромом, дают возможность идентифицировать компоненты клеточных структур, выступающие в качестве антигена. Использовали первичные моноклональные антитела кролика против белка MAP2 и моноклональные антитела
© Н. А. Костин, Н. Г. Сафарьянц, 2011
мыши против белка N200, а также вторичные антитела, коньюгированные с флуорес-цином (Alexa 488 Goat anti-Mouse и Alexa 568 Goat anti-Rabbit). Препараты заключали в 80%-ный глицерин с добавленем DAPI, который окрашивает клеточные ядра. Препараты исследовали на флуоресцентном микроскопе Leica DM6000 B и конфокальном микроскопе Leica TCS SPE. Морфометрические исследования проводили с помощью программы анализа изображений ImagеJ. В качестве показателя размера клетки использовали площадь ее профильного поля. Для этого каждый из нейронов исследуемого участка коры обводили по периметру, при этом автоматически регистрировались две его характеристики — площадь профильного поля и глубина залегания от пиальной поверхности полушария. Наличие корреляции между этими двумя параметрами определяли при помощи программы Microsoft Excel.
результаты исследования и их обсуждение
Исследование цитоархитектоники на препаратах, окрашенных по методу Ниссля, показало, что в сенсомоторной коре мозга новорожденного животного выделяются формации препластинки — поверхностная маргинальная зона и субпластинка на границе с белым веществом, а также расположенная между ними, еще не разделенная на слои, корковая пластинка. Иммуногистохимическое маркирование с антителами к МАР2 позволило выявить клетки, синтезирующие этот белок, только в составе субпластинки коры мозга.
В отличие от новорожденнных, в коре мозга семидневных животных намечается стратификация корковой пластинки: по границе с маргинальной зоной отчетливо дифференцируется плотноклеточный слой II, ниже — более разреженный комплекс слоев III-V и подстилающий его слой VI. Кластерный анализ по двум, автоматически регистрируемым параметрам — площади профильного поля и глубине залегания клетки, показал наличие корреляции между этими характеристиками. Точечная диаграмма наглядно демонстрирует возможность выделения следующих кластеров в пределах корковой пластинки: первый кластер совпадает с густо- и мелкоклеточным слоем II, который расположен на глубине 100-150 мкм от поверхности коры и состоит из клеток размером 17-38 мкм2; следующий кластер, аналогичный комплексу слоев III-V, распространяется на глубину от 150 до 350 мкм. Составляющие этот кластер нейроны сначала увеличиваются, а затем уменьшаются в размере: размер клеток на границе со слоем II составляет 20-40 мкм2 , на границе со слоем VI — 20-55 мкм2, в наиболее крупноклеточном участке на глубине 300 мкм — до 90 мкм2. Третий кластер соответствует слою VI и залегает на глубине от 350 до 420 мкм, он сформирован мелкими и средними нейронами размером от 20 до 55 мкм2 (рис. 1, а). Достоверность выделения кластеров при p<0,05.
Иммуногистохимическое исследование коры мозга семидневного животного указывает на то, что к седьмому дню постнатального развития МАР2-позитивные нейроны присутствуют не только в субпластинке, но и в составе корковой пластинки. Для того чтобы определить локализацию таких клеток, дополнительно к иммуногистохи-мической обработке проводилось подкрашивание срезов флуоресцентным красителем клеточных ядер DAPI. Этот способ окрашивания дает возможность различать слои по плотности клеточных ядер и дифференцировать в сенсомоторной коре семидневных животных маргинальную зону, слои корковой пластинки и субпластинку. МАР2 и DAPI обладают разными спектрами испускания и поглощения света, поэтому использование
Рис. 1. Точечные диаграммы распределения нейронов по поперечнику сенсомотор-ной коры мозга крысы:
а — 7-дневной; б — 15-дневной; в — 20-дневной.
лазеров с разной длиной излучаемой волны позволило раздельно регистрировать эти флуорохромы: синюю окраску ядер БАР1 и зеленые МАР2-позитивные нейроны. Последующее совмещение таких изображений позволяет локализовать МАР2-позитивные клетки в пределах определенного слоя коры, у семидневных животных такие нейроны обнаружены в слое VI и в нижней части комплекса слоев Ш-У. По морфологическим признакам — форме тела и длинному апикальному дендриту — все МАР2-позитивные нейроны идентифицированы как пирамидные (рис. 2).
К 15-му постнатальному дню в сенсомоторной коре мозга крыс наблюдается дальнейшее усложнение стратификации коры за счет того, что в едином слое 111-У появляется пока еще слабо намеченный мелкоклеточный слой IV. В результате, к этому сроку в коре удается дифференцировать семь слоев: слой I, или маргинальную зону; слои II, III, IV, V, VI и субпластинку. Кластерный анализ подтверждает усложнение стратифи-
кации коры появлением дополнительной группы, которая соответствует слою IV. Таким образом, кластер, соответствующий слою II, залегает на глубине от 100 до 150 мкм. Он представлен клетками размером от 28 до 60 мкм2. Кластер на глубине 150-250 мкм соответствует слою III и образован клетками с площадью профильного поля 40-85 мкм2. Следующий кластер, аналогичный слою IV, залегает на глубине 250-350 мкм и состоит из клеток размером 20-45 мкм2.
Кластер, соответствующий слою V, занимает уровень от 350 до 680 мкм и образован нейронами размером 40-180 мкм2.
Слою VI соответствует кластер на глубине 680-730 мкм от поверхности коры, состоящий из клеток с площадью профильного поля от 30 до 80 мкм2 (рис. 1, б). Иммуногисто-химическое исследование сенсомоторной коры 15-дневных животных показало, что МАР2-позитивные пирамидные клетки у животных этого возраста присутствуют в слоях V и VI.
У 20-дневных крыс происходит дальнейшее увеличение толщины коры до 810 мкм, против 730 мкм у 15-дневных, причем в основном за счет слоев III и V. На точечных диаграммах отмечено также более четкое выделение границ кластеров, соответствующих этим слоям (рис. 1, в).
При сопоставлении средних площадей профильных полей показано, что в первые три недели постнатального развития нейроны сенсомоторной коры мозга крысы закономерно увеличиваются, причем особенно в слоях III и V (рис. 3). При установлении достоверности различий полученных данных использован метод АМСУА, р<0,05.
Иммуногистохимическое исследование сенсомоторной коры мозга 20-дневной крысы было проведено с использованием антител к белкам МАР2 и N200. МАР2-позитив-ные нейроны выявлены в слоях III, V и VI. Все маркированные клетки классифицированы как пирамидные: их апикальные дендриты удалось проследить вплоть до первого
Рис. 2. МАР2-позитив-ный нейрон слоя V
Конфокальный микроскоп. Шкала: 10 мкм.
7 дней
20 дней
15 дней Сроки развития
Рис. 3. Изменения средних размеров нейронов сенсомоторной коры мозга крысы на разных сроках постнатального онтогенеза
II, III, IV, V — слои коры (то же для рис. 4). Достоверность различий, р=0,05.
слоя коры, где они веерообразно ветвились, базальные — короткие и слабо ветвящиеся отходили от основания сомы (рис. 4). Ш00-позитивные пирамидные нейроны обнаружены только в слое V, причем в меньшем количестве, чем МАР2-позитивные. У всех Ш00-позитивных клеток отмечена колокализация с белком МАР2 (рис. 5).
Рис. 5. МАР2- и №00-позитивные нейроны в слое V сенсомоторной коры мозга 20-дневной крысы:
а — МАР2-позитивные нейроны; б — М200-позитивные нейроны; в — колокализация белков МАР2 и N200. Шкала: 50 мкм.
Рис. 4. МАР2-позитивные нейроны коры 8р — субпластинка. Шкала: 100 мкм.
Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что в течение первых недель постнатального онтогенеза в сенсомоторной коре мозга крыс наблюдается постепенное усложнение стратификации, причем за счет тех слоев, которые образуются
в корковой пластинке. Кластерный и морфометрический анализы, а также графическое представление объективно подтверждают это.
На фоне начинающегося расслоения коры в нижних ее слоях появляются первые МАР2-позитивные пирамидные нейроны. Известно, что в процессе нейрогенеза некоторые из белков синтезируются только нейронами (но не нейробластами и глиальными клетками), в их числе — белок МАР2 [4]. Структурные белки, ассоциированные с микротрубочками или MAP (microtubule associated proteins), относятся к фибриллярным белкам, которые обратимо связываются с микротрубочками, способствуя их полимеризации. Белок МАР2 обнаружен в нейронах, в то время как МАР4 встречается во многих иных клетках [5]. Синтез МАР2 сопутствует началу дендрогенеза, регулирует стабилизацию микротрубочек, играет важную роль в формировании специфического рисунка дендритного древа, что позволяет определять морфотип клеток уже на ранних стадиях нейрогенеза и знаменует собой процесс включения клетки в нейронные сети [6-9]. В результате исследования показано, что МАР2-позитивные пирамидные нейроны в слоях V-VI появляются к концу второй недели, в слое III — к концу третьей недели постна-тального развития. Таким образом, было установлено, что дифференцировка пирамидных нейронов разных слоев сенсомоторной коры мозга крыс происходит гетерохронно.
Приуроченность клеток к определенному слою коры косвенно указывает на их функциональную специализацию: клетки V и VI слоев образуют систему нисходящих кортико-фугальных связей, клетки слоя III — кортико-кортикальных (внутри- и межполушарных) [10]. У грызунов клетки, которые образуют кортико-кортикальные связи, нет строгой приуроченности к верхнему этажу коры и в слое V они образуют смешанную с кортикофу-гальными нейронами популяцию. Вместе с тем по синтезу отдельных транскрипционных факторов в этом морфологически едином слое можно выделить пирамидные нейроны, инициирующие кортико-кортикальные или кортико-фугальные связи [11].
В нашем исследовании в качестве функционального маркера нейронов были использованы антитела к белку N200. Белок нейрофиламентов N200 избирательно синтезируется только в нейронах, образующих кортико-фугальные связи, и является их специфическим маркером [12]. По результатам проведенного исследования №00-по-зитивные нейроны были обнаружены только в слое V коры мозга 20-дневной крысы. Кроме того, было установлено, что эти же нейроны синтезируют белок МАР2 и по мор-фотипу могут быть отнесены к пирамидным.
Таким образом, комплексное иммуногистохимическое исследование с применением антител к белкам МАР2 и N200 позволило установить гетерохронную последовательность развития нейронов слоев III и V, а также показало функциональную неоднородность клеток слоя V.
Заключение
1. Исследование развития сенсомоторной коры мозга крыс в первые три недели по-стнатального онтогенеза свидетельствует об усложнении цитоархитектоники за счет стратификации корковой пластинки.
2. Результаты кластерного анализа указывают на то, что в первые три недели постна-тального онтогенеза в корковой пластинке сенсомоторной коры мозга крыс происходит обособление кластеров клеток определенного размерного класса, соответствующих ци-тоархитектоническим слоям.
3. Проведение иммуногистохимического исследования с использованием антител к белку MAP2 свидетельствует о гетерохронном развитии нейронов сенсомоторной коры мозга крыс в течение первых трех недель постнатального развития.
4. Проведение иммуногистохимического исследования с применением антител к белкам MAP2 и N200 показывает колокализацию этих белков в нейронах слоя V коры мозга.
Литература
1. Отеллин В. А., Хожай Л. И., Ордян Н. Э. Пренатальные стрессорные воздействия и развивающийся головной мозг. СПб.: Десятка, 2007. 236 с.
2. Merot Y., Retaux S., Tsen Heng J. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex // Seminars in Cell and Developmental Biology. 2009. Vol. 20. P. 726.
3. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 3rd ed. San Diego: Academic Press. 1982.
4. DehmeltL., Halpain S. Actin and Microtubules in Neurite Initiation: Are MAPs the Missing Link? // J. Neurobiology. 2004. Vol. 58. P. 18-33. Review.
5. Минин А. А., Кулик А. В. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции // Успехи биологической химии. 2004. Т. 44. С. 225.
6. lyck L., Dalmau i., Chemnitz J., Finsen B. et al. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex // J. Histochemistry and Cytochemistry. 2008. Vol. 56, N 3. P. 201.
7. Sanchez C., Diaz-Nido J., Avila J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function // Progress in Neurobiology. 2001. Vol. 61. P. 133.
8. lingwood в., Healy G., Sullivan S., Pow D. et al. MAP2 provides reliable early assessment of neural injury in the newborn piglet model of birth asphyxia // J. Neurosci. Methods. 2008. Vol. 171. P. 140.
9. Краснощёкова Е. И., Зыкин П. А., Ткаченко Л. А., Смолина Т. Ю. Развитие пирамидных нейронов коры полушарий конечного мозга человека во втором триместре гестации // Физиология человека. 2010. Т. 36, № 4. С. 1-7.
10. Богословская Л. С., Поляков Г. И. Пути морфологического прогресса нервных центров у высших позвоночных. М.: Наука, 1981. 160 с.
11. Azw E., Shnider S. J., Cederquist G. Y., Sohur U. S. et al. Lmo4 and Clim1 progressively delineate cortical projection neuron subtypes during development // Cerebral Cortex. 2009. Vol. 19. P. 62.
12. Voelker C. C., Garin п., Taylor J. S., Gahwiler B. H. et al. Selective neurofilament (SMI-32, FNP-7 and N200) expression in subpopulations of layer V pyramidal neurons in vivo and in vitro // Cereb. Cortex 2004. Vol. 14. 1276-1286.
Статья поступила в редакцию 14 октября 2010 г.
