CC BY
86
ОСОБЕННОСТИ ПРОТЕОЛИЗА В ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
ХОДОС О .А.*. ГИДРАНОВИЧ Л.Г.*. САЧЕК М.М.**
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
университет»; кафедра органической химии *, кафедра общей и клинической фармакологии**
Резюме. Изучена активность трипсиноподобных и цистеиновых протеи-наз и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс при хронической алкогольной интоксикации длительностью четыре месяца. Выявлено. что алкоголь оказывает влияние на активность указанных протеиназ и их ингибиторов в ткани головного мозга. Показано. что при хронической алкогольной интоксикации и развитии абстинентного синдрома происходит увеличение активности трипсиноподобных протеиназ головного мозга. Активность цистеиновых протеиназ снижается под воздействием этанола. но увеличивается в период формирования абстинентного синдрома. Эндогенные ингибиторы трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ не способны эффективно контролировать высвобождающиеся протеолитические ферменты. высокая активность которых может привести к выраженным деструктивным процессам и служить одной из причин алкогольного поражения головного мозга.
Ключевые слова: протеиназы. ингибиторы. хроническая алкогольная интоксикация. головной мозг.
Abstract. The activity of trypsin-like and cysteine proteinases and their endogenous inhibitors in brain tissue extract in rats at chronic alcohol intoxication during four months was studied. The changes of activity of proteinases and their inhibitors in brain tissue were found. The results of our study indicate that activity of trypsin-like proteinases increased in the brain tissue at chronic alcohol intoxication and in the period of abstinent syndrome development. Our findings suggest that chronic ethanol exposure decreased activity of cysteine proteinases and increased their activity in the period of abstinent syndrome development in the brain tissue extract in rats. Endogenous inhibitors of trypsin-like and cysteine proteinases were unable to control inactivation of released proteinases effectively. Therefore. high activity of proteinases can lead to destructive processes and can be one of reasons of alcohol injury of the brain.
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь, г. Витебск, ул. Нижненабережная, д. 19, кв. 28, тел. (8029) 298-48-12. - Ходос
О.А.
Алкоголизм является одной из наиболее актуальных медицинских и социально-демографических проблем современного общества [1. 2]. Алкогольные интоксикации вносят весомый вклад в общую смертность населения Восточной Европы - до 20 - 30% за последние 10 - 15 лет [3]. Смертность. обусловленная последствиями злоупотребления алкогольсодержащими жидкостями. уступает в мировой статистике лишь травмам. сердечно-сосудистым и онкологическим заболеваниям [4]. В нашей стране разработана Государственная программа национальных действий по предупреждению и преодолению пьянства и алкоголизма на 2006 - 2010 годы. призванная снизить показатели заболеваемости алкоголизмом в Беларуси. а также обеспечить научные исследования в области профилактики пьянства. алкоголизма и связанных с ними последствий [5].
К особенностям хронического воздействия алкоголя следует отнести значительное многообразие патогенетических механизмов. обусловливающих его токсическое действие. Этиловый спирт легко растворяется в липидах. поэтому одним из наиболее чувствительных органов к воздействию этанола является головной мозг. с поражением структурных компонентов которого связаны психическая зависимость человека от алкоголя. развитие абстинентного синдрома. а также нарушения в функционировании других жизненно важных органов и систем [6. 7. 8]. Этанол влияет на функции основных нейромедиаторных и ней-ромодуляторных систем. активирует N-метил-Б-аспартатные (NMDA) рецепторы. чрезмерная стимуляция которых сопровождается нейротоксическими эффектами [8. 9]. При алкогольной интоксикации изменяется уровень биологически активных пептидов. который во многом определяется изменением активности ферментов их обмена - фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой кар-боксипептидазы и карбоксипептидазы Н [8. 9]. Известно. что этанол снижает уровень специфического протеина мозга. который стимулирует рост нейронов (фактор роста мозга) и нарушает экспрессию гена bcl-2. который ингибирует апоптоз [9. 10]. Нейротоксичность этанола и его способность вызывать апопто-тическую нейродегенерацию связывают также с активацией цистеиновой про-теиназы каспазы-3 [11. 12. 13]. Недавние исследования показали. что под влиянием алкоголя в головном мозге повышается активность протеолитических ферментов кальпаинов [14. 15]. что может привести к повреждению структурных белков клеточной мембраны с последующей дегенерацией нервных клеток [16]. Однако. несмотря на интенсивные исследования в данной области. значение протеолиза в головном мозге при хронической алкогольной интоксикации. участие протеиназ в формировании абстинентного синдрома. остаются недостаточно изученными.
Целью нашей работы являлось изучение активности трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов в ткани головного мозга крыс при хронической алкогольной интоксикации.
Методы
Исследования проводились на самцах крыс линии Wistar массой тела 250300 грамм. содержащихся на нормированном рационе в условиях вивария. В опытах использовали контрольную и две опытные группы экспериментальных животных. Модель хронической алкогольной интоксикации предполагала по-
требление животными опытной группы 30% раствора этанола через поилки (в качестве единственного источника питья) в течение четырех месяцев [17]. Животные контрольной группы (группа 1) получали водопроводную воду. Забой опытных животных осуществляли сразу после потребления этилового спирта (группа 2) и через сутки после лишения алкоголя в период развития абстинентного синдрома (группа 3). Концентрацию этилового спирта в крови экспериментальных животных контролировали с помощью метода газовой хроматографии путем анализа равновесной парогазовой фазы над жидкостью. для чего использовали газовый хроматограф «Цвет 500М» с пламенно-ионизационным детектором. В основу определения концентрации этанола в крови был положен метод. разработанный в Институте биохимии АН БССР (Гродно) [18]. который был модифицирован нами в части объема микропроб и времени термостатиро-вания. Для проведения исследований использовали стальную колонку длиной 2 м. которую заполняли полисорбом-1 с размером частиц 0.2-0.4 мм. Анализ проводили при температуре испарителя 150°С. температура детектора и термостата колонок составляла 125°С. В качестве газа-носителя использовали гелий. Расход водорода соответствовал 25 мл/мин. расход гелия - 30 мл/мин. Время выхода пика этанола составило 3 минуты.
В крови экспериментальных животных контрольной группы присутствия этанола в пробах не выявлено. Уровень этанола в крови животных. получавших 30% раствор этанола в качестве единственного источника питья. составил 2.33 г/л. ДИ от 0.44 до 2.84 г/л. а через 24 часа после лишения алкоголя он снизился до 0.13 г/л. ДИ от 0.075 до 0.47 г/л. Различие концентрации этанола в указанных группах было статистически значимым (р=0.005).
Крыс декапитировали. извлекали на холоду головной мозг и гомогенизировали его полушария с помощью стеклянного гомогенизатора. Условия получения гомогената и экстракта ткани головного мозга отрабатывали экспериментально [19]. Гомогенизацию ткани головного мозга проводили в дистиллированной воде в соотношении 1:9. экстракцию осуществляли в течение 24 часов на холоду. Гомогенаты центрифугировали в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. осадок отбрасывали. Содержание белка в экстрактах определяли по методу Лоури [20]. Активность протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс определяли спектрофотометрически по интенсивности расщепления высокостабильного в растворе. низкомолекулярного хромогенного субстрата ^а-бензоил^. L-аргинин-пара-нитроанилида (БАПНА). Исследование активности трипсиноподобных протеиназ проводили по методу Erlanger B. и др. [21]. Для определения активности ингибиторов трипсиноподобных протеиназ использовали метод. предложенный Хватовым Т. А. и Беловой В.Б. [22]. для цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов - метод Lenney J.F. [23]. Данные методы были модифицированы нами для исследования интенсивности протеолиза в экстрактах ткани головного мозга [19]. Активность трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ выражали в нмоль/ч-мг белка. активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ выражали в нмоль/с-мг белка.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ STATISTICA. При проверке степени достоверности межгрупповых различий был использован U-критерий Манна -Уитни [24]. При представлении результатов приводится медиана. 95% доверительный интервал (ДИ) для каждой из групп и точное значение уровня статистической значимости (р) [24].
Результаты и обсуждение
Исследования показали. что активность трипсиноподобных протеиназ в экстракте ткани головного мозга крыс контрольной группы составила 33.27 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 15.98 до 74.08 нмоль/ч-мг белка (рис.1). При хронической алкогольной интоксикации активность трипсиноподобных протеиназ соответствовала 94.67 нмоль/ч-мг белка. при ДИ от 28.29 до 162.13 нмоль/ч-мг белка. а в период формирования абстинентного синдрома - 113.47 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 93.93 до 164.44 нмоль/ч-мг белка. Полученные результаты указывают на то. что по сравнению с контрольной группой происходит увеличение активности трипсиноподобных протеиназ на 184.55% при хронической алкогольной интоксикации в течение четырех месяцев (р=0.041) и на 241.05% при формировании синдрома отмены алкоголя (р=0.002).
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20 Median
□ 25%-75%
0 -----------•----------- -----------1----------- Min-Max
Рис.1. Активность трипсиноподобных протеиназ в экстракте ткани головного мозга крыс, нмоль/ч-мг белка. 1, 2, 3 - номера групп экспериментальных животных.
Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ в экстрактах ткани головного мозга экспериментальных животных контрольной группы составила 0,42 нмоль/с-мг белка, ДИ от 0,39 до 0,59 нмоль/с-мг белка. Результаты изучения активности ингибиторов трипсиноподобных протеиназ в экстрактах ткани головного мозга крыс, подвергнутых декапитации в период
алкогольной интоксикации показали, что она достигает 0,48 нмоль/с-мг белка, ДИ от 0,42 до 0,62 нмоль/с-мг белка (рис.2). При формировании синдрома отмены этанола активность ингибиторов трипсиноподобных протеиназ соответствовала 0,34 нмоль/с-мг белка, ДИ от 0,28 до 0,41 нмоль/с-мг белка. По сравнению с контрольной группой наблюдалось снижение активности эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ в период развития абстинентного синдрома на 19,04% (р=0,006), тогда как при хронической алкогольной интоксикации не было выявлено статистически значимых по сравнению с контролем различий их активности (р=0,173).
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
Median О 25%-75% Min-Max
Рис.2. Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ в экстракте ткани головного мозга крыс, нмоль/с-мг белка. 1, 2, 3 - номера групп
экспериментальных животных.
Выявлено, что активность кислых лизосомальных цистеиновых протеиназ в контрольной группе составляет 8,89 нмоль/ч-мг белка, ДИ от 3,33 до 13,82 нмоль/ч-мг белка (рис.3). При хронической алкогольной интоксикации активность цистеиновых протеиназ соответствует 5,45 нмоль/ч-мг белка, ДИ от 4,09 до 7,81 нмоль/ч-мг белка, а в период формирования абстинентного синдрома -15,83 нмоль/ч-мг белка, ДИ от 10,26 до 22,96 нмоль/ч-мг белка. Обнаружено снижение активности кислых лизосомальных цистеиновых протеиназ в экстрактах ткани головного мозга крыс на 38,69% при хронической алкогольной интоксикации в течение четырех месяцев (р=0,029) и увеличение их активности по сравнению с контрольной группой на 78,06% при формировании синдрома отмены алкоголя (р=0,001).
Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в контрольной группе составила 8,98 нмоль/с-мг белка, ДИ от 4,64 до 12,48 нмоль/с-мг белка.
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Median О 25%-75% Min-Max
Рис.3. Активность цистеиновых протеиназ в экстракте ткани головного мозга крыс, нмоль/ч-мг белка. 1, 2, 3 - номера групп экспериментальных животных.
1 2 3
Рис.4. Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в экстракте ткани головного мозга крыс, нмоль/с-мг белка. 1, 2, 3 - номера групп экспериментальных животных.
При хронической алкогольной интоксикации активность ингибиторов цистеиновых протеиназ соответствовала 14.90 нмоль/с-мг белка. ДИ от 3.33 до 19.15 нмоль/с-мг белка. в период формирования абстинентного синдрома -10.76 нмоль/с-мг белка. ДИ от 5.99 до 15.14 нмоль/с-мг белка. Различия активности эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ не были статистически значимыми по сравнению с контрольной группой экспериментальных животных ни при хронической интоксикации этиловым спиртом (р=0.356). ни в период развития синдрома отмены алкоголя (р=0.538) (рис.4).
Таким образом. при хронической алкогольной интоксикации и развитии абстинентного синдрома происходит увеличение активности трипсиноподобных протеиназ. Согласно литературным данным этанол нарушает процесс сборки лизосом в клетках. поэтому в результате алкогольной интоксикации может происходить формирование лизосом с дефектной мембраной [16]. Следствием синтеза таких лизосом является высвобождение протеолитических ферментов и нарушение равновесия между активностью протеиназ и их эндогенных ингибиторов. Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ не изменяется при хронической интоксикации этанолом. но с развитием синдрома отмены алкоголя снижается. что указывает на нарушение баланса протеиназы/ингибиторы в ткани головного мозга. Снижение эффективности контроля активности трипсиноподобных протеиназ их эндогенными ингибиторами на фоне возрастающей интенсивности протеолиза может привести к необратимому повреждению мозговой ткани.
Активность кислых лизосомальных цистеиновых протеиназ при хронической алкогольной интоксикации несколько снижается. а при формировании синдрома отмены алкоголя значительно возрастает. тогда как изменение активности их эндогенных ингибиторов не является статистически значимым. Снижение активности цистеиновых протеиназ при хронической алкогольной интоксикации может быть связано с известной способностью этанола повышать рН внутри лизосом [16]. Смещение лизосомального рН в щелочную область. вероятно. способствует снижению активности кислых цистеиновых протеиназ под влиянием этанола. тогда как активность трипсиноподобных протеиназ определяется при нейтральном значении рН и на нее данный факт. видимо. не оказывает существенного влияния. В период абстинентного синдрома изменения активности трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов наиболее выражены. При формировании синдрома отмены алкоголя обнаруживается дисбаланс в системе протеиназы/ингибиторы. усиливается протеолиз. Эндогенные ингибиторы трипсиноподобных и цистеиновых протеи-наз не способны эффективно контролировать активность протеолитических ферментов. максимальную в период формирования абстинентного синдрома. что. вероятно. усиливает негативное влияние со стороны протеиназ на клетки головного мозга за счет усиления деструкции белков в этот период. Повышение активности трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ способно привести к выраженным деструктивным процессам. что в свою очередь может явиться одной из причин алкогольного поражения головного мозга.
Таким образом. хроническая интоксикация этиловым спиртом оказывает влияние на активность трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов. нарушает баланс в системе протеиназы/ингибиторы. усиливает протеолиз в ткани головного мозга крыс.
Заключение
1. При хронической алкогольной интоксикации и развитии абстинентного синдрома увеличивается активность трипсиноподобных протеиназ экстрактов ткани головного мозга крыс (контрольная группа - 33.27 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 15.98 до 74.Q8 нмоль/ч-мг белка. хроническая алкогольная интоксикация -94.б7 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 28.29 до 1б2.13 нмоль/ч-мг белка (р=0,041), при развитии абстинентного синдрома - 113.47 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 93.93 до 1б4.44 нмоль/ч-мг белка. р=0,002).
2. Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ экстракта ткани головного мозга крыс не изменяется при хронической алкогольной интоксикации (контрольная группа - Q.42 нмоль/с-мг белка. ДИ от Q.39 до Q.59 нмоль/с-мг белка. хроническая алкогольная интоксикация - Q.48 нмоль/с-мг белка. ДИ от Q.42 до Q.62 нмоль/с-мг белка. р=0,173). В период развития синдрома отмены алкоголя активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ снижается по отношению к контрольной группе и составляет Q.34 нмоль/с-мг белка. ДИ от Q.28 до Q.41 нмоль/с-мг белка (р=0,006).
3. Изменение активности кислых лизосомальных цистеиновых протеиназ экстрактов ткани головного мозга крыс имеет разнонаправленный характер: снижается по сравнению с контролем при хронической алкогольной интоксикации (контрольная группа - 8,89 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 3,33 до 13,82 нмоль/ч-мг белка. хроническая алкогольная интоксикация - 5,45 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 4.Q9 до 7,81 нмоль/ч-мг белка. р=0,029) и возрастает при формировании абстинентного синдрома до 15,83 нмоль/ч-мг белка. ДИ от 1Q,26 до 22,9б нмоль/ч-мг белка (р=0,001).
4. Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ экстрактов ткани головного мозга крыс не изменяется по сравнению с контрольной группой животных (8.98 нмоль/с-мг белка. ДИ от 4,б4 до 12,48 нмоль/с-мг белка) ни при хронической алкогольной интоксикации (14.9Q нмоль/с-мг белка. ДИ от 3,33 до 19,15 нмоль/с-мг белка. р=0,356), ни при развитии синдрома отмены алкоголя (1Q,76 нмоль/с-мг белка. ДИ от 5,99 до 15,14 нмоль/с-мг белка. р=0,538).
5. При хронической алкогольной интоксикации выявлен дисбаланс в системе протеиназы/ингибиторы. который в большей степени выражен в период формирования абстинентного синдрома.
Литература
1. Александров. А. А. Выявление расстройств. вызванных употреблением алкоголя. в общемедицинской практике / А. А. Александров // Медицина. -2QQ7. - № 1. - С. 12 - 15.
2. Жарко. В. И. Состояние здоровья населения Республики Беларусь и стратегия развития здравоохранения / В. И. Жарко. В. З. Черепков. А. К. Цыбин // Здравоохранение. - 2QQ7. - № 1. - С. 4 - 13.
3. Стикли. А. Алкогольные отравления в странах Восточной Европы в 1870 - 2002гг / А. Стикли. Ю. Е. Разводовский // Медицинские новости. - 2007.
- № 2. - С. 46 - 50.
4. Судебно-медицинские аспекты патоморфологии внутренних органов при алкогольной интоксикации / Ю. И. Пиголкин [и др.] // Судебномедицинская экспертиза. - 2000. - № 3. - С. 34 - 37.
5. Государственная программа национальных действий по предупреждению и преодолению пьянства и алкоголизма на 2006 - 2010 годы: утверждена постановлением Совета Министров Республики Беларусь. № 556 от 27.04.2006 г. [Электронный ресурс] / Министерство здравоохр. Республики Беларусь. -Минск. 2007. - Режим доступа: http:www.minzdav.by/med/gosprgm/gsp7.htm. -Дата доступа: 15.10.07.
6. Шорманов. С.В. Структурные изменения головного мозга больных хроническим алкоголизмом / С. В. Шорманов // Архив патологии. - 2006. - № 1
- С. 19 - 22.
7. Дамулин. И. В. Алкогольная дегенерация мозжечка / И. В. Дамулин // Российский медицинский журнал. - 2005. - № 2 - С. 44 - 47.
8. Влияние хронического потребления этанола на активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга пренатально алкоголизированных крыс / А. Н. Вернигора [и др.] // Нейрохимия. - 2003. - № 1. - С. 56 - 59.
9. Разводовский. Ю. Е. Алкогольное поражение мозга /
Ю. Е. Разводовский // Медицинские новости. - 2006. - № 1 - С. 13 - 17.
10. GABA receptor activation at medullary sympathetic neurons contributes to postexercise hypotension / R. Kajekar [et al.] // Am. J. Physiol Heart Circ Phisiol. -2002. - N 282. - P. H1615 - H1624.
11. Ethanol Induces Cell Death by Activating Caspase-3 in the Rat Cerebral Cortex / J. Y. Han [et al.] // Molecules and Cells. - 2005. - Vol. 20. N 2. - P. 189 -195.
12. Differential modulation of apoptosis associated proteins by ethanol in rat cerebral cortex and cerebellum / Y. Rajgopal [et al.] // Eur. J. Pharmacol. - 2003. -Vol. 470. N 3. - P. 117 - 124.
13. Apoptotic effect of caspase-3 cleaved tau in hippocampal neurons and its potentiation by tau FTDP-mutation N279K / L. Fasulo [et al.] // J. Alzheimers Dis. -2005. - Vol. 7. N 1. - P. 3 - 13.
14. Calpain activation and alpha-spectrin cleavage in rat brain by ethanol / Y. Rajgopal [et al.] // Neurosci Lett. - 2002. - Vol. 321. N 3. - P. 187 - 191.
15. Spectrin and calpain: a «target» and a «sniper» in the pathology of neuronal cells / A. Czogalla [et al.] // Cell Mol. Life Sci. - 2005. - Vol. 62. N 17. - P. 1913 -1924.
16. Intracellular Proteolytic Systems in Alcohol-Induced Tissue Injury / M. Terrence [et al.] // Alcohol Research and Health. - 2003. - Vol. 27. N 4. - P. 317324.
17. Попова. Э. Н. Изменение нейронов хвостатого ядра при экспериментальном алкоголизме / Э. Н. Попова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1997. - № 7. - С. 66 - 69.
18. Шишкин. С. Н. Оптимизация техники определения уровня эндогенного этанола в крови и тканях человека и экспериментальных животных / С. Н. Шишкин. Ю. М. Островский. П. С. Пронько // Вопросы медицинской химии. - 1988. - № 5. - С. 129 - 133.
19. Ходос. О. А. Исследование активности протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс / О. А. Ходос // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины: сборник научных статей науч.-практ. конф.. Гомель. 1 - 2 дек. 2005 г. / Гомельский гос. мед. ун-т; редкол.: С. В. Жаворонок [и др.]. - Гомель. 2006. - Т. 2. - С. 128 - 130.
20. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. N 1. - P. 265-275.
21. Erlanger. B. F. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin / B. F. Erlanger. N. Kokowsky. M. Cohen // Arch. Biochem. Bi-ophys. - 1961. - Vol. 95. N 2. - Р. 271-278.
22. Ускоренный метод определения основных ингибиторов протеиназ в плазме крови человека: метод. рекомендации / В. Б. Хватов. Т. А. Белова. - М.. 1981. - 27 с.
23. Thermostable endogenous inhibitors of cathepsins B and H / J. F. Lenney [et al.] // Eur. J. Biochem. - 1979. - Vol. 101. N 1. - Р. 153 - 161.
24. Реброва. О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О. Ю. Реброва. - Минск: МедиаСфера. 2003. - 312 с.
