CC BY
17© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
А.В.Семенов1, Н.А.Арсентьева1, Д.С.Елезов1, И.В.Кудрявцев2, Е.В.Эсауленко3, Арег А.Тотолян1
ОСОБЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА CXCRS-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, 2НИИ экспериментальной медицины, Государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург
Цель. Количественное определение CXCR3+, CCR5+ и CCR6+ клеток в основных популяциях лимфоцитов: Т-хелперах (Th), цитотоксических Т-лимфоцитах (CTL), натуральных киллерных (NK) и Т-натуральных киллерных клетках (TNK), В-лимфоцитах у больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС). Материалы и методы. Исследовали содержание популяций лимфоцитов, несущих хемокиновый рецептор CXCR3, на Т-лимфоцитах оценивали хемокиновые рецепторы CCR5 и CCR6 в периферической крови 19 больных ХВГС и 32 условно здоровых доноров. Популяции клеток определяли методом проточной цитофлюориметрии с использованием различных комбинаций моно-клональных антител: для оценки Th и CTL (CD3/CD4/CD8/CXCR3/CCR5/CCR6); NK и TNK (CD16/CD56/CD3/CXCR3); В-клеток (CD19/CD45/CXCR3). Результаты. У пациентов с ХВГС, по сравнению со здоровыми донорами, обнаружено значительное возрастание количества CXCR3-положительных Th, хотя содержание CXCR3-положительных CTL не отличалось в сравниваемых группах; снижено содержание CXCR3+ NK клеток при одинаковом содержании CXCR3+ TNK. Анализ количества CXCR3+ В-клеток показал увеличение их более чем в 3,5 раза у больных ХВГС. Не выявлено достоверных различий в относительном содержании Th и CTL, несущих CCR5 и CCR6, несмотря на незначительное возрастание количества CCR5+ и CCR6+ Th. Заключение. В периферической крови больных ХВГС значительно изменялось содержание основных популяций лимфоцитов, несущих хемокиновый рецептор CXCR3, по сравнению с условно здоровыми донорами. Увеличение количества CXCR3-положительных В-клеток может быть связано с инфицированием этих клеток ВГС и развитием внепеченочных проявлений ХВГС.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 69—76
Ключевые слова: гепатит С, рецепторы хемокинов, проточная цитометрия, CXCR3, CCR5, CCR6
A.V.Semenov1, N.A.Arsentieva1, D.S.Elezov1, I.V.Kudryavtsev2, E.V.Esaulenko3, AregA.Totolyan1
FEATURES OF POPULATION COMPOSITION OF PERIPHERAL BLOOD CXCR3-POSITIVE LYMPHOCYTES IN CHRONIC VIRAL HEPATITIS C PATIENTS
1Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 2Research Institute of Experimental Medicine, 3State Pediatric Medical University, St. Petersburg, Russia
Aim. Quantitative determination of CXCR3+, CCR5+ and CCR6+ cells in major lymphocyte populations: T-helpers (Th), cytotoxic T-lymphocytes (CTL), natural killers (NK) and T-natural killer cells (TNK), B-lymphocytes in patients with chronic viral hepatitis C (CVHC). Materials and methods. Content of lymphocyte populations carrying chemokine receptor CXCR3 was studied, chemokine receptors CCR5 and CCR6 were evaluated on T-lymphocytes, in peripheral blood of 19 CVHC patients and 32 conditionally healthy donors. Cell populations were determined by flow cytofluorometry by using various combinations of monoclonal antibodies: for evaluation of Th and CTL (CD3/CD4/CD8/CXCR3/CCR5/CCR6); NK and TNK (CD16/CD56/CD3/ CXCR3); B-cells (CD19/CD45/CXCR3). Results. In patients with CVHV compared with healthy donors a significant increase of quantity of CXCR3-positive Th was detected, however the content of CXCR3-positive CTL did not differ in the groups compared; CXCR3+ NK cell content was
lower with equal content of CXCR3+ TNK. Analysis of quantity of CXCR3+ B-cells showed an increase of more than 3.5 times in CVHC patients. Significant differences in relative content of Th and CTL carrying CCR5 and CCR6 were not detected despite a non-significant increase of quantity of CCR5+ and CCR6+ Th. Conclusion. Content of major lymphocyte populations carrying chemokine receptor CXCR3 changed significantly compared with conditionally healthy donors in peripheral blood of CVHC patients. The increase of quantity of CXCR3-positive B-cells may be associated with infection of these cells by HCV or development of extra-liver manifestations of HVHC.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 69-76
Key words: hepatitis C, chemokine receptors, flow cytometry, CXCR3, CCR5, CCR6 ВВЕДЕНИЕ
Вирус гепатита С (ВГС) является основным возбудителем гепатотропных инфекций в развитых странах. Острый вирусный гепатит С (ОВГС) в 60 — 70% случаев переходит в хроническую инфекцию, для которой характерны длительная персистенция вируса, развитие цирроза печени, гепатоцеллюлярной карциномы и тяжелых внепе-ченочных проявлений [3]. Различное течение и исходы ОВГС обусловлены гетерогенностью иммунного ответа, связанного с иммуногенетическим своеобразием организма-хозяина и биологическими особенностями ВГС [4]. Естественную элиминацию ВГС связывают с успешным контролем инфекции иммунной системой. В этом случае формируется адекватный, интенсивный и высокоспецифический Т-клеточный ответ против антигенов ВГС [1]. Кроме того, генетические исследования выявили важную роль натуральных киллерных клеток (NK) в удачном исходе ОВГС [9]. Для выполнения своих эффекторных функций NK клетки и специфические Т-лимфоциты должны мигрировать в очаг воспаления. С другой стороны, цитотоксический иммунный ответ играет ключевую роль не только в элиминации вируса, но и в повреждении клеток печени [7].
Наличие хронического воспаления, безусловно, является следствием нарушений противовирусного иммунитета. Этот процесс часто сопровождается привлечением в печень неспецифических иммунных клеток. За регуляцию направленного движения лейкоцитов в сайты воспаления ответственно семейство хемокинов. При ХВГС про-воспалительные хемокины усиленно продуцируются в печени, вызывая миграцию лейкоцитов с периферии в печеночную паренхиму и, таким образом, участвуют в формировании воспалительного инфильтрата. В последнее время внимание исследователей привлекает участие этих молекул в иммунопатогенезе ХВГС, их значимость для оценки тяжести течения заболевания, прогноза и эффективности противовирусной терапии. Например, антиген-специфические внутрипеченочные Т-лимфоциты экспрессируют хемокиновые рецепторы CCR5 и CXCR3 на своей поверхности [14]. Показано, что повышение уровня лиганда CXCR3 — CXCL10 (IP-10 — белок 10, индуцируемый интерфероном гамма) в сыворотке крови пациентов является предиктором негативного исхода стандартной противовирусной терапии (пегилированный интерферон + рибавирин) при ХВГС, вызванным вирусом ГС 1 генотипа [6]. Объяснение, почему провоспалительный хемокин является негативным маркером исхода терапии и прогрессирования фиброза печени, было дано А. Castrouge et al. [8], которые обнаружили, что CXCL10 в сыворотке крови находится в антогонистической для рецептора форме. Индивидуальная N-концевая часть молекулы хемокина отщепляется под действием металлопротеаз, и видоизмененная форма приобретает свойства ингибитора. Установлено, что дипептилпептидаза IV (DPP4, CD26), возможно, в комбинации с другими протеазами опосредуют антагонистическую форму CXCL10 при ХВГС. Еще один хемокин (CCL20), вовлеченный в иммунопатогенез ХВГС, LARC (Liver Activation Regulated Chemokine — хемокин, регулирующий активацию клеток
печени), поэтому его рецептор CCR6 также стал объектом изучения [14]. С другой стороны, большинство иммунокомпетентных клеток, присутствующих в печени больных ХВГС, несут на своей поверхности CXCR3, CCR5 и CCR6 [17], поэтому вопрос, каким образом данные рецепторы и их лиганды участвуют в развитии гепатита С и оказывают влияние на исход противовирусной терапии, остается открытым. Возможно, уровень экспрессии CXCR3, CCR5 и CCR6 на различных популяциях лимфоцитов и изменение их состава могут служить биологическими маркерами про-грессирования либо предикторами исхода противовирусной терапии.
Поскольку удачный исход ОВГС связывают с Т-клеточным ответом, особый интерес представляет определение экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR3, CCR5 и CCR6 на CD4+ и CD8+ Т-клетках. Недостаточно известно о популяции В-клеток, несущих CXCR3. Отдельно следует выделить популяции NK и Т-натуральных кил-лерных клеток (TNK), экспрессирующих CXCR3, так как именно эти клетки в большом количестве обнаруживаются в инфицированной ВГС печени. NK и TNK клетки напрямую связывают с процессом фиброзирования печеночной паренхимы.
Целью настоящего исследования явилось количественное определение CXCR3+, CCR5+, CCR6+ клеток в основных популяциях лимфоцитов (Т-хелперах — Th, ци-тотоксических Т-лимфоцитах — CTL, NK и TNK клетках, В-лимфоцитах) у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 19 пациентов с ранее подтвержденным диагнозом ХВГС. Группу сравнения составили 32 условно здоровых донора.
Анализ содержания популяций лимфоцитов, несущих рецепторы CXCR3, CCR5 и CCR6, проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием различных комбинаций моноклональных антител: для оценки ТЪ (CD3/CD4/CXCR3/ CCR5/CCR6) и CTL (CD3/CD8/CXCR3/CCR5/CCR6); NK и TNK клеток (CD16/ CD56/CD3/CXCR3); В-клеток (CD19/CD45/CXCR3). Моноклональные антитела (Beckman Coulter, BioLegend, США) были мечены флуорохромами FITC, ECD, PC5,5, PC7, Pe/Cy7, APC, APC-Cy7, APC-Alexa Fluor700.
Цельную кровь окрашивали антителами в соответствии с рекомендациями производителя. Лизис эритроцитов проводили по безотмывочной технологии. В каждой пробе анализировали 50 000 клеток. Для локализации лимфоцитов использовали морфологические параметры (малоугловое и боковое светорассеяние) и CD45. Абсолютное количество клеток определяли с использованием гематологического анализатора Pentra 60 (HORIBA ABX, Франция).
Образцы анализировали на проточном цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США). Математическую обработку данных проводили с использованием программ Navios Software v. 1.1 и Kaluza v. 1.2 (Beckman Coulter, США). Статистический анализ осуществляли с применением пакета прикладных программ GraphPad Prizm 6. Для сравнения групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Анализ содержания Th, CTL, NK, TNK и В-клеток не выявил достоверных различий между группой больных ХВГС и условно здоровых доноров. Таким образом, содержание основных популяций лимфоцитов в крови больных ХВГС по сравнению с контрольной группой не изменяется.
Исследование содержания Th и CTL, несущих рецепторы CCR5 и CCR6, не выявило различий между опытной и контрольной группами, несмотря на возрастание абсолютного количества CCR5+ и CCR6+ Th у больных ХВГС. В отличие от Т-клеток, несущих рецепторы CCR5 и CCR6, относительные значения CXCR3-положительных лимфоцитов значительно отличались у пациентов с ХВГС по сравнению с группой
условно здоровых доноров. Сравнительная характеристика содержания основных популяций лимфоцитов, несущих на своей поверхности хемокиновые рецепторы CXCR3, CCR5 и CCR6, у больных ХВГС и условно здоровых доноров представлена в табл.
В периферической крови больных ХВГС отмечено значительное возрастание (р<0,01) количества CXCR3-положительных ТИ (CXCR3+CD3+CD4+CD8-) по сравнению с контрольной группой, медиана для больных ХВГС составила 44,12% (0,425х109/л), для контрольной группы — 35,98% (0,259х109/л).
Содержание CXCR3-положительных С^ (CXCR3+CD3+CD8+CD4-) не отличалось в сравниваемых группах. При этом популяция CXCR3-положительных NK клеток (CXCR3+CD3-CD16+CD56+) у больных ХВГС уменьшалась в 1,4 раза (р<0,05) по сравнению со здоровыми донорами при относительно равном содержании всех NK клеток. Абсолютное содержание CXCR3-положительных NK клеток не отличалось от контрольных значений. При исследовании содержания CXCR3-положительных TNK клеток (CXCR3+CD3+CD56+CD16-), занимающих особое положение между клетками врожденного и специфического иммунитета и обладающих цитолитической активностью, не выявлено достоверных различий у больных ХВГС и условно здоровых доноров.
Относительное и абсолютное количество В-клеток, несущих на своей поверхности хемокиновый рецептор CXCR3 (CXCR3+СD19+CD45+), увеличивалось более чем в 3,75 раза у больных ХВГС (р<0,0001), медиана для больных ХВГС составила 19,52% (0,029х109/л), для контрольной группы — 5,20% (0,008х109/л). Таким образом, у больных ХВГС больше всего увеличивалось количество В-клеток, экспрессирующих CXCR3 среди основных популяций лимфоцитов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Хемокиновый рецептор CXCR3 присутствует на разных типах иммунокомпетент-ных клеток. Его связывают, в основном, с Т-хелперным ответом I типа (ТИ1). Считается, что CXCR3-положительные клетки, мигрирующие в очаг воспаления, способствуют развитию иммунной реакции, преимущественно опосредованной ци-тотоксическими лимфоцитами [12]. В процессе воспаления печени лиганды CXCR3, в том числе СХ^10 (1Р-10— белок 10, индуцируемый интерфероном гамма), СХ^11 (1ТАС — интерферон-индуцируемый хемоаттрактант Т-клеток) и СХ^9 (Mig — монокин, индуцируемый интерфероном гамма) продуцируются гепатоцитами, звездчатыми клетками, эндотелиоцитами и лейкоцитами, мигрировавшими в печень. За счет лигандов CXCR3 в очаг воспаления привлекаются активированные лейкоциты (С^, ТИ1, NK, TNK, В-лимфоциты и др.). Установлено, что концентрация лигандов CXCR3 значительно возрастает в сыворотке крови и печени больных ХВГС по сравнению с контрольной группой практически здоровых лиц [17], более того, возрастание концентрации CXCL10 в плазме крови является показателем развития воспаления и фиброза печени и предиктором негативного исхода противовирусной терапии при ХВГС [6]. Ранее нами было показано доминирование системного иммунного ответа над местным и связь экспрессии мРНК некоторых рецепторов хемокинов с прогрессированием ХВГС [2], в связи с чем, явилось целесообразным определить содержание основных популяций лимфоцитов, несущих на своей поверхности хемо-киновые рецепторы.
Результаты настоящего исследования подтверждают ранее опубликованные данные о содержании CCR5+ и CCR6+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных ХВГС [14] и свидетельствуют о незначительном возрастании абсолютного числа ТИ, несущих данные рецепторы. Регуляторные Т-клетки и ТИ17 экспрессируют на своей поверхности рецептор CCR6, а привлечение ССR6+CD4+ Т-клеток в печень может как усиливать, так и ограничивать аутоиммунные процессы. Показано, что экспрессия CCR6 значительно выше на внутрипеченочных ТИ, чем на клетках перифериче-
Относительное и абсолютное содержание основных популяций лимфоцитов и CXCR3+, CCR5+ и CCR6+ клеток в периферической крови больных ХВГС [Me (min-max)]
Показатели Здоровые доноры Больные ХВГС р
ТИ (CD3+CD4+CD8-) (отн. лимфоцитов, %) 48,39 (26,34 -59,92) 46,38 (39,19 -64,27) нд
ТИ (CD3+CD4+CD8-) (абс., 109/л) 0,780 (0,523 -1,471) 0,926 (0,424 -1,489) нд
CCR5+ ТИ (CCR5+CD3+CD4+CD8-) (отн. ТИ, %) 6,0 (1,07— 14,72) 6,24 (1,56- 27,92) нд
CCR5+ ТИ (CCR5+CD3+CD4+CD8-) (абс., 109/л) 0,041 (0,007 -0,114) 0,071 (0,012 -0,202) 0,049
CCR6+ ТИ (CCR6+CD3+CD4+CD8-) (отн. ТИ, %) 32,03 (20,94 -66,62) 35,97 (20,98- -63,69) нд
CCR6+ ТИ (CCR6+CD3+CD4+CD8-) (абс. 109/л) 0,214(0,123 -0,561) 0,325 (0,146 -0,602) 0,027
CXCR3+ ТИ (CXCR3+CD3+CD4+CD8-) (отн. ТИ, %) 35,98 (20,23 -50,67) 44,12 (31,01 -67,31) <0,0001
CXCR3+ ТИ (CXCR3+CD3+CD4+CD8-) (абс., 109/л) 0,259 (0,147 -0,681) 0,425 (0,235 -0,655) 0,0023
CTL (CD3+CD8+CD4-) (отн. лимфоцитов, %) 23,02 (10,99 -33,65) 24,39 (12,95 -36,23) нд
CTL (CD3+CD8+CD4-) (абс., 109/л) 0,439 (0,291 -0,896) 0,549 (0,200- -1,125) нд
CCR5+ СTL (CCR5+CD3+CD8+CD4-) (отн. С1Ь, %) 10,47 (2,40- 25,94) 9,14 (0,18- 27,52) нд
CCR5+ CTL (CCR5+CD3+CD8+CD4-) (абс., 109/л) 0,044 (0,010 -0,324) 0,041 (0,001- 0,242) нд
CCR6+ CTL (CCR6+CD3+CD8+CD4-) (отн. CTL, %) 10,34 (3,08- 40,05) 6,39 (1,67- 28,91) нд
CCR6+ С1Ъ (CCR6+CD3+CD8+CD4-) (абс., 109/л) 0,038 (0,013 -0,301) 0,042 (0,006- -0,195) нд
CXCR3+ С1Ъ (CXCR3+CD3+CD8+CD4-) (отн. CTL, %) 70,44 (58,28 -85,05) 72,99 (49,88 -89,31) нд
CXCR3+ CTL (CXCR3+CD3+CD8+CD4) (абс., 109/л) 0,297 (0,177- -0,627) 0,314 (0,138- -0,764) нд
NK (CD3-CD16+CD56+) (отн. лимфоцитов, %) 7,84 (2,45- 17,77) 8,02 (1,83- 13,3) нд
NK (CD3-CD16+CD56+) (абс., 109/л) 0,138 (0,043- -0,325) 0,155 (0,047- -0,341) нд
CXCR3+ NK (CXCR3+CD3-CD16+CD56+) (отн. NK, %) 20,31 (5,67- -74,54) 14,29 (6,45- -40,57) 0,048
CXCR3+ NK (CXCR3+CD3-CD16+CD56+) (абс., 109/л) 0,030 (0,005 -0,101) 0,022 (0,007- -0,132) нд
TNK (CD3+CD56+CD16-) (отн. лимфоцитов, %) 4,19 (0,61- -14,1) 3,27 (1,02- 17,01) нд
TNK (CD3+CD56+CD16-) (абс., 109/л) 0,061 (0,007 -0,297) 0,072 (0,015- -0,344) нд
CXCR3+ TNK CXCR3+CD3+CD56+CD16-) (отн. TNK, %) 57,2 (22,34- 88,76) 48,66 (16,81- 86,24) нд
CXCR3+ TNK (CXCR3+CD3+CD56+CD16-) (абс., 109/л) 0,030 (0,004 -0,114) 0,034 (0,009- -0,142) нд
В-клетки (СD19+CD45+) (отн. лимфоцитов, %) 11,57(5,22- 20,05) 11,16 (4,12- 20,16) нд
CXCR3+ В-клетки (CXCR3+СD19+CD45+) (отн. В-клеток, %) 5,20 (2,02- 12,95) 19,52 (6,03- -40,1) <0,0001
CXCR3+ В-клетки (CXCR3+СD19+CD45+) (абс., 109/л) 0,008 (0,003 -0,019) 0,029 (0,008- -0,105) <0,0001
Примечание. нд — недостоверные различия. 73
ской крови, где практически не отличается от значений у здоровых доноров [14]. Рецептор CCR5, в основном, представлен на Т-клетках памяти, незначительное возрастание CCR5-положительных Th можно объяснить снижением клеток памяти у больных хроническими вирусными инфекциями.
Ранее было продемонстрировано, что лиганды рецептора CXCR3 играют существенную роль в иммунопатогенезе ХВГС [8], в связи с чем мы сосредоточились на изучении состава основных популяций CXCR3-положительных лимфоцитов. Было обнаружено увеличение содержания Th, несущих на своей поверхности CXCR3, в периферической крови больных ХВГС. Популяция CD4+ Т-клеток гетерогенна и включает субпопуляции клеток Th1, Th2, Th17; регуляторные Т-клетки, активированные Th, Th-памяти и другие, при этом почти все из них могут экспрессировать CXCR3 на своей поверхности. Данные субпопуляции обладают различными, иногда противоположными функциями. Таким образом, от баланса CXCR3+CD4+ Т-клеток, привлекаемых в печень при ХВГС, во многом зависит, в какую сторону будет развиваться иммунная реакция: воспаление или аутоиммунизация. С другой стороны, чрезмерный клеточный иммунный ответ может являться причиной повреждения клеток печени и активации процессов фиброгенеза [1].
В то же время, установлено, что количество эффекторных лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью (CTL, NK, TNK), несущих на своей поверхности молекулу CXCR3, у больных ХВГС не изменяется или уменьшается (NK), по сравнению с контрольной группой. Известно, что при ХВГС CTL в большей степени экс-прессируют различные тормозные рецепторы, чем клетки здоровых людей, и обладают функциональной анергией [13]. В экспериментах in vitro показано, что CTL также могут повреждать неинфицированные гепатоциты. Механизмы, лежащие в основе этой повреждающей аутореактивной деятельности CTL у ВГС-инфицированных людей, не известны. Предполагают, что при ВГС может быть задействован CD95 (Fas) антигенно-апоптотический путь, при котором происходит передача апоптотического сигнала за счет связи с соответствующим лигандом (Fas-FasL) [5], где Соге-белок ВГС индуцирует экспрессию FasL на клетках гепатобластомы. Кроме того, CTL могут вызывать повреждение печени опосредованно через цитокины, например, через TNFa. Уменьшение содержания популяций NK и TNK клеток в крови на начальных стадиях ХВГС может быть связано с дефицитом продукции активирующих цитокинов (IL-12) либо с усилением миграции этих клеток в печень. Как известно, у здоровых людей в периферической крови содержится около 13% NK и 4% TNK лимфоцитов, а в печени — около 37% NK и 26% TNK [16]. При заболеваниях печени пул внутрипе-ченочных NK и TNK клеток может увеличиваться до 90%. Эти клетки подвергаются многократной пролиферации в печени и селезенке и продуцируют большое количество IFNy и IL-4 [15].
TNK лимфоциты — это Т-клетки, экспрессирующие маркеры, свойственные NK клеткам. По мнению некоторых авторов, внутрипеченочные TNK клетки являются уникальной субпопуляцией Т-лимфоцитов, играющей важную роль в противоопухолевом иммунитете [12]. Многие исследователи связывают уменьшение содержания и активности TNK клеток в печени больных ХВГС с развитием гепатоцеллюлярной карциномы. Можно полагать, что TNK лимфоциты, также как и CTL, играют важную роль в повреждении печени [5, 12]. Прогрессирование ХВГС в цирроз печени связывают с продукцией инвариантными TNK клетками цитокинов, способствующих развитию фиброза печени: IL-4 и IL-13.
Отмечено, что белки ВГС могут модулировать уровень хемокинов и их рецепторов, ассоциированных с цитотоксическим ответом, ослабляя иммунные реакции [10]. Снижение экспрессии CXCR3 на цитотоксических популяциях лимфоцитов в периферической крови в течении ХВГС и уменьшение миграции данных клеток в печень могут стать одной из причин длительной персистенции ВГС в клетках печени и способствовать хронизации инфекционного процесса. Задержка клеточного ответа на
начальных этапах развития гепатита С, мутации в Т-эпитопах вирусных антигенов и функциональная анергия популяций цитотоксических клеток приводят к тому, что клеточное звено специфичного адаптивного иммунитета становится не способным адекватно бороться с ВГС.
Исследование количества В-лимфоцитов, несущих на своей поверхности хемо-киновый рецептор CXCR3, показало значительное увеличение популяции этих клеток у больных ХВГС. Известно, что у 40 — 45% больных ХВГС наряду с печеночными проявлениями наблюдаются разнообразные внепеченочные проявления: смешанная криоглобулинемия, мембранопролиферативный гломерулонефрит, поздняя кожная порфирия, аутоиммунный тиреоидит, В-лимфопролиферативные заболевания. ВГС помимо гепатоцитов способен инфицировать В-клетки. Возможно, это является одной из причин внепеченочного проявления гепатита С. В печени обнаруживается большое количество CXCR3-положительных В-клеток, которые подвергаются стимуляции провоспалительными цитокинами и действию белков ВГС, приводящих к повреждению ДНК клеток. Таким образом, возможно перерождение В-клеток в сторону ауто-реактивности и малигнизации [11].
Известно, что продукция коллагена звездчатыми клетками является ключевым процессом в развитии фиброза печеночной паренхимы. Поэтому факторы, в том числе хемокины, участвующие в активации звездчатых клеток, могут играть центральную роль в процессах фиброгенеза. Установлено, что CXCR3 на поверхности звездчатых клеток появляется под действием CXCL10; при этом звездчатые клетки сами являются источником продукции провоспалительных хемокинов. Таким образом, увеличение продукции хемокинов и привлечение реактивных клеток в печень способствуют усилению воспаления и могут усугублять развитие фиброза.
Л ИТЕРАТУРА
1. Арсентьева Н.А., Семенов А.В., Тотолян Арег А. Роль полиморфизма генов цитокинов при вирусном гепатите С. Инфекция и иммунитет. 2012, 2 (4): 687-698.
2. Жданов К.В., Гусев Д.А., Чирский В.С. и др. Экспрессия хемокинов и их рецепторов в крови и ткани печени при хроническом вирусном гепатите С. Мед. иммунология. 2007, 9 (4-5): 379-388.
3. Михайлов М.И. Вирусы гепатита. Клиническая гепатология. 2009, 1: 15-24.
4. Семенов А.В., Вашукова С.С., Рахманова А.Г. Предварительные итоги лабораторной диагностики вирусных гепатитов В и С в рамках приоритетной национальной программы «Здоровье» в Санкт-Петербурге. Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2010, 3: 61-64.
5. Ahmad A., Alvarez A. Role of NK and NKT cells in the immunopathogenesis of HCV-induced hepatitis. J. Leukoc. Biol. 2004, 76 (4): 743-759.
6. Apolinario A., Diago M., Lo Iacono O. et al. Increased circulating and intrahepatic T-cell-specific chemokines in chronic hepatitis C: relationship with the type of virological response to peginter-feron plus ribavirin combination therapy. Aliment. Pharmacol. Ther. 2004, 19: 551-562.
7. Bertoletti A., Maini M.K. Protection or damage: a dual role for the virus-specific cytotoxic T lymphocyte response in hepatitis B and С infection? Curr. Opin. Immunol. 2000, 12: 403-408.
8. Casrouge A., DecalfJ., Ahloulay M. et al. Evidence for an antagonist form ofthe chemokine CXCL10 in patients chronically infected with HCV J. Clin. Invest. 2011, 121 (1): 308-317.
9. Khakoo S.I., Thio C.L., Martin M.P. et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 2004, 305: 872-874.
10. Larrubia J.R., Benito-Martínez S., Calvino M. et al. Role of chemokines and their receptors in viral persistence and liver damage during chronic hepatitis C virus infection. World J. Gastroenterol. 2008, 14: 7149-7159.
11. Mizuochi T., Ito M., Saito K., Kasai M. et al. Possible recruitment of peripheral blood CXCR3+ CD27+ CD19+ B cells to the liver of chronic hepatitis C patients. J. Interf. Cytok. Res. 2010, 30 (4): 243-251.
12. Oo YH., Shetty S., Adams D.H. The role of chemokines in the recruitment of lymphocytes to the liver. Immunol. Liver Dis. 2010, 28: 31-44.
13. Penna A., Pilli M., Zerbini A. Molecular basis for the defective cytotoxic response in chronic HCV infection . J. Hepatol. 2005, 42 (2): 164-165.
14. Shimizu Y, Murata H., Kashii Y. et al. CC-chemokine receptor 6 and its ligand macrophage inflam-
matory protein 3 might be involved in the amplification of local necroinflammatory response in the liver. Hepatology. 2001, 34 (2): 311-319.
15. Sun J.C., Beilke J.N., Lanier L. Adaptive immune features of natural killer cells. Nature (Cr. Brit.). 2009, 457 (7229): 557-561.
16. Wozniakowska-Gesicka T. Winiewska-Ligier M., Kaluzynski A. Intrahepatic and peripheral blood NK cells in patients with chronic hepatitis C. Med. Wieku. Rozwoj. 2002, 6 (3): 203-211.
17. Zeremski M., Petrovic L.M., Chiriboga L. et al. Intrahepatic levels of CXCR3-associated chemok-ines correlate with liver inflammation and fibrosis in chronic hepatitis C. Hepatology. 2008, 48 (5): 1440-50.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Семенов Александр Владимирович, к.б.н.,
197101, С.-Петербург, ул. Мира, 14, р.т. (812)232-31-55
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
П.А.Лабжинов1, О.А.Свитич1, Л.В.Ганковская2, В.В.Зверев1
ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КОМПОНЕНТОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ЛЕЙКОЦИТАХ МЫШЕЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ IN VIVO
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 2Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, Москва
Цель. Изучить действие синтетических лигандов на динамику экспрессии генов TLR9 и BD-2 in vivo. Материалы и методы. Использованы синтетические лиганды, последовательность которых была гомологична ДНК и РНК вирусов человека. На 1, 7 и 28 сутки проводили взятие образцов крови у мышей линии BALB/c. Определение уровня экспрессии генов TLR9 и BD-2 оценивали с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Результаты. Максимальной эффективностью обладали следующие лиганды: tgg-ccc-ccc-ttg-tgg-acc-gg, ccg-gtc-cac-aag-ggg-ggc-ca и tcg-tcg-ttt-tgt-cgt-tgt-cg. В первые сутки после введения лигандов наблюдали резкое увеличение экспрессии гена TLR9 (в 62, 18 и 13 раз соответственно), но уровень экспрессии гена дефенсина при этом менялся незначительно. Заключение. Разработанный подход может быть использован для оценки действия этих препаратов на систему врожденного иммунитета, а именно, на активацию
TLRs.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 76—80
Ключевые слова: Toll-подобный рецептор, дефенсин, врожденный иммунитет, лиганд P.A.Labzhinov1, O.A.Svitich1, L.V.Gankovskaya2, V.V.Zverev1
EVALUATION OF EXPRESSION OF INNATE IMMUNITY COMPONENT GENES IN MICE LEUKOCYTES UNDER THE EFFECT OF SYNTHETIC LIGANDS IN VIVO
1Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, 2Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia
Aim. Study the effect of synthetic ligands on the dynamics of TLR9 and BD-2 gene expression in vivo. Materials and methods. Synthetic ligands were used whose sequence was homologous to DNA and RNA human viruses. At days 1, 7 and 28 blood sampling from BALB/c line mice was carried out. Determination of level of TLR9 and BD-2 gene expression was evaluated by using RT-PCR in real-time mode. Results. The following ligands had the maximum effectiveness: tgg-ccc-ccc-ttg-tgg-acc-gg, ccg-gtc-cac-aag-ggg-ggc-ca and tcg-tcg-ttt-tgt-cgt-tgt-cg. At day 1 after the administration of ligands a significant increase of TLR9 gene expression was observed (62, 18
