CC BY
02023 т 13 № 3 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК: 616-006.6. 576.8 DOI: 10.29039/2224-6444-2023-13-3-68-72
ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЫ МЕЛАНОМЫ МЫШЕЙ
Юрченко К. А.
Лаборатория молекулярной генетики и биотехнологий ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», Институт биохимических технологий, экологии и фармации, 295007, пр-т Вернадского 4, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Юрченко Ксения Андреевна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики и биотехнологий ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», Институт биохимических технологий, экологии и фармации, е-mail: yurchenkokseniya28@gmail.com
For correspondence: Yurchenko K. A., Junior Researcher Laboratory of Molecular Genetics and Biotechnology, V. I. Vernadsky Crimean Federal University, Institute of Biochemical Technologies, Ecology and Pharmacy, е-mail: yurchenkokseniya28@gmail.com.
Information about author:
Yurchenko K. A., https://orcid.org/0000-0002-0284-7059
РЕЗЮМЕ
Злокачественные меланоциты являются полезной моделью для изучения меланомы. Известно, что первичная культура клеток служит хорошей моделью, для изучения различных терапевтических подходов. Во времена персонализированной медицины, в особенности, в онкологии, требуется большое количество первичных опухолевых линий от пациентов, чтобы в дальнейшем проводить экспериментальные исследования препаратов in vitro, на модельных животных in vivo, а затем в клинических испытаниях. Однако, при культивировании первичной культуры возникают проблемы: низкое качество выделенных клеток, шок клеток из-за резкой смены среды, присутствие в клеточной культуре большого количества фибробластов, активно пролиферирующих при культивировании. Первичной культурой называют культуру клеток на стадии непосредственно после выделения клеток из образцов опухолевой ткани и до первого клеточного посева. Такую первичную культуру клеток, по-другому называют популяцией ex vivo. Микроокружение опухоли вызывает различные изменения в функциональности и фенотипе опухолевых клеток. Цель исследования -определить оптимальный метод для выделения первичной культуры, для культуры клеток меланомы мышей. Материал и методы. Исследование проведено на культуре клеток меланомы мышей Clone M-3. Также, для эксперимента были отобраны 6 мышей (12-18 г) из инбредной линии мышей BALB/c, самки, возрастом 3-4 месяца. Основными методами для исследования послужили: перевивка культуры клеток модельным животным, резекция образовавшейся опухоли, дезагрегация опухоли. Результаты. Выяснили, что при методе первичного экспланта, выход жизнеспособных клеток достоверно больше, чем при других методах дезагрегации опухоли. Обсуждение. Для определенной линии культуры клеток существует оптимальный метод выделения первичной культуры. У большинства перевиваемых клеточных линий при первом пассаже ухудшается пролиферативный потенциал, меняются культурально-морфологические свойства. Правильный выбор подходящего метода дезагрегации ткани и культивирования имеет особое значение для сохранения преимуществ и нежелательных эффектов в первичной культуре и в экспериментальных исследованиях. Заключение. В нашем эксперименте, наибольший выход меланоцитов из опухолевой ткани был при использовании первичного экспланта. Этот метод более длителен, по сравнению с ферментативной и механической дезагрегацией, но наиболее безопасен для клеток.
Ключевые слова: меланома, клеточная линия, первичная культура, культивирование
FEATURES OF OBTAINING A PRIMARY CULTURE OF MICE MELANOMA Yurchenko K. A.
Laboratory of Molecular Genetics and Biotechnology, V. I. Vernadsky Crimean Federal University, Institute of Biochemical Technologies, Ecology and Pharmacy, Simferopol, Russia
SUMMARY
Malignant melanocytes are a useful model for studying melanoma. It is known that primary cell culture serves as a good model for studying various therapeutic approaches. In the era of personalized medicine, especially in oncology, a large number of primary tumor lines from patients is required in order to further conduct experimental drug studies in vitro, in animal models in vivo, and then in clinical trials. However, when cultivating a primary culture, problems arise: low quality of isolated cells, cell shock due to a sudden change in the environment, the presence in the cell culture of a large number of fibroblasts that actively proliferate during cultivation. Primary culture is the culture of cells at the stage immediately after the isolation of cells from tumor tissue samples and before the first cell seeding. Such a primary cell culture is otherwise called an ex vivo population. The tumor microenvironment causes various changes in the functionality and phenotype of tumor cells. The aim of the stady - determine the optimal method for isolating the primary culture for the culture of mouse melanoma cells. Material and methods. The study was conducted on a mouse melanoma cell culture Clone M-3. Also, 6 mice (12-18 g) from the inbred line of BALB/c mice, females, 3-4 months old, were selected for the experiment. The main methods for the study were: transplantation of cell cultures into model animals, resection
of the resulting tumor, tumor disaggregation. Results. Found out that with the primary explant method, the yield of viable cells is significantly higher than with other methods of tumor disaggregation. Discussion. For a specific cell culture line, there is an optimal method for isolating the primary culture. In most transplanted cell lines, during the first passage, the proliferative potential deteriorates, and the cultural and morphological properties change. Proper selection of an appropriate tissue disaggregation and culture method is of particular importance to maintain benefits and adverse effects in primary culture and in experimental studies. Conclusion. In our experiment, the highest yield of melanocytes from tumor tissue was when using a primary explant. This method takes longer compared to enzymatic and mechanical disaggregation, but is the safest for cells.
Key words: melanoma, cell line, primary culture, cultivation
Метод первичного экспланта был впервые разработан в 1907 году [1]. Существует несколько видов дезагрегации опухолевой ткани: ферментативная, механическая, окончательное препарирование и метод первичного экспланта [2]. Если говорить о ферментативной дезагрегации ткани, то для нее используют протеолитические ферменты, трипсин, папаин, эластазу, гиалуронидазу, колла-геназу, проназу, аккутазу и дезоксирибонуклеазу [3]. Использование трипсина в большом количестве исследований на аутодермальных трансплантатах показало получение клеток с большей жизнеспособностью после трипсинизации [4], но существуют исключения клеточных культур, которым трипсин понижает жизнеспособность клеток, это клетки: карциномы кишечника [5], почек [6], островки поджелудочной железы. чем при использовании аккутазы [8]. Что касается механической дезагрегации, то этот процесс наиболее длителен по сравнению с трипсинизацией, но намного быстрее по сравнению с коллагени-зацией, и невозможен риск протеолитического повреждения клеток [9, 10]. Метод первичного экспланта требует последовательного субкультивирования для получения первичных опухолевых клеточных линий [11]. Многие клетки различных типов можно культивировать подобрав правильные методики.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования проведены с использованием оборудования Лаборатории молекулярной генетики и биотехнологий ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», института биохимических технологий, экологии и фармации с 2021 по 2022 год.
Клетки
В исследовании использовались клетки мела-номы мышей Clone M-3 Клетки культивировали в питательной среде DMEM F-12 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина, 1% пировино-градной кислоты и 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Трансплантацию клеток осуществляли с использованием фосфатно-солево-го буферного раствора Дульбекко (DPBS) и трип-синизировали с последующей нейтрализацией трипсина приготовленной питательной средой.
Мыши и перевивание культуры клеток
Для эксперимента были отобраны 6 мышей (12-18 г) из инбредной линии мышей BALB/c, самки, возрастом 3-4 месяца.
Подготовку клеток к трансплантации мышам проводили следующим образом: клетки удаляли и подсчитывали, а затем центрифугировали. Полученный осадок с клетками (2 х 105 клетки) ресуспендировали в 500 мкл раствора Хэнка. Аликвоты приготовленной суспензии клеток ме-ланомы вводили подкожно в межлопаточную область, располагая иглу шприца в горизонтальном положении.
На 18 сутки, после перевивки культуры клеток, образовались опухоли. Опухоли были круглыми, мясистыми, темно-синего цвета.
Резекция опухоли
Эвтаназия мышей осуществлялась путем передозирования эфирного наркоза, с последующей декапитацией под наркозом. После этого, животное помещали на препаровальный лоток и фиксировали опухолью кверху. Опухоль обрабатывали антисептическими средствами, и вдоль нее проводили надрез кожного покрова. Данная злокачественная опухоль имела инкапсулированную структуруи хорошо поддавалась изъятию из-под кожи при вскрытии. Опухоль помещали в стерильную пробирку, содержащую буфер DPBS.
Препарирование
Опухолевую ткань переносили в свежий стерильный раствор DPBS, в чашку Петри. Тщательно удаляли некротическое содержимое опухоли, жировые отложения и соединительную ткань. Полученную очищенную опухолевую ткань разделили на четыре части, для использования четырех методов дезагрегации ткани в первичную культуру.
Окончательное препарирование
Кусочки ткани размером 1 мм3 промывали стерильным раствором DPBS. С помощью стерильного пинцета, переносили кусочки в стерильную центрифужную пробирку и давали кусочкам осесть. Далее ресуспендировали кусочки ткани в DPBS 10 раз. Переносили кусочки в культу-ральный флакон 25 см2 ростовой поверхности и добавляли 2 мл ростовой среды. Ростовая среда состояла из питательной среды DMEM F-12
2023, т. 13, № 3
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
с добавлением 1% антибиотиков пенициллин/ стрептомицин, 1% пировиноградной кислоты и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Флаконы помещали в инкубатор при 37оС и 5% СО2 на сутки.
Механическая дезагрегация
Кусочки ткани размером 1 мм3 промывали стерильным раствором DPBS. С помощью протирания через сито для клеток получали дисперсную культуру, переносили ее в культуральный флакон 25 см2 ростовой поверхности и добавляли 1 мл ростовой среды.
Ферментативная дезагрегация
1. Теплым трипсином
Кусочки ткани размером 1 мм3 промывали стерильным раствором DPBS. С помощью стерильного пинцета, переносили кусочки в стерильную центрифужную пробирку и давали кусочкам осесть. Далее ресуспендировали кусочки ткани в DPBS 10 раз. Далее кусочки опухолевой ткани переносили в стерильную пробирку содержащую 2 мл 2,5% трипсина и перемешивали в течение нескольких часов. Далее содержимое переливали в центрифужную пробирку и центрифугировали 100 об/мин при 37оС. Диссоциированные клетки собирали каждые полчаса. К оставшимся не-диссоциированным кусочкам добавляли свежий трипсин для лучшего выхода клеток. Полученную суспензию клеток высеивали во флаконы с 25 см2 ростовой поверхности и добавляли 3 мл ростовой среды.
2. Холодным трипсином
Кусочки ткани размером 1 мм3 промывали стерильным раствором DPBS. С помощью стерильного пинцета, переносили кусочки в стерильную центрифужную пробирку и давали кусочкам осесть. Далее ресуспендировали кусочки ткани в DPBS 10 раз. Сливали надосадочную жидкость и добавляли охлажденный до 4оС 2 мл 2,5 % трипсина. Инкубировали 18 часов при 4оС. После инкубации отбирали диссоциированные клетки и высеивали во флаконы с 25 см2 ростовой поверхности и добавляли 3 мл ростовой среды.
Статистический анализ
Для всех количественных параметров определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и ошибку среднего. Для расчета сравнения средних использовался ^критерий Стьюдента. Использование средних значений и стандартного отклонения. Различия считали значимыми, если р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В нашем исследовании по получению первичной культуры меланомы мышей мы выделили три главных метода: ферментативная, механическая дезагрегация и метод первичного экспланта.
В ходе эксперимента производили контроль пересева на 24, 36, 42 и 54 часа. Из полученных данных (рисунок 1), при теплой трипсинизации жизнеспособными оставались только 5±1,01 (х104) клеток после суток пересева, в то время как в холодной 8*104±9х103. Спустя 54 часа после начала эксперимента клетки после холодной тринсинизации начали погибать и достигли 8±1 (х104) клеток. В результате этого, можно сказать, что после 54 ч эксперимента клетки меланомы теряют свою пролиферативную активность. Пик пролиферации клеток при теплой трипсиниза-ции достигали через 42 часа от начала пассажа, со снижением к 54 часам. Возможно, понижение пролиферативной активности клеток меланомы через 54 часа от начала эксперимента происходит из-за изначально малого выхода клеток из опухолевой ткани путем ферментативных дезагрегаций.
Рис. 1. Количество жизнеспособных клеток при разных способах дезагрегации. Примечание: Достоверная разница по сравнению с другими (теплая, холодная, механическая) методами дезагрегации (p<0,05); значения показаны со средними значениями и SE.
Fig. 1. Number of viable cells for different disaggregation methods. Note: *significant difference
compared to other (warm, cold, mechanical) disaggregation methods (p<0.05); values are shown with means and SE.
При механической дезагрегации выход клеток на первые сутки составлял 5*105 ± 6*103, а при первичном экспланте 7*105 ± 7*103, что в свою очередь показывает высокое количество выхода клеток, по сравнению с ферментативной дезагрегацией. На 36 часов и 54 часов после эксперимента выход клеток достоверно (р>0,05) увеличился по сравнению с другими видами дезагрегации.
В нашем эксперименте большую часть экс-планта удаляли уже после суток нахождения в культуральном флаконе, чтоб избежать контаминации (рис. 2).
Рис. 2. а — распространение клеток из прилипших фрагментов после выхода клеток из первичного экс-планта на 2 сутки после посева: S — скопление вышедших из экспланта клеток, R — остатки экспланта; б — клетки после удаления остатков экспланта, через 5 дней после эксплантации. Меланоциты представляли собой удлиненную веретенообразную форму Фазовый контраст. Объектив 4Х. Fig. 2. a - spread of cells from adherent fragments after cells exit the primary explant on day 2 after seeding:
S - accumulation of cells emerging from the explant, R - remains of the explant; b - cells after removal of explant remnants, 5 days after explantation. Melanocytes were elongated, spindle-shaped. Phase contrast 4X.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Дезагрегация ткани в первичную культуру составляет важную стадию в культивировании клеток. Большой выход клеток из опухолевой ткани можно получить при правильном подборе метода. В нашем эксперименте, наибольший выход меланоцитов из опухолевой ткани был при использовании первичного экспланта. Этот метод более длителен, по сравнению с ферментативной и механической дезагрегацией, но наиболее безопасен для клеток. Но и при использовании первичного экспланта есть риск контаминации. Некоторые исследователи считают, что диссоциация опухолевой ткани с использованием механических методов приводит к гибели клеток и не подходит для получения опухолевых клеток и введения их в первичную культуру [12-14]. Если сравнить механическую и ферментативную диссоциацию глиобластомы, некоторые исследователи отдают предпочтение ферментативным методам, получая клетки с более высокой миграционной активностью [12; 14].
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
Финансирование. Работа выполнена на средства государственного задания В.И. Вернадского на 2021 год и плановый период 2022-2023 годов FZEG-2021-0009 («Разработка олигонуклеотид-ных конструкций для создания селективных и высокоэффективных лекарственных средств для
медицины и сельского хозяйства», регистрационный номер 121102900145-0).
Funding. This research was funded by state assignment V.I. Vernadsky Crimean Federal University for 2021 and the planning period of 2022-2023 No. FZEG-2021-0009 ("Development of oligonucleotide constructs for making selective and highly effective drugs for medicine and agriculture", registration number 121102900145-0).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ambrose C. T. An amended history of tissue culture: Concerning Harrison, Burrows, Mall, and Carrel. J Med Biogr. 2019;27(2):95-102. doi: 10.1177/0967772016685033.
2. Фрешни Р. Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. Перевод с 5-го английского издания. Москва: Бином. Лаборатория знаний; 2011.
3. Li W. C., Ralphs K. L., Tosh D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods Mol Biol. 2010;633:185-96. doi:10.1007/978-1-59745-019-5_13.
4. Skog M., Sivler P., Steinvall I., Aili D., Sjoberg F., Elmasry M. The Effect of Enzymatic Digestion on Cultured Epithelial Autografts. Cell Transplant. 2019;28(5):638-644. doi:10.1177/0963689719833305.
5. Speirs V., Green A. R., White M. C. A comparative study of cytokine gene transcripts in normal and malignant breast tissue and primary cell cultures derived from the same tissue samples. Int Journal of Cancer. 1996;551-556. doi:10.1002/
2023, т. 13, № 3
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
(SICI)1097-0215(19960516)66:4<551::AID-IJC21>3.0.C0;2-9.
6. Chen W-T. Proteolytic activity of specialized surface protrusions formed at rosette contact sites of transformed cells. 1989;167-185. doi: 10.1002/ jez.1402510206.
7. Heald K. A., Hail C. A., Drowning R. Isolation of islets of Langerhans from the weanling pig. Diabetes Res. 1991;17:7-12.
8. Skog M., Sivler P., Steinvall I., Aili D., Sjoberg F., Elmasry M. The Effect of Enzymatic Digestion on Cultured Epithelial Autografts. Cell Transplant. 2019;28(5):638-644. doi:10.1177/0963689719833305.
9. Lasfargues E. Y., Coutinho W. G., Lasfargues J. C., Moore D. H. A serum substitute that can support the continuous growth of mammary tumor cells. In Vitro. 1973;8(6):494-500. doi:10.1007/BF02615953.
10. Hayflick L., Moorhead P. S. The serial cultivation of human diploid cells strains. Exp Cell. Res. 1961;25:585-21. doi:10.1016/0014-4827(61)90192-6.
11. Mitra A., Mishra L., Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;3 1(6):347-354. doi: 10.1016/j. tibtech.2013.03.006
12. Межевова И. В., Ситковская А. О., Кит О. И. Первичные культуры опухолевых клеток: современные методы получения и поддержания in vitro. Южно-Российский онкологический журнал/ South Russian Journal of Cancer. 2020;1(3):36-49. doi:10.37748/2687-0533-2020-1-3-4.
13. Cunningham R. E. Tissue disaggregation. Methods Mol. Biol. 2010;588:327-330. doi:10.1007/978-1-59745-324-0_32.
14. Skarkova V., Krupova M., Vitovcova B., Skarka A., Kasparova P., Krupa P. The Evaluation of Glioblastoma Cell Disso-ciation and Its Influence on Its Behavior. Int J Mol Sci. 2019 Sep 18;20(18):4630. doi:10.3390/ijms20184630.
REFERENCES
1. Ambrose C. T. An amended history of tissue culture: Concerning Harrison, Burrows, Mall, and Carrel. J Med Biogr. 2019;27(2):95-102. doi:10.1177/0967772016685033.
2. Freshni R. Y. Culture of animal cells. Practical guide. Translated from the 5th English edition. Moscow: Binom. Knowledge Lab; 2011. (In Russ.).
3. Li W. C., Ralphs K. L., Tosh D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods Mol
Biol. 2010;633:185-96. doi:10.1007/978-1-59745-019-5_13.
4. Skog M., Sivler P., Steinvall I., Aili D., Sjoberg F., Elmasry M. The Effect of Enzymatic Digestion on Cultured Epithelial Autografts. Cell Transplant. 2019;28(5):638-644. doi:10.1177/0963689719833305.
5. Speirs V., Green A. R., White M. C. A comparative study of cytokine gene transcripts in normal and malignant breast tissue and primary cell cultures derived from the same tissue samples. Int Journal of Cancer. 1996;551-556. doi:10.1002/ (SICI)1097-0215(19960516)66:4<551::AID-IJC21>3.0.CO;2-9.
6. Chen W-T. Proteolytic activity of specialized surface protrusions formed at rosette contact sites of transformed cells. 1989;167-185. doi: 10.1002/ jez.1402510206.
7. Heald K. A., Hail C. A., Drowning R. Isolation of islets of Langerhans from the weanling pig. Diabetes Res. 1991;17:7-12.
8. Skog M., Sivler P., Steinvall I., Aili D., Sjoberg F., Elmasry M. The Effect of Enzymatic Digestion on Cultured Epithelial Autografts. Cell Transplant.2019;28(5):638-644. doi:10.1177/0963689719833305.
9. Lasfargues E. Y., Coutinho W. G., Lasfargues J. C., Moore D. H. A serum substitute that can support the continuous growth of mammary tumor cells. In Vitro. 1973; 8(6):494-500. doi:10.1007/ BF02615953.
10. Hayflick L., Moorhead P. S. The serial cultivation of human diploid cells strains. Exp Cell. Res. 1961;25:585-21. doi:10.1016/0014-4827(61)90192-6.
11. Mitra A., Mishra L., Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;3 1(6):347-354. doi: 10.1016/j. tibtech.2013.03.006
12. Mezhevova I.V., Sitkovskaya A.O., Kit O.I. Primary tumor cell cultures: current methods of obtaining and subcultivation. South Russian Journal of Cancer. 2020;1(3):36-49. doi:10.37748/2687-0533-2020-1-3-4. (In Russ.).
13. Cunningham R. E. Tissue disaggregation. Methods Mol. Biol. 2010;588:327-330. doi:10.1007/978-1-59745-324-0_32.
14. Skarkova V., Krupova M., Vitovcova B., Skarka A., Kasparova P., Krupa P. The Evaluation of Glioblastoma Cell Disso-ciation and Its Influence on Its Behavior. Int J Mol Sci. 2019 Sep 18;20(18):4630. doi:10.3390/ijms20184630.
