CC BY
58
УДК 616.5-006.81-08:615.372.019
OPTIMIZATION OF THE AUTOLOGOUS ANTITUMORS GENE-MODIFIED VACCINES PREPARATION IN PATIENTS WITH DISSEMINATED MELANOMA
A.O. Danilov1, S.S. Larin2, A.B. Danilova', V.M. Moiseyenko1,1.A. Baldueva S.L. Kiselev, AS. Barchuk', V.V. Anisimov', G.I. Gaft on'. V.A. Kochnev', K.P. Hanson1
'N.N. Petrov Research Institute of oncology 2 Institute of gene biology
ABSTR.ACT
Here we investigated which methods of cell culture preparation from surgical species in 114 patients with disseminated melanoma best maintain transfer efficiency. In order to activate antitumor immune response tag 7 gene transfer by means of liposome delivery and electroporation was undertaken. Transfer efficiency was evaluated by the expression of two reported genes ( beta-galactosidase and EGFP) detected by fluorescence microscopy. Individual regime for each case of transfer is crucial for achieving the best results. We found that mechanical tumor desegregation with MEDl-machine is more suitable then with enzyme digestion. DMEM with 20% FCS and 25% human embryonic fibroblast culture medium is preferable for cells culture preparation. With the enhance of the modification procedure transfer efficiency was come up to 30%.
ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ КОЖИ
А. О. Данилов', С.С. Ларин2, А.Б. Данилова1, В. М. Моисеенко', И. А. Балдуева', С.Л. Киселев2, А.С. Барчук', В.В. Анисимов', Г.И. Гафтон1, В.А. Кочнев', К.П. Хансон'
'ГУН НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова М3 РФ
2Институт биологии гена РА Н
РЕЗЮМЕ
В работе представлены результаты апробации различных способов получения культур опу холевых клеток из операционного материала 114 больных диссеминированной меланомой кожи. Полученные данные позволили определить наиболее оптимальные условия культивирования опухолевых клеток. Для повышения их имму-ногенности использовали метод трансфекции геном tag 7 с помощью липосомной доставки и электропорации.
Результаты трансфекции оценивали по экспрессии репортерных генов р-галактозидазы и EGFP, продукты которых можно визуализировать микроскопически. Для модификации опухолевых клеток подобраны условия. при которых эффективность трансфекции достигает 30%.
Проведенные исследования позволяют утверждать, что условия для наиболее эффективной трансфекции необходимо подбирать индивидуально для клеток каждого пациента. Вместе с тем не вызывает сомнения, что более эффективным методом получения клеток является меха1шческая дезагрегация фрагментов опухоли по сравнению с ферментативной; для большей скорости прироста клеточной массы рекомендуется использовать среду DV1 ЕМ. в которую добавляют 20%ЭСКРС, 20% кондиционированной среды культуры фнбробластов легких эмбриона человека.
В последние годы благодаря значительным достижениям в области генетики, молекулярной и клеточной биологии повысился интерес к биотерапии злокачественных новообразований. Случаи спонтанной регрессии некоторых злокачественных опухолей, значительная продолжительность безрецидивного периода после ее
хирургического удаления, сенсиоилизация нммуноком-петентных клеток больного к опухолевым клеткам и способность лизировать их, по крайней мере, in vitro, убедительно свидетельствуют в пользу того, что иммунная система играет определенную роль на некоторых этапах «естественной истории развития» опухоли [4:12;
13; 16]. Это утверждение является отправной точкой для различных молекулярно-биологических приемов воздействия на клеточный и гуморальный иммунитет пациентов. Поэтому перспективной остается разработка методов, направленных па активацию естественного противоопухолевого иммунитета (методы активной иммунотерапии). Важное место здесь занимает вакцинотерапия, в том числе на основе геномодифшшрован-ных аутологичных опухолевых клеток [1:4: 20]. Модификация генетического аппарата опухолевых клеток используется с целью усиления нх иммуногенности. что позволяет индуцировать новые эффекторные клетки и/ или усиливать существующий противоопухолевый иммунный ответ. Один из наиболее перспективных молекулярно-биологических подходов к созданию противоопухолевых вакцин — введение в опухолевую клетку генов цитокинов или других стимуляторных белков, привлекающих и активирующих антиген-представля-юшне клетки (ЛИК). В результате ожидается обучение и стимуляция цитотоксических Т-лимфоцитов против антигенов клеток данной опухоли [3]. При этом становится несущественным, какой именно набор антигенов несут злокачественные клетки, т.е. метод не связан напрямую с маркерами, экспрессируемыми в данной опухоли. Этот момент представляется особенно важным, поскольку известно широкое разнообразие генетических портретов опухолей.
В отделе молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН уже около 10 лет ведутся работы по исследованию генов, участвующих в развитии новообразований и. в частности, в процессе метастазирова-пня. В экспериментах на животных было показано, что продукт выделенного из клеток метастазнругошей в печень адепокаршшомы молочной железы мыши гена lag? обладает свойством подавлять рост опухоли, причем степень подавления роста опухоли коррелирует со степенью экспрессии этого гена [13]. В настоящее время проклонирован человеческий аналог гена tag7. белок которого имеет 70%-ную гомологию с белком Tag7 мыши, последний, в свою очередь, обладает выраженной гомологией с каталитическим доменом лизошша и слабой гомологией с членами семейства фактора некроза опухоли. Tag7 является секретируемым белком, который выявляется в мембранной фракции клеток и в культуральной среде. Он обладает цитотоксичностью по отношению к целому ряду линий опухолевых клеток. причем гибель клеток осуществляется путем апоп-тоза [13]. Данные экспериментов на животных дают основания предполагать, что. помимо прямого токсического действия, этот белок активирует через посредство АПК лимфоциты, которые атакуют и разрушают как модифицированные, так и неизмененные опухолевые клетки [8]. Кроме того, в противоопухолевое действие вовлечены и В-лнмфоциты [8]. Таким образом, есть основания считать, что трансфекция опухолевых клеток геном tag7 может быть использована для терапии злокачественных новообразований человека.
В ряде клинических исследований установлено, что наиболее эффективными методы вакцинотерапии оказываются при лечении больных диссеминированной меланомой кожи. При этом результаты сопоставимы с современной химио-иммунотерапией [5:19]. Приготов-
ление вакшш является, по существу, производством лекарственного препарата, что требует выработки четких технологических условий по оптимизации и стандартизации процессов приготовления опухолевых клеточных линий, их модификации, а также строжайших сашггарных условий, исключающих возможность контаминации материала. Трудоемкость методов и их высокая стоимость приводят к тому, что до настоящего времени эти методы являются экспериментальными и не нашли широкого применения в клинической практике. поэтому попытки выработать рекомендации по оптимизации получения аутологичных генетически модифицированных противоопухолевых вакцин представляется актуальной научно-практической задачей.
Материалы и методы
Для приготовления культур опухолевых клеток использовали операционный материал 114 больных диссеминированной меланомой кожи, получавших лечение в НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова с 2001 по 2002 г.
Технология приготовления вакцины на основе аутологичных генетически модифицированных опухолевых клеток предполагает дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, их трансфекцию и анализ экспрессии введенных генов с помощью имму-ноблотинга.
Дезагрегация образцов опухоли
Сравнивались 2 способа дезагрегации: механический и ферментативный. Для этого фрагменты опухоли разделяли па кусочки размером 2-3 мм5, промывали их в растворе Хенкса без ионов кальция и магния, помещали в 0,25%-ный раствор трипсина на фосфатносолевом буфере; в раствор Хенкса. содержащий 0,03% ДНКазы (Sigma) и 0,14% коллагеназы типа I (Sigma), и инкубировали при непрерывном помешивании 1,5 ч. при 37°С и 5% СО,, отбирая высвободившиеся клетки каждые 30 мин. Затем клеточную суспензию профильтровывали через стерильные нейлоновые фильтры Филкон (Dako, Дания) и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. При механической обработке образцы опухолевой ткани разделяли на фрагменты 2-3 мм' и растирали в 0,5 мл культуральной среды в гомогенизаторе. 11араллелыю использовали медимашину (Dako. Дания). Кусочки опухоли помещали на стерильные ножи и подвергали диссоциации в течение 30 с - 1 мин. После механической обработки фрагментов опухоли супернатант пропускали через стерильные нейлоновые фильтры, суспендировали в среде для культивирования и переносили в культуральную посуду. Для проверки жизнеспособности полученных монокультур опухолевые клетки окрашивали акридиновым оранжевым и бромистым этидием (Sigma. США) с последующим апализом препаратов в люминесцентном микроскопе.
Культивирование опухолевых меток
Полученные опухолевые клетки культивировали при 37"С. 5% СО. и 100% влажности на пластиковых матрасах (Sarstedt. ФРГ). Для изучения оптимального соотношения компонентов питательных сред исполь-
зовали DMEM (Sigma, США). RPMI-1640 (Serva, ФРГ), разное количество сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС) (5; 10:20"(Биолот. РФ), кондиционировапные среды культур фибробластов легких эмбриона человека, L-глютамин, пируват натрия, витамины (Sigma. США). Эффективность добавок к ростовой среде определяли но скорости прироста клеток. Для этого высаживали выделенные клетки по 2 х 10’ на лунку в 96-луночной планшете в питательной среде, подлежащей проверке. На 3-и сутки подсчитывали клетки в камере Горяева.
Фотографировали препараты с помощью компьютерной системы анализа изображения, состоящей из стандартного светового микроскопа, инвертированного микроскопа, люминесцентного микроскопа, по-лихромной камеры Chiper, платы захвата изображения U tech п программного морфометрнческого пакета Image-Pro-Plus (США).
Трансфекция опухолевых клеток
Для модификации геном tag7 опухолевых клеток in vitro использовали метод трансфекции с помощью 2 типов липосом и электропорации. Препараты для ли-посомной трансфекции (связывающий буфер ЮмМ Hepes, 0,9% NaCl, pH 7.4: Enchancer; Unifectin-21; Unifectin-56) любезно предоставлены к.б.н. A.IO.Cy-ровым (ИБХ РАН). В соответствии с рекомендациями разработчика накануне трансфекции клетки высевались в плотности 60-80%-ного монослоя. В день трансфекции смешивали ДНК и липиды для формирования трансфекционной смеси. Ее добавляли в культуральную среду клеток, подлежащих трансфекции, и инкубировали 24-72 ч. Затем трансфецированные клетки снимали с культуральной поверхности с использованием версена и проводили анализ экспрессии введенных генов. С этой целью применяли генетические конструкции, кодирующие ген Р-галактозидазы и EGFP-ген. Эти репортерные гены экспрессируют белки, присутствие которых можно выявлять визуально при помощи микроскопии препаратов. Экспрессию гена, кодирующего Р-галактозидазу, определяли через 24-72 ч после трансфекции с использованием в качестве хромогенного субстрата X-gal (5-Бром-4-хлор-3-индолил P-D-галактопи-ранозид) [18]. Экспрессию гена EGFP определяли по свечению белка GFP в ультрафиолетовом свете. Эффективность трансфекции оценивали по соотношению окрашенных (трансфецированных) клеток и общего количества клеток.
При электропорации применяли кратковременное воздействие сильным электрическим полем, в результате чего возникала создаваемая при помощи электрических импульсов перфорация цитоплазматической мембраны. Для эффективной электропорации и сохранения жизнеспособности клеток использовали параметры, рекомендуемые фирмой-разработчиком для эукариотических клеток: вольтаж ниже 1000 В, емкость выше 500 мкФ. Электропорацию осуществляли на приборе Gene Pulser II electroporator (Bio-Rad. СШA). 5 x 10* клеток в 1 мл культуральной среды без сыворотки, в которую добавляли 50 мкг ДНК. помешали в кювету и 3-кратно повторяли импу льс. Результат электропорации просматривали через 24 ч.
Электрофорез вДНС-ПААГи шшуноблот анализ
Разделение белков проводилось в денатурирующем 15% ДСН-ПААГ(толщина 0.75 мм) по Лэммли [13] в камере для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific). Использовали электродный буфер: 20 mM Tris. 0.2 М глицин, 0.1% SDS. Электрофорез осуществляли в режиме постоянного напряжения 90 В в концентрирующем геле. 120 В—в режиме разделения. Длина разделяющего геля составляла 10 см. В качестве стандартов молекулярных весов использовали Prestained High-Range Protein Molecular Weight Markers (Gibco BRL. США). Посте окончания гель-электрофореза белкн в геле окрашивали Кумасси ярко-голубым R-250 (Sen a, ФРГ) [16] либо переносили на мембрану PVDF (Amersham) для нммуно-блотипга с использованием Т70 Semi-Dry Transfer Unit (Hoefer Scientific) в соответствии с рекомендациями производителя оборудования. После электропереноса мембраны окрашивали либо помешали в блокирующий раствор для последующего иммуноблотинга.
Иммуноблот-аналнз проводили по стандартной методике [6]. Мембраны, содержащие исследуемые образцы, блокировали в буфере TBS-T. содержащем 5% обезжиренного сухого молока, в течение ночи и затем окрашивали поликлональными кроличьими антителами к рекомбинантному белку Tag 7 и/или моноклональными антителами к синтетическому эпитопу EFRH (Novartis. Швейцария). Детекцию иммунного окрашивания проводили с помощью люминесцентной ферментативной реакции, используя набор реагентов ECL +plus Western Blotting Detection System (Amersham. Англия) и пленки для автографии BioMax MS (Kodak. Япония).
Результаты и обсуждение
Способы дезагрегации образцов опухолей сравнивали на материале, полученном от 54 больных меланомой кожи. Каждый образец опухоли делили на 3 фрагмента, которые проходили ферментативную диссоциацию трипсином, коллагеназой. а также механическую диссоциацию. Были получены следующие данные: количество жизнеспособных клеток, выделенных при ферментативной обработке трипсином, составило 30.4 ± 8.8%, коллагеназой — 68,1± 10.2%, при механической диссоциации с помощью гомогенизатора и медимашнны практически оставалось одинаковым и составляло 84.3 ± 12.1% (рис. 1. А. Б. В на цветной вкладке). После предварительной работы по подбору условий дезагрегации опухолевого материала последующие образцы опухолей больных измельчали механическим способом.
На основапш! выявленных различии в состоянии опухолевой ткани (клеточная плотность, наличие стро-мы. некрозов и т.п.) были установлены стандарты времени дезагрегации ткани до одиночных клеток в условиях автоматического измельчителя ткани «.Медимашнны» (DAKO. Дания), наборов стерильных ножей (Медиконы) и клеточных фильтров (Филконы) (DAКО, Дания). Это время для ткани с некрозами составило 3-10 с (образцы опухоли 54 больных), для плотного субстрата — 30-60 с (образцы опухоли 6 больных). В то же время медимашина не позволяет визуально контролировать процесс измельчения опухолевого материала.
что затрудняет процесс подбора времени обработки опухолевых фрагментов, индивидуального дня каждого случая, и при длительном периоде механического воздействия монокультура опухолевых клеток может оказаться «загрязненной» сгромальными элементами, чрезвычайно отзывчивыми на питательные добавки в ростовой среде (рис. 2 на цветной вкладке). Поэтому, как показывает наш опыт, для отдельных образцов опухолевой ткани (незначительный по объему операционный материал, сильно некротизированиый материал) предпочтительна шадяшая дезагрег ация с использованием ручных стерильных гомогенизаторов.
В ходе цитологической верификации обнаруживались морфологические различия клеточных линий, полученных от разных пациентов, касаюшиеся размера клеток, степени пигментации, типа роста и других признаков, что можно было наблюдать при прижизненном микроскопироваиии культур опухолевых клеток (рис. 3. А. Б. В. Г на цветной вкладке). В определенной степени скорость пролиферации зависела от условий культивирования, изменение которых способствовало активации пролиферации клеток медленно растущих опухолей, но было строго индивидуально для каждого случая. Неудачи в культивировании, связанные с малым выходом жизнеспособных опухолевых клеток, низкой скоростью их роста, повышенной потребностью в питательных веществах (витамины, гормоны и т.п.), большой примесью стромалышх и других элементов, в ряде случаев удавалось преодолеть. варьируя состав питательной среды. Однако по-прежнему эти критические факторы необходимо учитывать при установлении культур индивидуальных опу холевых линий.
Опухолевые клетки 36 больных культивировали в различных условиях для определения состава питательной среды, что позволило определить ее оптимальные параметры для их жизнедеятельности и пролиферации. Результаты подбора условий культивирования опухолевых клеточных линий меланомы кожи продемонстрированы на рис. 4. Об эффективности действия добавок к ростовой среде судили по скорости прироста клеток на 3-є сутки. Как следует из рисунка, питательная среда DMEM предпочтительнее по сравнению со средой RPN1I-1640. Увеличение содержания сыворотки в среде приводит к более активному росту опухолевых клеток. Добавление стерильной кондиционированной среды культуры фибробластов легких эмбриона человека также способствует более активной пролиферации клеток меланомы кожи. В дальнейшем при культивировании опухолевых клеток мы руководствовались полученными данными.
После подбора условий выделения и культивирования опухолевых клеток 24 клеточные культуры меланомы кожи были модифицированны геном tag7. Для выявления наиболее оптимальных условий модификации опухолевых клеток мы использовали метод транс-фекции с помощью 2 типов липосом и электропорации.
Эффективность трансфекции оценивали в предварительных опытах по ко-трапсфекции с репортерными плазмидами, кодирующими (5-галактозидазу и белок GFP. Были использованы 2 липосомальные системы: Unifectin-21 и Unifectin-56. После подбора оптималь-
100
90
80
70
60-
50-
40
30
20
ю
о
rh
т
№
DDMEM. 5 tCKPC QDMtM. 10%СКРС
□ DMEM, 20% СКРС
□ DMEM, 20’ .. СКРС, 20%ФЛЭЧ
□ DMEM, 20% СКРС. витамины
■ RPMI. 5', СКРС
□ RPMI. 10"; СКРС
□ RPMI 20- СКРС
О RPM1. 20 СКРС. 20% ФЛЭЧ
□ КРМ1.20%СКРС. витамины
состав среды
Рис. 4. Результаты подбора условий культивирования клеток меланомы кожи:
но осн абсцисс - состав среды: но оси ординат - скорость прироста клеток, выраженная в процентах по отношению к их начальной концентрации (р< 0.05)
пых условий трансфекции её эффективность для культур опухолевых клеток разных пациентов составила 4% (min) — 10% (шах) при использовании системы липосом Unifectin-21; 12 % (min) — 30 % (max) при использовании системы липосом Unifectin-56 (см. таблицу): эффективность трансфекции с помощью электропорации была очень низкой и составила l%(min) — 2% (max) (рис. 5, А. Б на цветной вкладке). Таким образом, в качестве основного был выбран липосомный метод трансфекции, система липосом Unifectin-56 оказалась наиболее эффективной для генетической модификации опухолевых клеток (см. рис. 5, В. Г. Д. Е на цветной вкладке).
Мы пришли к выводу' о необходимости подбирать условия оптимальной трансфекции индивидуально для каждого пациента. Анализ экспрессии гена р-галак-тозидазы. введенного в опухолевые клетки, показал, что этот метод дает сходные результаты с данными по экспрессии гена EGFP (рис. 6. А, Б на цветной вкладке). Однако представляется предпочтительным использовать для подбора условий эффективной трансфекции репортерный ген EGFP. так как этот способ методически проше н требует меньших затрат времени.
Чтобы выявить присутствие экспрессии белка Tag7 в опухолевых клетках больных, производили им-муноблот-анализ их лизатов до и после трансфекции геном tag 7 (рис. 7 на цветной вкладке). Иммунное окрашивание позволило подтвердить эффективность произведенной трансфекции: опухолевые клетки 24 больных модифицировали, и только 15 образцов дали положительный результат в иммуноблотнпге.
В данном исследовании мы провели сравнительный анализ различных способов получения и ведения культур клеток меланомы кожи больных, которым была назначена вакцинотерапия с помощью аутологичных, генетически модифицированных опухолевых клеток. Для данного вида опухоли в целом предпочтительней оказа-
ЕЛ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ БИОТЕРАПИЯ
Эффек тивность трансфекции выделенных опухолевых клеток больных диссеминированной меланомой кожи
Больной Первичная опухоль Эффективность трансфекции опухолевых клеток, % Использованная система липосом
№ Возраст, пол Тип Уровень по Кларку
1 31. ж Меланома V 7 Unifectin-21
2 41, м Меланома V 8 Unifectin-21
3 34, м Меланома Не указан 10 Unifectin-21
4 35, ж Меланома Не указан 10 Unifectin-21
5 46, ж Меланома ГУ 5 Unifectin-21
6 28, м Меланома IV 6 Unifectin-21
7 62, м Меланома Не указан 12 Unifectin-56
8 48, ж Меланома Не указан 30 Unifectin-56
9 59, ж Меланома III 4 Unifectin-21
10 34, ж Меланома Не указан 4 Unifectin-21
11 51, м Меланома II 6 Unifectin-21
12 33, ж Меланома IV 4 Unifectin-21
13 22, м Меланома V 12 Unifectin-56
14 23. ж Меланома V 15 Unifectin-56
15 66, ж Меланома Не указал 30 Unifectin-56
лась механическая дезагрегация. В большинстве случаев полученные культуры опухолевых клеток изначально имели суспензионный тип роста. Клетки 9 больных имели полусуспензионный тип роста. 4 больных—адгезионный. Кроме того, клетки, выделенные из фрагментов опухолей разных больных, имели морфологические отличия в размерах, форме, степени пигментации, что совпадает с данными других авторов, получивших индивидуальные клеточные линии меланомы, которые описали полигональную, звездчатую, вытя! 1утую форму клеток [11], Варьирование состава пнтательпой среды для культивирования полученных опухолевых клеток влияло на тип роста культуры и скорость пролиферации. Среда DM ЕМ способствовала более активному размножению меланомных клеток по сравнению со средой RPMI-1640. Одно го преимуществ химического состава DMEM — высокое содержание глюкозы (4.5 г/л)—отмечается в ряде работ как положительный фактор для успешного приготовления клеточных линий меланомы [11]. При культивировании первичных культур меланомы кожи с целью активации их размножения мы использовали стерильную кондиционированную среду культуры фибробластов легких эмбриона человека, что соответствует данным литерату ры: фибробласты способны продуцировать факторы. усиливающие опухолевый рост [10]. Активная пролиферация опухолевых клеток in vitro сокращает сроки приготовления противоопухолевых вакцин, что немаловажно дня успешного лечения больных
Как известно, общепринятые методы доставки чужеродных генов в клетки подразделяются на химические, физические и биологические [2]. В нашей работе для модификации геном tag7 опу холевых клеток in vitro мы использовали метод трансфекции с помощью 2 типов липосом (биологический способ доставки) и электропорации (физический способ доставки). В качестве основного был выбран липосомнын метод трансфекции как наиболее щадящий. Важным преимуществом последнего метода является то, что положительный заряд на поверхности липидных пузырьков —
липосом обеспечивает их активное слияние с отрицательно заряженными клеточными мембранами и прямое попадание чужеродной ДНК в цитоплазму, минуя эндосомы и соответственно не подвергаясь действию лизосомальных гидролаз, в то время как при электропорации создаваемая при помощи электрических импульсов перфорация цитопла зматической мембраны по данным тестов, регистрирующих частоту трансформации опухолевых клеток, не дает аналогичного эффекта. Липосомальная система «Unifectin-56» оказалась наиболее эффективной, однако даже при ее использовании в соответствии с рекомендациями разработчика эффективность трансфекции была достаточно низкой и составила максимально 30%.
Для выявления экспрессии белка Tag 7 в опухолевых клетках больных производили иммуноблот-ана-лиз лизатов опухолевых клеток до и после трансфекции геном tag 7. С помощью иммунного окрашивания мы выявляли присутствие или отсутствие искомого белка в образцах, что позволяло подтвердить наличие генетической модификации опухолевых клеток после произведенной трансфекции. Известно, что эффективность использования модифицированных цитокнном опухолевых клеток для индукции противоопухолевого иммунитета зависит от количества продуцируемого цитокина [9]. Поэтому использование иммуноблот-анализа для выявления синтеза белка, введенного в клетки гена, помогает в создании геноинженерных противоопухолевых вакцин.
Выводы
В результате проведепного исследования удалось показать, что:
1. Автоматическая механическая дезагрегация образцов опухолей достаточно эффективна, в то же время в отдельных случаях возможно использование ручных стерильных гомогенизаторов.
2. Оптимальными условиями культивирования большинства клеточных лшшй являются среда DMEM
-
-
(Sigma, США). 20% СЭКРС. 20% кондиционированной среды фибробластов легких эмбриона человека. Целесообразно при медленном росте культуры клеток меланомы кожи вводить в питательную среду витаминные добавки.
3. Наиболее эффективна система трансфекции с помощью лииосом Unifectin-56.
4. Условия эффективной грансфекцнн необходимо подбирать индивидуально для каждого пациента.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барышников А . Ю Противоопухолевые вакцины //Российский Биотер. Журнал. — 2002.— Т. 1,№2.—С. 12—14.
2. Горбунова В. Н . Баранов В С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапню наследственных заболеваний. — Спб.: Специальная Литература. 1997. — 287 е.
3. Киселев С.Л., Ларин С, С., Г'нучев Н. В.. Георгиев Г П, Ген tae7 и генотерапия рака И Гснстика. — 2000. — Т. 36. № 11—С. 1431-5.
4. Моисеенко В. М. Бнотерапия солидных опухолей // Вопр. онкол. — 2000. Т 44. № 1. — С 120-5.'
5 Моисеенко В М . Балдуева П А . Хансон К.П. Вакцинотерапия злокачественных опухолей II Вопр. онкол. — 1999.
— Т. 45. №3. — С. 327-332.
6. MuxataoeA.T., Сибирский В Н. Методы иммунохимичес-кого анализа в биологии развития (практическое руководство).— М.: Наука. 1991. — 288 с.
7. Хансон К.П.. Афанасьев Б.В.. Берштейн Л.М. идр Современные тенденции в развитии биологической терапии злокачественных опухолей // Вопр. онкол. — 1996. — Т.42. №3, —С. 7-12
8. Georgiev G. P.. Kiselev S.L., Lukanidin Е. М Genes involved in the control of tumor progression and their possible use for gene therapy//Gene Ther. Mol. Biol.— 1998, — Vol.l.
— P. 381-9.
9. Colombo M.P.. Forni G. Cytokine gene transfer in tumor
inhibition and tumor therapy: were are we now? II Immunol. Today. — 1994 — Vol. 15. — P 48-51.
10. Cornil /.. Theodorescu D.. Man S el al. Fibroblast cell interactions with human melanoma cells affect tumor cell growth as a function of tumor progression II PNAS. — 1991. _ Vol. 88. — P 6028-6032.
11 .Hoal-van Helden E.G., Wilson E.L., Dawdle E.B Characterization of seven human melanoma cell lines: melanogcncsis and secretion of plasminogen activators // Br J. Cancer. — 1986. — Vol.56, N2.-P. 287-295.
12. Houghton AN.. Gold J.S., Blachere N.E. Immunity against cancer: lessons learned from melanoma // Curr. Opin. Immunol. — 2001. — Vol.l 3. — P. 134-140.
13. Kiselev S. L., Kuslikova O.S.. Korobko E V. etal. Molecular Cloning and Characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine // J.Biol.Chem. — 1998. — Vol. 273. N29. - P. 18633-9.
14.Laemli U.K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. — 1970.— Vol. 227, —P. 680-5.
15. Letter W. (V.. Ying H.. Restifo N.P. DNA and RNA-based vaccines: principles, progress and prospects II Vaccine. — 2000. — Vol. 18. — P. 765-777.
16. Nestle F. O.. Dummer K New perspectives on immunobiology and immunotherapv of melanoma // Immunol. Todav. — 1998, — Vol. 20. N 1, —P 5-7.
17. Sumbrook J.. Fritsch E.F.. Maniatis T. Molecular cloning.
— 2'“ ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Ann Arbor. Ml. 1989.
18.Sanes JR. Rubenstein J.F.. Nicolas J.F. Use of a recombinant retrovirus to study post-implantation cell lineaee in mouse embrvos II EMBO J — 1986. — Vol. 5.
— P. 3133-3142.
19. Vile R , Souberbielle B . Dalgleish A G Tumor vaccines II Immunotherapy in Cancer / Eds. Gore M., Riches P. — London, 1996 —P.157-191.
20. Xu M., Qui G, Jiang Z, Humphreys R E. Genetic modulation of tumor antigen presentation II Trends Biotechnol. — 2000.— Vol.18. N4. — P. 167-172.
