CC BY
59Ветеринарный врач. 2023. № 2. С. 70 - 77. The Veterinarian. 2023; (2): 70 - 77
Научная статья УДК 637.07
DOI: 10.33632/1998-698Х_2023_2_70
Особенности подбора праймеров и зондов гена каппа-казеина (CSN3) для проведения полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
Саида Нурбиевна Марзанова1, Нина Валерьевна Коновалова2, Яков Игоревич Алексеев2, Юрий Михайлович Ходарович3, Давуд Абдулсемедович Девришов1, Нурбий Сафарбиевич Марзанов4
1Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина, Москва, Россия. 2ООО «НПФ Синтол», Москва, Россия.
3ФГБУН Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Россия, Москва.
4Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени Л.К. Эрнста», Подольск-Дубровицы, Московская область, Россия.
Автор, ответственный за переписку: Саида Нурбиевна Марзанова, s.marzanova@mail.ru
Аннотация. Впервые на основе биоинформативных решений представлена технология создания тест-системы для диагностики 4-х аллелей (CSN3^ CSN2^ CSN2C, CSN2E) в локусе каппа-казеина. Биоинформатика является важным инструментом, который значительно улучшает работу исследователя. В статье дано описание этапов работы с базой данных NCBI и программами Oligo 6.0, Primer3 для поиска последовательностей гена каппа-казеина и подбора праймеров и зондов. Все приводимые этапы работ являются актуальными при разработке ПЦР наборов. Описывается алгоритм действий, способствующий формированию общего представления по созданию набора для определения аллелей и генотипов в локусе каппа-казеина у крупного рогатого скота. Показано как идет подбор температурного режима, праймеров, зондов. Зонды метили флуорофорами FAM -карбоксифлуоресцеин и R6G - карбоксиродамин-6G. В качестве гасителей флуоресценции использовали RTQ1 (гаситель флуоресценции семейства RTQ) и BHQ2 (гаситель флуоресценции семейства BHQ). В целях визуализации эксперимента, была представлена схема расположения праймеров и зондов в последовательности геномной ДНК по гену каппа-казеина (CSN3). В ней отмечены места гибридизации праймеров CSN_F, CSN_R и аллельспецифичных CSN3-MaeII-wt, CSN3-MaeII-m, CSN3-HinfI-wt2, CSN3-HinfI-m2, CSN3-HaeIII-wt, CSN3-HaeIII-m2 зондов. В результате полученных данных, было решено остановиться на 40 циклах амплификации. При поиске гомологии с помощью интернет-сервиса Nucleotide BLAST online была показана гомология результатов секвенирования с последовательностью гена CSN3 на уровне 99,28%. Аллель CSN3B является генетическим маркером, ассоциированный с сыропригодностью коровьего молока, что имеет важное значение для правильного определения генотипов и аллелей в данном локусе.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, породы, молоко, локус, каппа-казеин, генотип, аллель, полиморфизм, ДНК-технологии, праймеры, CSN3, ПЦР, NCBI.
Features of the selection of primers and probes of the kappa-casein gene (CSN3) for polymerase
chain reaction with real-time detection (RT-PCR)
Saida Nurbievna Marzanova1, Nina Valerievna Konovalova2, Yakov Igorevich Alekseev2, Yuriy Mikhailovich Khodarovich3, Davud Abdulsemedovich Devrishov1, Nurbiy Safarbievich Marzanov4
1The Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skriabin, Moscow, Russia.
2Closed Joint Stock Company «Sintol», Moscow, Russia.
3Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RAS (IBCh RAS), Moscow, Russia.
4L.K. Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry, Podolsk-Dubrovitsy, Moscow Region, Russia.
Corresponding author: Saida Nurbievna Marzanova, s.marzanova@mail.ru
Abstract. For the first time, based on bioinformatic solutions, a technology for creating a test system for the diagnosis of 4 alleles (CSN3A, CSN2B, CSN2C, CSN2E) in the kappa-casein locus is presented. Bioinformatics is an important tool that greatly improves the work of a researcher. The article describes the stages of working with the NCBI database and the Oligo 6.0, Primer3 programs for searching for kappa-casein gene sequences and selecting primers and probes. All the above work steps are relevant in the development of PCR kits. An algorithm of actions is described that contributes to the formation of a general idea for creating a set for determining alleles and genotypes in the kappa-casein locus in cattle. It is shown how the selection of the temperature regime, primers, probes is going on. The probes were labeled with fluorophores FAM— carboxyfluorescein and R6G—carboxyrodamine-6G. As fluorescence quenchers, RTQ1 (fluorescence quencher of the RTQ family) and BHQ2 (fluorescence quencher of the BHQ family) were used. In order to visualize the experiment, a layout of primers and probes in the genomic DNA sequence for the kappa-casein gene (CSN3) was presented. It marked the sites of hybridization of primers CSN_F, CSN_R and allele-specific CSN3-MaeII-wt, CSN3-MaeII-m, CSN3-HinfI-wt2, CSN3-HinfI-m2, CSN3-HaeIII-wt, CSN3-HaeIII-m2 probes. As a result of the obtained data, it was decided to stop at 40 amplification cycles. When searching for homology using the Nucleotide BLAST online Internet service, the homology of the sequencing results with the CSN3 gene sequence was shown at the level of 99.28%. The CSN3B allele is a genetic marker associated with the cheese suitability of cow's milk, which is important for the correct determination of genotypes and alleles at this locus.
Keywords: cattle, breed, milk, locus, kappa-casein, genotype, allele, polymorphism, DNA-technology, primers, CSN3, PCR, NCBI
Введение. Современные биологические исследования во многом основываются на методах биотехнологии и молекулярной биологии, поскольку другие методы являются зачастую недостаточными для оценки биологических явлений, происходящих в организме. Одним из таких важных способов для молекулярных исследований является использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР лежит в основе многих современных исследований, поскольку она применяется для определения генов ответственных за хозяйственно-биологические признаки у крупного рогатого скота.
В разработке ПЦР наборов важным является подбор праймеров к определенной последовательности ДНК. Для этого необходима практика работы с различными базами данных и биоинформационными программами по подбору праймеров и зондов. Следует отметить, что некоторые готовые последовательности можно найти в ряде изданных научных публикаций. Хотя никто не может дать гарантию достоверности опубликованных в научных работах праймеров и зондов. Знание элементов биоинформационных программ и баз данных значительно упрощает ситуацию [1; 2; 3; 4]. Каппа-казеин, ген ответственный за сложный молочный белок, который используется в хозяйственной деятельности, как фактор сыропригодности молока коров. В частности, CSN3B аллель ассоциирован с высоким содержанием белка в молоке и лучшими сыродельческими свойствами [5 - 8].
Целью исследований было охарактеризовать основной принцип подбора праймеров и аллельспецифичных зондов для определения аллелей в локусе каппа-казеина (CSN3).
Материалы и методы. Поиск генов, проводили в международной базе данных NCBI (National Center for Biotechnological Information, USA, национальный центр биотехнологической информации в США). Биоинформационная база данных NCBI дает возможность ознакомиться со структурой генома живых организмов, в частности о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях. Интернет-ресурс является доступным для любого исследователя и не имеет ограничений. Праймеры и аллельспецифичные зонды подбирали с помощью пакета биоинформационных программ «Oligo 6.0» (https://www.oligo.net/), «Primer3» (https://Primer3.org). Поиск структур нужных нам генов осуществляли через алгоритм BLAST, используя базу данных NCBI.
Олигонуклеотидные праймеры и зонды были синтезированы в ООО «НПФ Синтол» твердофазным амидофосфитным методом. Постановку ПЦР-РВ и секвенирование проводили с помощью программного обеспечения, поставляемого вместе с оборудованием.
Оптимизацию условий постановки ПЦР проводили на ДНК, полученной из цельной крови крупного рогатого скота. Всего было исследовано 282 коровы, принадлежащих к разным генеалогическим корням. Кровь отбирали в стандартные пробирки с антикоагулянтом, представлявший 0,05% раствор ЭДТА. ДНК из цельной крови выделяли с помощью наборов «S-Сорб»,
Кат№: EX-516, согласно инструкции производителя (ООО «НПФ Синтол», г. Москва, Россия), Определение аллелей и генотипов в локусе каппа-казеина проводили на амплификаторе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия) как это было описано ранее [3].
Результаты исследований. Для постановки полимеразной цепной реакции необходим грамотный подбор праймеров. Применяли два праймера - прямой (Forward, в работе обозначаемый CSN_F) и обратный (Reverse - в работе обозначаемый CSN_R), - комплементарные противоположным концам разных цепей участка ДНК. ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, синтезирует дочернюю нить ДНК, присоединяя нуклеотиды к 3'-концу комплементарно-матричной цепи [1,3,9]. В базе данных NCBI находили последовательности ДНК целевого гена (рис. 1).
СЖ?-
Qfflh National Library of Medic«*« ,mm
Bob Uuin hAppa [.liftMir) |C&N3) tfittMt. СSN JB лм*ы. CCMnpMt* til»
_ -______—m^L
------ 1
pi,: *vr rr^.T.ri'TirT"*- rii'rr.i ..• 1
—
'.ST.-.-
Рисунок 1 - Информация о гене каппа-казеина (CSN3) крупного рогатого скота (Bos taurus L.) в базе данных NCBI
Далее в последовательности ДНК на основании данных литературы находили участки, с соответствующими мутациями [10,11]. На рисунке 2 они выделены синей, фиолетовой и зеленой рамками. Следует отметить, что при поиске участка с мутацией в материалах NCBI, фрагмент должен быть длиной не более 10 п.о. Выбирали участок ДНК, захватывающий район мутации и примерно 300 нуклеотидов до и после него. Эту последовательность ДНК и использовали для подбора праймеров. Процесс температурного отжига устанавливали в пределах от 58 °С до 61 °С. Что касается праймеров, то они подбирались длиной от 18 до 27 нуклеотидов. Наличие повторяющихся подряд нуклеотидов (четырех G, C и трех А, Т) нежелательно, а на 3'-конце должен находиться аденин или тимин. Прямой праймер (CSN_F) должен находиться до первой мутации, а обратный (CSN_R) - после третей. В результате амплификации должен получиться ПЦР-продукт, содержащий все три мутации.
Поскольку данная работа проводилась для создания Набора по выявлению гена каппа-казеина (CSN3) методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени, в ПЦР-смеси присутствовали так же и олигонуклеотидные зонды, которые аналогичным образом подбирали с помощью программ «Oligo 6.0» и «Primer3».
i 12а 1 gatgtgatgt ggaatatata tatttatcat ataatgtgat attatgtgat a t at ate ас a
1134 1 ttata(e*ca atatatc ale a t*a«|tgat| tggaat atat at t at t at at agt111at at
114« 1 • •1at Dtatt aataat t gat t agttetat « aetttggcca CCtgatgtga agagctgact
114« 1 CBttt|a<iee gaccctjatg ctaiRaaaRB ttRBRRRcag RaRRBRaagR ggacgacaga
1192 1 RÍ»tgOR«tg BttBüategc atcatgRact ceBtRKacet Kggtctgggt RRactccagR
1150 1 «»"ggtgat egacBRggtg gcctogtgtg ctgcagttca tggggtcago aagagttgga
1 1С. а 1 catgactgBg cgactgaact gaactgaact gaat at ataa tatataaata ttataatatt
1170 1 etatataata tatattataa aattttataa attatataaa aaatatataa ac ce aagaat
1 1 76 1 rcatatcaca 1с ac atcatt acatataata tataatataa tgtat aat at aat ttat aat
1 1 ní 1 attagatRat tatataatat ac aitattaa tatattagta tataatataa 11gt atat ag
1 loo 1 ttaac t|(C ec с taattaatg tattttotga ctgcacctaa ttgatagaac tgtggcaaat
11 1 aaagatggaa entttccgta actgattttt aacggateae actaagc aga aaaaaaace с
1 200 1 cescntatse acccaggaat ccacatcaca ttatttttac t at11 tgc tt gaattagttt
1 гое 1 agataaaatg с occcttnac ctaatcccta gataaataaa ataaaaaaca a11 ас aa ас a
1212 1 tgtggtgaga ataaacatat atatatatat at ac ac acac acacatatac acac te at at
121S 1 ataiggaaag agatatacag tttttttctt t«tgtgtagt atgcttgtgt attgtatgtc
1 224 1 aaagctctct atgaaactgg tctagctgtg gt ge tt ataa ag t ge aae at 11 ac t gage a
1 JJfl 1 ctttttatat «•H < i aaget etgggc aaag tggt 11 ас a t tat gagetat ctcatctaat
1 236 1 tttttttgaa actaatgtta ttt ttaatat t tgctgaaae tcaagaagtg 8aa8Bae aat
1242 1 gtacaaatcc atattttata aaataatatg tcactattcc e aat gt tgt a
1 24В 1 ctttcttaac atcaaatact gtaacaattt gt ttcaaaaa attctgattt aagatat ctc
1254 1 ttcactct ge ttctgctgct ge t aagt cgc tteagtcetg ge t gac t с 11 ge gaccccat
1 260 1 agat вв' age с с ac t aggtt с С с с agt с сс t ggga ttete С aggc aagaa ataataefat
13«« 1 tet ge ataat tl.al tttlít • с age ge t gt gagaaagatg aaaga t t с t t с agtgacana
1272 1 atogecaaat atatcccaat tcBRtatgtg etgagtaggt atce t agt ta % Квас te aat
1270 1 tactaccaac aRaaaccaRt tgcactaett aataatcaat ttctgccata cccatattat
1204 1 gcaaagcс ag ctgcagttag gtcacctgcc caaattcttc BBtRRCBBRt tttgtcaaat
120О 1 actglgeetg ccaagtectg С с aageс с ag ceaactaecaj tggeaegte a Lceaeас ее a
1 206 1 catttatcat 1 iatggtс at t с с ас с aaag aaaaat с agg at aaa4< aga aatccetaee
1 392 1 attaatacca ttactagt» tgagcctaca altac^ccta t '.«tCR«»RC agtagagage
1 зов 1 actgtagcta с tetajaege ttc tcc^Raa gccca|ctga Ratcaac ас a
1314 1 gtccaagtta cttcaacírc Rgtcteaata CtCtBBRRaR acateaaaga agac aac ge a
1 32И 1 ggtaaataag Cflflaatgaflt BBcagcceeg attcatggac ttattaataa aatc gtaac a
1326 1 tctaaactag cgtagatgga tBBBttBBBt с tgttacage gaaggcgaaa tgggctaatt
1 3 32 1 ataocttaca tttgctggtt ctttatcatg tatatactag attctttcee aacaagaaag
1 ээа 1 ttttaaaata ttttacaaaa tgagtaaaaa ttgcagattt tattattaaa cctttttcaa
1 344 1 caattRKtet BCtCCttRBB tetattagtt ttattttact cctRttcaca cacaeaaaca
1 3 50 1 gtaaaataca gtgtcaectc atgettt tte t tatctcaae aatatgtttt ettagaaaaa
1 356 1 aatcatatag gatatgagtt taaatatatt ttaattgtat aecagtgttg ttgcactcta
1362 1 cttttggtaa gaatBgaatg BBBggaaaca atgtttcact catagcattt tatctcaggc
1 36В 1 ateaettetg •aaggatgta taaggttagg cacccaaatt tctcctattg taaggtaatc
1 374 1 ccacagaaaa attctaattt 11 aac ttgaa aage ас с tac ttattaagag gaaactttca
1 3 80 1 gaactttana tataatgtaa aat atgtcta tttattattt gaatcaatgg a t aa tgge ag
1 Звб 1 agtccaaaat aat tt aaaar aratgaagag gtt. aaaraga aagatcaat a agat agaaaa
1 S92 1 taact t1Rt|BBata •tttaggaag aaagtgacaa cattttgaga tgetaggcaa
1 39В 1 casatacttt с a te ас actg tctacatgat ttttggtcta aaatgaac te age a tgat at
1404 1 aatggtaata gcaatagatc agagaagcct ggttcttctg ttgtgtgact ttaagcaatt
14 10 1 eattactcte t с taaagagt cat caetete attttcteat aattttggtt gctatgagat
14 16 1 tcaagtgaga aage atattg tgaat gaggt gt aaaaagca at e aatc t gt gaaatat aat
1422 i gctctagaaa aRaagtat aa t t agt aaat a 11 aaaat tt a Ct ttc aaet a aaat ateaag
14 JO 1 tccttact aa atlatcaaaa ctacataaca atctcagttt aateetgtag e age с a t at g
14 34 1 üaatgijatte tatteccatc tteaatccac BBBtgBaaRc tatggatgca aattgctaca
1440 1 gctgaaagtt С BBBBCtRRB aaccaaatca aacttgcttg atttcagata gtaaggctta
1446 1 altagtncgt ctgctattte с fltatgggct atttgt taaa aaaaataaaa a t aaaaacag
1452 1 aaaacat act ctaattttcc aagateagea tatgtgtaaa ttttattact gagattgtgt
Примечание: https://wwwлcЫлlm.шh.gov/nudeotide/AY380229Л?report=genbank&log$=nudaПgn
&Ыast_rank=1&RГО=9BVZ7YWE016
Рисунок 2 - Последовательность ДНК гена каппа-казеина, которую использовали для подбора праймеров
На рисунке 3, в целях визуализации эксперимента, была показана схема расположения праймеров и зондов в последовательности геномной ДНК по гену каппа-казеина (CSN3). В ней представлены места гибридизации праймеров CSN_F, CSN_R и аллельспецифичных CSN3-MaeII-wt, CSN3-MaeII-m, CSN3-HinfI-wt2, CSN3-HinfI-m2, CSN3-HaeШ-wt, CSN3-HaeШ-m2, зондов.
0 флгорофор ИбС
Рисунок 3 - Расположение праймеров и зондов в последовательности геномной ДНК по гену каппа-казеина (CSN3)
В данной работе мы применили технологию дифференциации аллелей с помощью олигонуклеотидных зондов, соответственно в зависимости от того есть мутация или нет, будет лучше или хуже отжигаться тот или иной зонд.
После проведения всех исследований, были подобраны пары праймеров и трех пар аллельспецифичных зондов для гена каппа-казеина (CSN3). Зонды метили флуорофорами FAM -карбоксифлуоресцеин и R6G - карбоксиродамин-6G. В качестве гасителей флуоресценции использовали RTQ1 (гаситель флуоресценции семейства RTQ) и BHQ2 (гаситель флуоресценции семейства BHQ). Праймеры и зонды были синтезированы в ООО «НПФ Синтол» (Москва, Россия) [7, 12].
Анализ выбранных праймеров и определение температуры отжига проводили по программам «Oligo 6.0», «Primer3». Подбор оптимальных условий проведения ПЦР для определения аллелей и генотипов в локусе каппа-казеина (CSN3) у крупного рогатого скота, показал, что наилучшая эффективность амплификации и разгорания зондов наблюдалась при температуре отжига 61 °С. Кроме этого, в результате электрофореза было обнаружено, что побочных продуктов мало при 61°С, поэтому использовали ее. В тоже время понижение температуры до 58 °С, приводило к появлению неспецифических продуктов ПЦР.
В результате, нами был проведен анализ подбора праймеров и зондов, условий их работы для постановки ПЦР-РВ. Далее подобранные праймеры и зонды проверялись исследованиями соответствующей выборки животных. Исследования проводили на амплификаторе Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия). Количество циклов составляло от 35 до 45. Увеличение числа циклов влияло на время проведения теста и не повышало чувствительность реакции. В результате полученных данных, решено было остановиться на 40 циклах амплификации. Исходили из возможности приборов, для лучшей репрезентативности данных, до 10 циклов может быть не детектируемыми. Соответственно первые 10 циклов без детекции и 30 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала. Параметры эксперимента для определения 4-х аллелей локуса каппа-казеина выглядели следующим образом: удерживание температуры: 15 мин. - при 94 °C (один цикл); циклирование 1: 20 сек. - при 94 °C; 20 сек. - при 61 °С, 30 сек. - при 64 °С (10 циклов); циклирование 2: 20 сек. - при 94°C, 20 сек. - при 61°С, 30 сек. - при 64 °С (30 циклов), детекция по каналам Green, Yellow.
ПЦР с электрофоретическим методом детекции исследуемой ДНК осуществляли с использованием амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-технология», Москва, Россия) по следующей программе: 3 мин. -при 94 °C (один цикл); 20 сек. - при 94 °C, 20 сек. - при 61 °С, 30 сек. - при 64 °С (40 циклов).
Детекцию продуктов ПЦР осуществляли с использованием оборудования: источник постоянного тока с напряжением 150-460 В («Эльф-4», «ДНК-технология», Москва, Россия), ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей («Биоком», Москва, Россия), видеосистема с цифровой видеокамерой для регистрации результатов («Биотест-1», «ЦНИИ Эпидемиология», Москва, Россия), камера для горизонтального электрофореза объемом не более 400 мл («SE-2», «Хеликон», Москва, Россия) методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий. В результате, мы получили специфичный продукт размером 453 п.н. (цифры 1, 2, 3, 4, 5) (Рис. 4).
На рисунке 4 видно, что в реакции побочных продуктов практически нет. Наличие небольшого количества побочных продуктов при ПЦР с электрофоретическим методом детекции не является критичным, так как специфичность ПЦР-РВ намного выше за счёт использования не только специфичных праймеров, но и зондов типа TaqMan.
Рисунок 4 - Электрофореграмма результатов ПЦР качества праймеров при определении генотипов каппа-казеина (CSN3) с ДНК пяти животных. «М» - маркер длин фрагментов с шагом 100 п.н.
Полимеразная цепная реакция с электрофоретическим методом детекции позволяет только предположить об амплификации участка ДНК определяемого гена. Подтверждение же, возможно было получить после секвенирования продукта, извлеченного из геля. Окончательный вывод о правильности наших действий проводили после сравнения сиквенса с последовательностью гена в базе данных NCBI.
При поиске гомологии с помощью интернет-сервиса Nucleotide BLAST online была показана гомология на уровне 99,28% результатов секвенирования с последовательностью гена CSN3, что видно из таблицы 1.
Таблица 1 - Результат поиска в базе данных NCBI последовательностей, гомологичных ПЦР-продукту, полученному при использовании тест-системы на локус каппа-казеина (CSN3)
Sequences producing significant alignments
□ select all 30 sequences selected
Description
Download
Select columns
Show 100'
J
GenBank Graphics Distance tree of results MSA Viewer
a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a
Bos laurus partial csn3 gene for kappa casein exon 4
Bos taurus partial k-casein gene for kappa-casein enon 4 allele BB
Bos laurus kappa-casein (CSN3) gene CSN3-AB allele partial cds
Bos laurus partial k-casein gene for kappa-casein. exon 4. allele AB
Bos laurus kappa casein gene, exon 4 and partial cds
Bos laurus kappa-casein ICSN31 gene, exon 4 and partial cds
PREDICTED Bos laurus casern kappa ICSN31. Iranscnpt variant X1. mRNA
Bos laurus kappa-casein (CSN3) gene. CSN3-AA allele partial cds
Bos laurus breed Sheko kappa casein ÎCSN31 gene CSN3-B allele exon 4 and partial cds Bo? taurgs Happa-casem tçsN3kj gene. exon iv and partial tds
Bos laurus casein kappa. mRNA fcDNA clone MGC 126997 IMAGE 7941 ISO), complete cds Bos laurus partial k-casein gene for kappa-casein exon 4 allele AB Bos laurus kappa casein (CSN3I gene CSN3-B allele, complete cds
Bos laurus happa casern (CSN3I gene. Ç5N3-A allele, complete cds
Bos laurus kappa-casein precursor (CSN3I gene. CSN3-F allele, exon 4 and partial cds
Bos laurus kappa-casein (CSN3Ï gene yanant A partial cds Bwne gene tor Kappa-casein exens 3-5 Bos laurus mRNA foi pte-kacpa-casein A
Scientific Name Max Score Total Score Query Cover E value Pet Ident Асс Len Accession
Bos taurus 250 250 93% 1e-64< ^9 28%^ 1 874 AJ849456 1
Bos taurus 250 250 93% 1e-64 99 26% 874 А.1841941 1
Bos taurus 244 244 93% 7e-63 98 56% 510 КР897162.1
Bos taurus 244 244 93% 7e-63 98 56% 874 AJ84I944 1
Bos taurus 243 243 94% 2e-62 97 87% 741 EF378700 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 565 МК455075 1
239 239 93% Зе-61 97 84% 888
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 518 КР89716Э 1
239 239 93% Зе-61 97 84% 846 NM 174244 1
Bos laurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 557 H0589920 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 373 EF133462 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 852 ВС 102120 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97,84% 874 AJ841942 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 15365 AY380229.1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 15346 АУйогге i
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 551 AF123250 1
Bos lagrus 239 239 93% Зе-61 97 84% 299 U84251 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 299 U84250 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 7595 Х14908 1
Bos taurus 239 239 93% Зе-61 97 84% 850 X0Q565.1
■ Bos taurus 233 233 93% 1е-59 97 12% 561 HQ589917.I
В таблице 1 показан сигаете с праймера CSN3_f, он имеет следующую последовательность: ACACCTACCACCGAAGCAGTAGAGAGCACTGTAGCTACTCTAGAAGCTTCTCCAGAAGT TATTGAGAGCCCACCTGAGATCAACACAGTCCAAGTTACTTCAACTGCGGTCTAAAAACTCTAA GGAGACATCAAGAGAAAAACACGCGC. Полученная последовательность соответствует данным сервиса Nucleotide BLAST online. Из полученных данных таблицы 1 видно, что размер ПЦР продукта совпадает с последовательностью каппа-казеина.
Заключение. Предложен алгоритм действий поиска нуклеотидной последовательности гена каппа-казеина (CSN3) и принцип подбора праймеров и зондов. Аллель CSN3B является генетическим маркером, ассоциированный с сыропригодностью коровьего молока, что имеет важное значение для правильного определения генотипов и аллелей в данном локусе. Последовательность действий по подбору праймеров основывалась на полученных экспериментальных данных. В связи с чем, данное направление по изучению хозяйственно-биологических признаков динамично развивается, что расширяет имеющиеся знания и улучшает качество проводимой научно-исследовательской работы. Тем не менее требуется тщательный анализ последних публикаций литературы, изучения вновь появляющихся Интернет-ресурсов и компьютерных программ по данному вопросу.
Литература
1. Лысенко, Е.А. Современные методы молекулярной биологии: Полимеразная цепная реакция. Стратегия подбора праймеров для анализа экспрессии генов / Е.А. Лысенко. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - C. 75-96.
2. Лапенков, М.И. Разработка тест-системы для количественной и качественной оценки содержания ДНК в криминалистических образцах методом полимеразной цепной реакции в реальном времени /
М.И. Лапенков, Н.В. Плахина, Я.И. Алексеев, Д.А. Варламов // Судебно-медицинская экспертиза. -2011. - Т. 54. - № 2. - С. 34-38.
3. Ковтун, И.С. Особенности подбора праймеров конститутивного гена для проведения полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции / И.С. Ковтун, М.В. Ефимова // Вестник Томского государственного университета // Биология. - 2013. - № 2(22). - С. 160-171.
4. Гарафутдинов, Р.Р. Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора / Р.Р. Гарафутдинов, А.Х. Баймиев, Г.В. Малеев [и др.] // Биомика. - 2019. - Т. 11. - № 1. - С. 23-70.
5. Валитов, Ф.Р. Эффективность использования современных методов маркерной селекции в молочном скотоводстве/ Ф.Р. Валитов. Дисс. докт. с.-х. наук. - Уфа, 2018. - 396с.
6. Кручинин, А.Г. Оценка влияния полиморфизма гена к-казеина в сухом молоке на технологические свойства кислотно-индуцированных молочных гелей / А.Г. Кручинин, С.Н. Туровская, Е.Е. Илларионова, А.В. Бигаева // Техника и технология пищевых производств. - 2021. - Т.51. - №1. - С.53-66.
7. Марзанова, С.Н. Разработка метода ДНК-диагностики генотипов и аллелей в локусе каппа-казеина [CSN3] и их геногеографический анализ у коров молочных пород / С.Н. Марзанова, Д.А. Девришов,
H.С. Марзанов // Ветеринарный врач. - 2021. - № 4. - С. 36-43. DOI 10.33632/1998-698X.2021-4-36-43.
8. Кузнецов, С.Б. Новые сочетания аллелей в вариантах генов казеинового кластера крупного рогатого скота и ревизия их номенклатуры. / С.Б. Кузнецов, Е.В. Солоднева, М.Т. Семина [и др.] // Генетика. -2022. - Т. 58. - № 8. - С. 889-901. DOI 10.31857/S0016675822080057.
9. Kleppe, K. Studies on polynucleotides. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases/ K. Kleppe // Molecular Biology. - 1971. - Vol. 56. - P. 341-361.
10. Barroso, A. Technical note: Detection of bovine kappa-casein variants A, B, C, and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP)./ A. Barroso, S. Dunner, J. Cañón // J. Anim. Sci. - 1998. - Vol.76. - P.1535-1538.
11. McClure, M. Understanding Genetics and Complete Genetic Disease and Trait Definition./ M. McClure, J. McClure. ICBF, Highfield House, Shinagh, Bandon, Co. Cork. Ireland, 2016. - 88p.
12. Матвиенко, И.В. Синтез производных флуоресцентного родаминового красителя на основе дигидрохинолина для анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в реальном времени / И.В. Матвиенко, В.М. Байрамов, Н.А. Парыгина [и др.] // Биоорганическая химия. - 2020. -Т. 46. - № 3. - С. 310-321. DOI 10.31857/S0132342320030203.
References
I. Barroso, A. Technical note: Detection of bovine kappa-casein variants A, B, C, and E by means of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP)./ A. Barroso, S. Dunner, J. Cañón // J. Anim. Sci. - 1998. - Vol.76. - P.1535-1538.
2. Garafutdinov, R.R. Variety of primers for PCR and rationale for their selection / R.R. Garafutdinov, A.Kh. Baimiev, G.V. Maleev [et al.] // Biomika. - 2019. - T. 11. - No. 1. - S. 23-70.
3. Kleppe, K. Studies on polynucleotides. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases/ K. Kleppe // Molecular Biology. - 1971. - Vol. 56. - P. 341-361.
4. Kovtun, I.S. Features of the selection of primers of the constitutive gene for polymerase chain reaction after reverse transcription / I.S. Kovtun, M.V. Efimova // Bulletin of the Tomsk State University // Biology. - 2013. - No. 2 (22). - S. 160-171.
4. Kruchinin, A.G. Assessment of the influence of к-casein gene polymorphism in milk powder on the technological properties of acid-induced milk gels / A.G. Kruchinin S.N. Turovskaya, E.E. Illarionova, A.V. Bigaeva // Technics and technology of food production. - 2021. - T.51. - No.1. - P.53-66.
5. Kuznetsov, S.B. New combinations of alleles in variants of the cattle casein cluster genes and revision of their nomenclature. / S.B. Kuznetsov, E.V. Solodneva, M.T. Semina [et al.] // Genetics. - 2022. - T. 58. - No. 8. - P. 889-901. DOI 10.31857/S0016675822080057.
6. Lapenkov, M.I. Development of a test system for quantitative and qualitative assessment of DNA content in forensic samples by real-time polymerase chain reaction / M.I. Lapenkov, N.V. Plakhina, Ya.I. Alekseev, D A. Varlamov // Forensic Medical Examination. - 2011. - T. 54. - No. 2. - S. 34-38.
7. Lysenko, E.A. Modern methods of molecular biology: Polymerase chain reaction. Primer selection strategy for gene expression analysis / E.A. Lysenko. - M.: BINOM. Knowledge Laboratory, 2011. -
P. 75-96.
8. Marzanova, S.N. Development of a method of dna diagnostics of genotypes and alleles at the kappa-casein locus [csn3] and their genogeographic analysis in dairy cows/ S.N. Marzanova, D.A. Devrishov, N.S. Marzanov // The Veterinarian. - 2021. - No. 4. - P. 36-43.
DOI 10.33632/1998-698X.2021-4-36-43.
9. Matvienko, I.V. Synthesis of derivatives of fluorescent rhodamine dye based on dihydroquinoline for analysis of nucleic acids by real-time polymerase chain reaction / I.V. Matvienko, V.M. Bayramov, N.A. Parygina [et al.] // Bioorganic chemistry. - 2020. - T. 46. - No. 3. - S. 310-321.
DOI 10.31857/S0132342320030203.
10. McClure, M. Understanding Genetics and Complete Genetic Disease and Trait Definition./ M. McClure, J. McClure. ICBF, Highfield House, Shinagh, Bandon, Co. Cork. Ireland, 2016. - 88p.
11. Valitov, F.R. The effectiveness of using modern methods of marker selection in dairy cattle breeding. / F.R. Valitov. Diss. doct. s.-kh. sciences. - Ufa, 2018. - 396p.
© Марзанова С.Н., Коновалова Н.В., Алексеев Я.И., Ходарович Ю.М., Девришов Д. А., Марзанов Н.С.,2023
