CC BY
22
Экспериментальные и клинические исследования
Особенности патогенезаНе^соЬаЛеф/Уогуинфекцииу представителей хакасской популяции
Агеева Е.С.1, Штыгашева О.В1 2, РязанцеваН.В.3
The features of pathophisiology Helicobacterpiloryassociated ulceractive disease from the Khakasses
Ageyeva Ye.S, Shtygasheva O. V,RyazntsevaN. V.
1 Хакасскийгосударственны1йуниверситетим. Н.Ф. Катанова,г. Абакан
2 ГУЗ «Хакасская республиканскаябольницаим. Г.Я. Ремишевской»,г. Абакан
3 Сибирскийгосударственны1ймедицинскийуниверситет,г. Томск
© Агеева Е.С., ШтыгашеваОВ., Рязанцева Н.В.
Исследование посвяшено изучениюособенности патогенеза Helicobacterpylon (^-ассоциированной язвенной болезни (ЯБ) у хакасов. Установлено, что по сравнениюс европеоидами выраженнаяу монголоидовс ЯБ активацияТ-клеточного и гуморальногозвеньев иммунного ответа сопровождается высоким содержанием^4 - и CD20 -лимфоцитов в слизистой оболочкежелудка. Изменения, выявленные в периферической крови у больныхЯБ, характеризовалисьснижением численности cd4 - и cds -субпопуляцийлимфоцитов по сравнениюс их количеством у пациентовс хроническим гастритом. В пользу существования иммуногенетическихзакономерностей развития ЯБ свидетельствовала обнаруженная положительная взаимосвязь между генотипомАА -251 интерлейкина- и риском развития ЯБ у хакасов. Обсуждается целесообразностьопределения популяционньхрисковыхи протективныхгенотиповразвития НР-ассоцииро-ванной Я Б у хакасов.
Ключевые слова: Helicobacterpylori язвенная болезнь, хакасы, ти1/ти2-иммунныйответ, аллельный полиморфизм генов, ин-терлейкин-8.
Peculiarities of pathogenesis of Helicobacterpylori (HP)-a ssociated gastric ulcer (GU) i n Khakasses are i nvestigated. I t i s iound that, i n contrast to Caucasians, the activation of the Т-cell and humoral parts of the i mmune response i n Mongoloids with GU is accompanied by the high content of CD4and CD20'-lymphocytes i n the muscous coat of stomach. Changes revealed i n the peripheral blood i n GU patients were characterized by a decrease i n the magnitude of CD4+- and CD8 '-lymphocyte subpopulations compared to patients with chronic gastritis. The detected pos -itive correlation between the АА-251 genotype of i nterleukin-8 and the risk of GU development i n Khakssses i ndicated i n favor of the existence of immuno-genetic regularities of GU development. The reasonability of determining population risk and protective genotypes of development of НР-associated GU in Khakasses is discussed.
Key words: Helicobacter pylori, gastric ulcer, Khakasses, Th1/Th2-immune response, allelic polymorphism genes, interleu-
kin-8.
УДК616.33002.44092:579.84(571.513)
Введение
Основной особенностью персистенции Helicobacter pylori (HP) является их длительное бессимптомное существование в организме человека [1—3, 15]. Для формирования адекватного протективного иммунитета против HP необходим смешанный т11/^2-ответ [4, 5]. Нарушение баланса между клеточной и гуморальной составляющими иммуноре-активности приводитк изменениюсубпопупяционногососта-ва Т-лимфоцитов периферической крови и модификации на-
бора цитокинов, продуцируемых Т-хелперами типа 1 и 2 (Тм и Т12 соответственно) [6, 8, 1 з, 17—19].
Изменения подобного рода выступают признаком качественного и (или) количественного дисбаланса компонентов адаптивного иммунитета и способствуютформированиюпа-тологического ответа иммунной системы [7, 11]. Результатом этого является повышение чувствительностилибо резистентности организма к инфицированию определенными субтипами vacA + и (или) садА* НР, имеющими этнические закономерности [8, 10, 12].
Агеева Е. С., Штыгашева О. В., Рязанцева Н.В.
Цель исследования— изучениеособенностей патогенеза НР-ассоциированнюй язвенной болезни у жителей Республики Хакасия (представителей монголоидной и европеоидной популяций) .
Материал и методы
Обследованы пациенты с язвенной болезнью (ЯБ)— жители пос. Матур, Анчуль, Верхний КурлугаШ) Нижние Сиры, Большой Бор, Большая Сея, Верхняя Сея, Инчул, Верхний Таштып Таштыпского района и работники предприятия «Абаканвагонмаш» Республики Хакасия. Паттерн однонаправленных изменений у больных Я Б желудка и двенадцатиперстной кишки позволил объединить их в одну группу [14]. Группу сравнения составили пациенты с хроническим гастритом. Обследованный контингент представлен двумя популяциями ) хакасами (монголоиды) или коренныежители) и остальнымижителями РеспубликиХакасия. С учетом того, что вторую популяцию более чем на 9 5 % составляли русские, украинцы и белорусы, их обозначили европеоидами (или пришлыми жителями). Средний возраст европеоидов составил 43,6, монголоидов — 42,9 года. Число мужчин и женщин в исследованиибыло сопоставимым.
Эпидемиологический скрининг распространенности и кли-нико-морфологическиххарактеристик ЯБ и диспепсии выполнен у 613 европеоидов и бзо монголоидов с использованием метода эзофаггофиброгастродуоденоскопии. Исследование проведено на основании 25%- й случайной выборки. HP диагностировали при помощи морфологического и уреазного методов в слизистой оболочкежелудка. а также с использованием уровня специфических иммуноглобулинов к НР методом твердофазного иммуноферментноо анализа у ззо европеоидов и 293 монголоидов (по 15%-й случайнойвыборке).
Состояние иммунной системы у больныхизучали по общему числу лимфоцитов в периферической крови, а также по количеству их в субпопуляциях в периферической крови и биопсийном материале. Тестирование субпопуляций лимфоцитов (cd 4+, cd 8* и cd 20*) слизистой оболочки антраль ного отдела желудка проводили на парафиновыхсрезах им-муногистохимическим методом с использованием монокле-нальных антител наборов фирмы Dako (Novocastra, Дания) при 400-кратном увеличении микроскопа в пяти случайно выбранныхполяхзрения (не менее 5 о о клеток) . В крови им-мунофенотип лимфоцитов (cd з*, cd 4* и cd 8*) определяли методом лазерной проточной цитофлюориметрии (Be ckman Coulter epics xl, Швейцария. применениеммоноклональг ных антител. Апоптотическую гибель лимфоцитов крови оценивали через 24 ч культивирования с использованием
Особенности патогенеза НеИсоЬаОегрйогуинфекции...
МИКрОСКОПа Micros (Австрия) при увеличении об. 100 х ок. 10 (окрашиваниегематоксилиноми эозином) . Подсчитывали не менее 200 клеток. Критериями) характеризующими апоптоЗ) являлись кариопатологические и цитопатологические изменения в клетках (конденсация и маргинация хроматина) уменьшение объема клетки, пузырчатость и фрагментация клеточногоядра) [9]. In vivoпроцессзаканчиваетсяфрагмен-тацией клетки с образованием апоптотических телец. При некротической гибели преобладаютпроцессы набухания) ка-риорексиса и кариолизиса с последующей ферментативной деградацией всей клетки [21].
Для исследования аллельного полиморфизма ИЛ-8 -2 51 Т > А ДНК выделяли из венозной крови методом фе-нолхлороформной экстракции. Работы по генотипирова-нию выполнены в НИИ медицинской генетики СО РАМН (г. Томск). Амплификацию проводили с использованием следующихпраймеров:
F5'TGTTCTAACACCTGCCACTCTAGTA 3' и R5'TTATGCACCCTCATCTTTTCATTAT 3'
(«Сибэнзим», г. Новосибирск). Наличие аллеля А формирует сайт рестрикциидля Mfe i (рисунок). ПЦРпродукты анализировали с помощьюэлектрофорезав 4%-м агарозномгеле. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду puci9, расщепленную рестриктазои Mspi (« Сибэнзим », г. Новосибирск) .
Примеры идентификации генотипов по гену ИЛ8 -251 Т > А: 1 - контрзъамплификации (291 п.н.); 2, 5 - генотип ИЛ8-251 а А (79 и 212 п.н.); 3 - генотип ИЛ8 -251 ТТ (291 п.н.); 4 - генотип
ИЛ8-2 51 ТА (79, 212 и 291 п.н.)
Результаты представлены в виде М ± т где М — среднее арифметическое значение, т — среднеквадратичное отклонение среднего. Для проверки статистической значимости различий показателей в сравниваемых группах использовали ¿-критерий Стьюдента. Различия между группами считали значимыми для р < 0,05. В случае отсутствия нормальности распределения использовали критерии Вил-коксона и Манна—Уитни. Сравнение частот аллелей проводили с помощью критерия %2 с поправкой Йейтса на непрерывность, анализ ассоциации полиморфизмов с хрониче
Экспериментальными клиническиеисследования
ским гастритом и язвенной болезнью- с помощьюкритерия отношенияшансов (odds ratio — OR).
Результаты и обсуждение
Проведенное эпидемиологическое исследование распространенности язвенной болезни у коренных и пришлых жителей Республики Хакасия показало, что при высокой ин-фицированностиНР (95,4% среди европеоидови 95,2% среди монголоидов) имеются выраженные различия показателей заболеваемости среди представителей разных этни-ческихпопуляций (8,1 и 4,5% соответственно).
Интерес исследователей в изучении механизмов, приводящих к манифестации заболевания при персистенции НР, сконцентрирован на лимфоцитах. Именно эти клетки представляют собой как регуляторное, так и эффекторное звенья и определяют характер направленности локального иммунитета по тм/™2-пу™ развивающегося в слизистой оболочке желудка воспалительного процесса. Кооперация клеток-эффекторов воспаления определяет местную реакцию на инфект, Однако следует отметить, что спектр бактериальных адгезинов обширен и определяет поливалентность этого феноменадаже в масштабе одного вида патогена. Так, cagA - и vacA -позитивные штаммы HP оказывают разное влияние на активацию и соотношение субпопуляций лимфоцитов. Различия затрагивают также способность им-мунокомпетентных клеток к миграции в слизистой оболочке желудка [20].
В проведенном исследовании локального иммунитета слизистой оболочки антрального отдела желудка в условиях
персистенции НР установлено явление иммунологической гетерогенности среди больных— представителей коренного и пришлого населения. При сравнительном изучении показателей субпопуляционного состава лимфоцитов слизистой оболочкеантральногоотделажелудка обнаружено, что у пациентов монголоидной группы выражена активация Т-кле-точного и гуморального звеньев иммунного ответа по сравнению с группой европеоидов. При этом наиболее существенные изменения отмечены у пациентов с ЯБ по сравнению с больными хроническим гастритом, Исследование фенотипа клеточного инфильтрата слизистой оболочки желудка обнаружило достоверное увеличение доли CD4*- и CD 20-лимфоцитов у больныхЯБ — представителей монголоидной популяции по сравнениюс их количеством в группе европеоидов (табл, 1),
Результатом активации эпителиальных клеток продуктами микробного происхождения выступает продукция веществ провоспалительного действия, к числу которых прежде всего относятся цитокины, В свою очередь, цитокины (1ИП+, ИЛ-8, ИП-10, фактор некрозаопухоли а, интерферону) активируют антигенпрезентирующие клетки, которые являются компетентными в запуске антигенспецифического Т12-им-мунногоответа.
Оценкаособенностейиммунногоответау представителей коренного населения Хакасии позволила установить существенные изменения иммунологических показателей как у больныхЯБ, так и у пациентов с хроническимгастритом, инфицированных НР, по сравнению со здоровыми донорами , Повышенное содер-
жание лимфоцитов крови у обследованных больных
Таблица 1
Доля лимфоцитов слизистой оболочкиантрального отделажелудка,экспрессирующихкластерСО (%), у больных ЯБ и хроническимгастритом — представителейкоренного и пришлого населения РеспубликиХакасия (Х± m)
Коренноенаселение П ришлое население
Кластерcd БольныеЯБ (22 человека) Больныехроническимгастритом (23 человека) БольныеЯБ (25 человек) Больныехроническимгастритом (21 человек)
CD 4 33,6 ± 0,9 24,1 ± 0,4** 26,0 ± 0,8* 17,8 ± 0,9*' **
CD 8 16,3 ± 0,5 12,1 ±0,2 1 9,3 ± 0,7 1 6,5 ± 0,4
CD 20 38,8 ± 0,9 34,4 ± 0,7 32,4 ± 0,7* 36,4 ± 0,8**
* р < 0,05 при сравнении монголоидови европеоидов. **р < 0,01 при сравнениибольныхязвеннойболезньюи хроническим гастритом.
((54,0 ± 0,4)% у пациентов с ЯБ, (45,9 ± 0,7)% — у больных хроническим гастритом, р < 0,05) свидетельствовало об активации иммунной системы при персистенции НР. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов крови позволило установить различия в состоянии иммунной системы у
больных ЯБ и хроническим гастритом монголоидной популяции (табл, 2). Нарядус этим при манифестации клинических проявлений язвенной болезни обнаружена тенденция к усилению апоптоза Т-лимфоцитов крови ((19,5 ± 0,6)% при (16,8 ± 0,9)% у здоровыхдоноров).
Агеева Е. С., Штыгашева О. В., Рязанцева Н.В.
Особенности патогенеза НеНсоЬаОегриогуинфекции...
Таблица 2
Доля клетокпериферическойкрови, экспрессирующихкластерСР (%), у больных ЯБ и хроническимгастритом— представителей коренного населения РеспубликиХакасия (X ± m)
Кластер CD Здоровыедоноры (35 человек) Больныехроническимга-стритом (34 человека) БольныеЯБ (21 человек)
CD 3 10,5 ± 0,8 72,7 ± 1 ,9* 83,0 ± 2,8*' **
CD 4 26,4 ± 0,9 40,9 ± 0,4* 30,0 ± 2,3* **
CD 8 37,8 ± 1,4 50,8 ± 0,7* 33,2 ± 1,2* **
* р < 0,05 при сравнениис контролем.
**р < 0,05 при сравнении больныхязвенной болезнью и хроническим гастритом.
Вероятно, механизмы ускользания инфектаот адекватной иммунологической защиты макроорганизма и наличие хронической гиперантигенемии формируютиммунный ответ, харак теризующийся относительно слабой напряженностью. Бактериальная мимикрия, антигенныйдрейф, способностьмикроор-ганизмов управлять программированной гибелью клеток орга-низмахозяина приводятк тому, что инфект контролируетчис-ленность клеточных популяций, потенциально эффективных для радикального воспалитегьногоответа .
В настоящее время большой интерес вызывает концепция, согласно которой исход НР-инфицирования определяется генетически детерминированными особенностями иммунного ответа. Последний при персистенции НР имеетспе-цифические (в том числе и этнически детерминированные . особенности, связанные с эволюционносформировавшими ся механизмами длительного существования организма человека и инфекта в условиях взаимоедаптации. Преобладание Т^-иммунного ответа у хакасов можно рассматривать как формупротективного иммунноггоответа при развитии ЯБ у представителей монголоидной популяции, имеющуюэтни-чески детерминированныйхарактер ,
Возможнымобъяснениемэтомуявляется наличие попу-ляционнозависимыхассоциаций между аллелями генов цитокинов и особенностями клинических признаков. Анализ встречаемости аллелей и генотипов ИЛ-8 -251 Т > А показал различия в распределении частот генотипов ТА и АА -2 51 ИЛ-8 у пациентов с язвенной болезнью и здоровых доноров (табл. з), Частота встречаемости генотипа АА у больных ЯБ была выше по сравнению с таковой у пациентов с хроническим гастритом и здоровыхдоноров (р < 0,05). Между генотипом АА и риском развития Я Б у хакасов установлена сильная положительная взаимосвязь or = 3,1 (95%-й ci 1,1—8,8).
Таблица з
Распределениечастот генотипов и аллелей гена -251 Т > А ИЛ-8 у коренного населения РеспубликиХакасия
тель доноры Хронический гастрит Язвеннаяболезнь
% Абс. % Абс. % Абс.
Генотипы
ТТ 42,8 54 45,4 29 44,8 13
ТА 44,4 56 43,7 28 24,1 7
АА 1 2,8 16 10,9 7 31,0* 9
Аллели
Т 65,1 1 64 67,2 86 56,9 33
А 34,9 88 32,8 42 43 ,1 25
Показа- Здоровые
Больные
* Достоверность различий по сравнению с контролем с2 = 4,48;
р < 0,05; OR = 3,1 (95%-й С| 1,1 — 8,8).
Продукция ИЛ-8 идентифицируется как маркер адаптивного иммунитета на персистенциюНР в организме. От уровня продукции ИЛ-8 зависит выраженность и характер развития воспаления в слизистой оболочкежелудка. Генотипы АА и ТА -251 ИЛ-8 ассоциированы с повышенной продукцией цитокина и риском развития атрофии антрального отдела желудка [16]. Наиболее высокий уровень цитокина в крови определяется при инфицировании садА( + )-штамм1ами НР, имеющими высокую распространенность среди хакасов [8]. Вероятно, обнаруженные иммуногенетические особенности являются одним из объяснений дифференциации иммунного реагирования и клиническихособенностей развития ЯБ у представителей монголоидной и европеоидной популяций.
Заключение
Таким образом, более выраженная у монголоидовс ЯБ по сравнению с европеоидами активация Т-клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа сопровождается высоким содержанием CD4 *- и сD2o*-пимlфоцитов в слизистой оболочке желудка. Изменения, выявленные в периферической крови у больных Я Б, характеризовались снижением численности CD4*- и CD8 -субпопуляций лимфоцитов по сравнению с их количеством у больныххроническим гастритом. В пользу существования иммуногенетических закона мерностей развития язвенной болезни свидетельствовала выявленная положительная взаимосвязь между генотипом АА -251 ИЛ-8 и риском развития ЯБ у хакасов. В целом обнаруженные нарушения соотношения клеточного и гумо рального звеньев иммунитета свидетельствуют о существенной роли популяционных особенностей иммунного реагирования в патогенезе НР-ассоциированной язвенной болезни.
Литература
1. АлександроваВ.А, КозловаИ.П. Спорные и нерешенные вопросы хеликобактерной инфекции у детей // Лечащий врач. 2002. № 11. С. 13 — 16.
2. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Яковенко Э.П. Хронический га-
стрит, Амстердам, 1993. 362 с.
3. БаранскаяЕ.К. Язвенная болезнь и инфекция НР // Рус. мед. журн, 2000. Т. 2, № 1. С. 48—53.
4. КозловаН.Н.,ПрокопенкоВ.Д. Иммунный ответ при инфекции Helicobadterpylon // Иммунопатология, аллергология, инфекто-логия, 2007. № 4. С. 58—62.
5. НовиковаА.В,ГазизоваР.Р, Шершевская А.Я. и др, Возрастные характеристики иммунных реакций при хроническом гастрите //Арх, патологии, 1995. Т. 57, № 12. С. 61—64.
6. Останин А.А,ПальцевА.И,ЛебедевА.Г. и др. Характеристика апоптотической и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью // Бюл. СО РАМН. 2004. № 1
(111). С. 129 — 134.
7. СельчукВ.Ю.,НикулинМ.П. Ракжелудка // Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН. 2005.
www.neuch.ru.
8. ЦукановВ.В,БаркаловС.В, ТонкихЮ.А. и др. Распространенность cagA- штаммов Helicobacter pylori и язвенная болезнь у населения Восточной Сибири //Терапевт, арх. 2007. № 2. С. 15
—1 8.
9. Allen R.T., Hunter W.J., Agrawal D.K. Morphological and
Biochemical Characterization and Analysis of Apoptosis // Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 1997. V. 37, № 4. P. 215—228.
10.
Эксnерименmaпbнblеи RnuHu^ecKueuccnedoBOHua
11. CamorlngaPonce M, Tomes J., Perez-Perez J. et al. Validation of
a serological test for the diagnosis of Helicobacterpylori infection and the i mmune response to urease and CagA i n children //Amer. J. Gastroent. 1998. № 93. P. 1264—1270.
12. CorreaP. HP as a pathogen and carcinogen // J. Physiol. Pharmacol. 1997. V. 48. Suppl. 4. P. 19—24.
13. Cover T.L., Berg D.E., BlaSerM.J. VacA and the CagA pathogenicity of H. pylori//The i mmunobiology of H. pylori from pathogenes -is to prevention. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, New York, 1997. P. 75—90.
14. D'Elbs MM., ManghettiM., De Carl M. et al. t helper 1 effectors
cells specific for Helicobacterpylori in the gastric antrum of patients with peptic ulcer disease //J. I mmunol. 1997. V. 158. P. 962 — 967.
15. Gol R., Husebekky A., Isaksenz V. et al. Increased frequency of antral CD4 + T and CD19* B Cells in patients with Helicobacter pylori-related peptic ulcer disease // Blackwell Publishing Ltd. Scandinavian Journal of Immunology. 2005. V. 61. P. 92—97.
16. Itoh T., Wakatsuki Y., YoshidaM. et al. The vast majority of gastric T cells are polarized to produce T helper 1 type cytokines upon antigenic stimulation despite the absence of Helicobacter pylori infection //J. Gastroenterol. 1999. V. 34. P. 560—570.
17. Landi S., Moreno V., GioiaPatricolaL. et al. Association of com -
mon polymorphisms i n i nflammatory genes i nterleukin (IL)6, I L8, t u-mor necrosis factor-a, NF-KB1, and peroxisome proliferator-activ-ated receptor g with colorectal cancer // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 3560—3566.
18. LohoffM.,RollinghoffM.,SommerF. HeliojbacterpylDrigastritis: a
Th 1 mediated disease? //J. Biotechnol. 2000. V. 83. P. 33—36.
19. Luzza F., Parrello T., Sebkova L. et al. Expression of
proinflammatory and Th1 but not Th2 cytokines is enhanced in gastric mucosa of Helicobacterpyloriinfected children // Dig Liver Dis. 2001. V. 33. P. 14—20.
20. McCarron S. L., Edwards S., Evans P. R. et al. Influence of cytokine
gene polymorphisms on the development of prostate cancer //Cancer Res. 2002. V. 62. P. 3369—3372.
21. Meyer F., Wilson K. T., James S. P. Modulation of i nnate cytokine responses by products of Helicobacter pylori // Infect. Immunol. 2000. V. 68. P. 6265—6272.
22. RiglerR.J. Microfluorometric characterization of intracellular nucleic acids and nucleoproteins by acridine orange //Acta Physiologica Scandinavica (Suppl). 1996. V. 267. P. 1—122.
Поступилав редакциюю.04.2009 г. Утвержденак печати 17.06.2009 г.
Сведенияоб авторах
Е.С. Агеева— канд. мед, наук, зав. кафедрой фундаментальной медицины и гигиены ХГУим, Н.Ф. Катанова (г, Абакан).
О.В. Штыгашева— д-р мед, наук, директор Медико-тсихологосоциальнопоинститута, зав. кафедрой, профессоркафедры внутреннихболезнейХГУим, Н.Ф,
Катанова , зав. гастроэнтерологическимотделением ГУЗ «Хакасская республиканская больница и м, Г.Я, Ремишевской» (г, Абакан). Н.В. Рязанцева— д-р мед, наук, профессор, зав. кафедрой фундаментальныхоснов клинической медицины СибГМУ(г, Томск).
Для корреспонденции
Агеева ЕлиЗаВетаСергееВна,тел. (3902) 34-27-20, e-mail : ageevaeliz @ rambler .ru
