CC BY
18Гребцова Е.А. Особенности осморегуляторныхреакцийгемоцитов представителей отряда Dictyoptera //Научный результат. Физиология. - Т.2, №4, 2016.
УДК 591.111.1:595.76
DOI: 10.18413/2409-0298-2016-2-4-3-7
Гребцова Е.А.
ОСОБЕННОСТИ ОСМОРЕГУЛЯТОРНЫХ РЕАКЦИЙ ГЕМОЦИТОВ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ОТРЯДА DICTYOPTERA_
Аннотация
Исследовано влияние измененного осмотического давления на форму гемоцитов. Определена способность использования клетками мембранного резерва. Максимальные значения мембранного резерва отмечены у гемоцитов N. cinerea. Плазмоциты N. cinerea, B. craniifer, B. orientalis, а также гранулоциты S. tartara и B. germanica имеют наибольший мембранный резерв и претерпевают значительные изменения при воздействии осмотической нагрузки. В период распластывания плазмоциты приобретают ламеллярно-филоподиальную форму. У прикреплённых к подложке плазмоцитов в гипотонических условиях возникает ореол в виде кругового распластанного по субстрату ободка (ламеллы), который через несколько минут достигает максимального диаметра. Прогемоциты и эноцитоиды практически не изменяют свой объем и форму. Коагулоциты и сферулоциты N. cinerea менее устойчивы к осмотической нагрузке, часть клеток разрушается в гипотонической среде.
Ключевые слова: гемоциты; мембранный резерв; осморегуляция; распластывание.
Grebtsova E.A.
FEATURES OF THE OSMOREGULATORY REACTIONS OF THE DICTYOPTERA'S HEMOCYTES
Key words: hemocytes; membrane reserve; o;
Складчатость мембраны является главной составляющей в реализации способности клеток использовать мембранный резерв. Он, в свою очередь, определяет устойчивость гемоцитов к гипоосмотическим нагрузкам, кроме того играет важную роль в осуществлении фагоцитами своих функций [4, c.152; 5 c.36]. Цель исследования -определить значения мембранного резерва каждого типа гемоцитов у изучаемых видов насекомых, выявить наиболее устойчивые к осмотическим нагрузкам клетки, а также изучить влияние различной осмолярности среды на изменение формы гемоцитов.
Материалы и методы исследования
Исследованы гемоциты семи представителей отряда Dictyoptera: Periplaneta americana, Shelfordella tartara, Gromphadorhina portentosa, Blaberus craniifer, Nauphoeta cinerea, Blatta orientalis, Blatella germanica.
ilation; spreading
Определяли величину мембранного резерва и изучали влияние гипоосмотической нагрузки на объем гемоцитов. Полученную гемолимфу делили на три части, каждую из которых помещали в отдельную чашку Петри. К каждой части гемолимфы добавляли 10 ц1 раствора NaCl определенной концентрации (изотонический раствор - 0,97% NaCl, сильно гипотонический -0,24% NaCl) для определения мембранного резерва. Предварительно выявили 8 гемоцитарных типов, встречающихся в различных вариациях среди видов. Наблюдение за клетками проводили в течение 30 минут. Далее отмечали прижизненные особенности гемоцитов, их морфометрические показатели с помощью оптического инвертированного микроскопа Nikon Digital Eclipse Ti-E. Получали фотографии в режиме реального времени, проводили линейные измерения, применяя анализатор изображений «Видео-Тест».
Гемоциты имеют относительно эллипсоидную форму, поэтому была измерена большая, средняя и
4АУЧ РЕЗУЛЬТАТ
Гребцова Е.А. Особенности осморегуляторныхреакцийгемоцитов представителей отряда Dictyoptera //Научный результат. Физиология. - Т.2, №4, 2016.
RESEARCH Д Е 5 U L ТI
малая ось. В исследованиях форменных элементов гемолимфы тараканов, проведенных ранее [2, ^1635-1636] установлено, что высота гемоцитов, инкубированных в гипотонической среде остается неизменной относительно физиологически нормальных условий. Используя значения этих линейных размеров, рассчитывали площадь поверхности клеток и их объём.
Формулы для расчёта показателей [3, ^558]:
1
5 = !п[(арЬр+арср+Ьрср)/3]Р
где 8 - площадь поверхности гемоцита (цш 2);
а - большая полуось, т.е. '/г длины (цш);
Ь - малая полуось, т.е. / высоты (цш);
с - средняя полуось т.е. / ширины (цш);
p=1,6075 - коэффициент К. Томсена.
У=4/3(яаЬе)
V - объём (цш 3);
а - большая полуось, т.е. / длины (цш);
Ь - малая полуось, т.е. / высоты (цш);
с - средняя полуось т.е. / ширины (цш).
Используя значения площади поверхности, оценивали резервные возможности плазмалеммы гемоцитов.
Рассчитывали абсолютную величину мембранного резерва (AS) как разность между площадью поверхности клетки в сильно гипотоническом растворе и площадью поверхности клетки в изотонической среде [1, а4].
AS=S(СГ)-S(И)
где AS - резерв плазматической мембраны
(цш2);
S(СГ) - площадь поверхности клетки, после инкубации в сильно гипотонической среде (цш2);
S(И) - площадь поверхности клетки, после инкубации в изотонической среде (цш2).
С целью сравнения использования мембранного резерва в гипотоническом растворе клетками насекомых разных видов определяли
относительный мембранный резерв (MR) применением формулы [9, c.4]:
=^S/ S(^)100 % используемого мембранного
MR
где MR - доля резерва (%);
AS - резерв плазматической мембраны (цш2);
S(K) - площадь поверхности клетки, после инкубации в изотонической среде (цш2).
Результаты исследования и их обсуждение
Наибольшие изменения объемных показателей претерпевают прогемоциты N. cinerea. В гипертонической среде объем клеток уменьшается на 12-15%, в то время как у прогемоцитов остальных видов этот показатель не превышает 7%. Подобную реакцию демонстрируют и клетки B. orientalis - в среде с повышенным осмотическим давлением объем прогемоцитов уменьшается на 11%, однако в гипотонических условиях их размер не изменяется. Мембранный резерв данного типа клеток у N. cinerea максимален и составляет в среднем 14% (таблица 1).
Рекордсменами в отношении использования мембранного резерва не только среди плазмоцитов, но и всех форменных элементов гемолимфы, являются плазмоциты N. cinerea. Величина MR составляет «50%. Минимальное использование мембранного резерва
демонстрируют плазмоциты B. germanica и S. tartara, в гипертонической же среде эти клетки уменьшаются в объеме на 13% и 16,6% соответственно. Самыми устойчивыми к воздействию повышенной солености оказались плазмоциты P. americana. Данный тип гемоцитов B. orientalis имеет мембранный резерв, равный 18%, однако значительная часть клеток после увеличения объема не выдерживает гипоосмотической нагрузки и разрушается.
Значения мембранного резерва различных типов гемоцитов исследованных видов, %
Таблица 1
Table 1
с
Membrane reserve values of different types of hemocytes, %
Вид Pr Pl Gr Sph Ver Co Oe Cr
N. cinerea 14,1±3,8 50,0±2,5 15,3±4,0 12,8±2,2 17,5±1,9 20,4±0,9 0 -
B. caniifer 9,2±4,1 20,2±1,6 10,4±1,4 0 14,4±2,1 7,9±1,3 0 -
G. porentosa 0 11,0±1,2 10,7±1,4 9,1±0,9 10,0±1,2 8,0±0,8 0 0
P. americana 0 13,3±1,4 14,1±1,2 0 13,7±1,7 13,8±2,0 - -
S. tartara 5,8±2,1 6,6±0,8 27,4±2,2 6,5± 1,2 11,1±1,4 12,1±1,5 - -
B. orientalis 0 17,5±2,3 12,2±1,9 - 5,7±1,5 - - -
B. germanica 0 6,3±0,6 19,2±1,7 - - 11,5±1,7 0 -
Pr-прогемоциты; Pl-плазмоциты; Gr-гранулоциты; Sph-сферулоциты; Ver- веретеновидные плазмоциты (вермициты);
Co-коагулоциты; Oe-эноцитоиды; Cr-серповидные эноцитоиды «-» - отсутствие гемоцитарного типа у данного вида
4АУЧ РЕЗУЛЬТАТ
RESEARCH HESÜLTI
Гребцова Е.А. Особенности осморегуляторных реакций гемоцитов представителей отряда Dictyoptera //Научный результат. Физиология. - Т.2, №4, 2016.
Среди гранулоцитов клетки S. tartara отличаются наибольшим мембранным резервом (27,4%), а также значительным уменьшением объема (на 27%) в гипертонических условиях. Подобное снижение данного параметра в условиях с повышенным осмотическим давлением характерно и для клеток N. cinerea и G. portentosa. У B. orientalis гранулоциты практически не изменяются в объеме.
За значительным изменением объема клеток S. tartara и B. germanica следует существенное идентичное изменение диаметра ядер (на 1220%). Время распластывания гранулоцитов в гипотонических условиях сокращается до 10-15 минут. Для данного типа гемоцитов в гипертонической среде свойственно сохранение способности формировать псевдоподии, однако их длина уменьшается, и снижается активность клеток. «Раздувание» гранулоцитов в условиях с пониженным осмотическим давлением может приводить к полному разглаживанию поверхности. Выросты мембраны отмечаются только у гемоцитов G. portentosa и B. craniifer. В гемолимфе последних переходная форма клеток от гранулоцитов к сферулоцитам в меньшей степени претерпевает влияние среды на объем, однако эти гемоциты теряют псевдоподии и становятся неподвижными.
Для веретеновидных плазмоцитов (вермицитов) свойственно увеличение размеров по короткой оси при инкубации в гипотонических условиях. На данный тип гемоцитов B. orientalis осмотическое давление среды оказывает наименьшее влияние. Самые высокие значения мембранного резерва для веретеновидных плазмоцитов отмечены у N. cinerea (17-18%).
Наибольшим мембранным резервом (13%) среди сферулоцитов характеризуются клетки N. cinerea, но они демонстрируют низкую устойчивость к среде с пониженным осмотическим давлением. Кроме того, у сферулоцитов данного вида в условиях гипертонии объем становится минимальным. Гемоциты B. craniifer и P. americana не претерпевают морфологических изменений при различных условиях инкубации. Мембранный резерв сферулоцитов у остальных насекомых не превышает 10%, а также они более устойчивы к условиям с повышенным осмотическим давлением.
Исследование коагулоцитов показывает, что клеткам N. cinerea свойственно максимальное увеличение в объёме при действии гипоосмотической нагрузки. Соответственно для них характерен и наибольший мембранный резерв (=20%). Однако, аналогично
сферулоцитам, многие клетки после сильного разбухания разрушаются. К значительному уменьшению объёма коагулоцитов G. portentosa -на 17%, приводит действие гипертонической среды. У данного типа форменных элементов гемолимфы прочих видов этот параметр изменяется не более, чем на 10%.
Эноцитоиды, в том числе серповидные эноцитоиды G. portentosa, не подвергаются существенным изменениям в отношении линейных параметров и формы в условиях осмотической нагрузки.
У гранулоцитов и плазмоцитов в гипотонической среде отмечено увеличение скорости распластывания и изменение его характера. Прикрепление клетки к субстрату, принятие характерной для данного типа клеток формы, а также локомоция могут определяться несколькими элементарными клеточными реакциями (морфогенетическими): реакцией активного прикрепления, контактным торможением и реакцией стабилизации поверхности [11, c.280]. Объекты, которые вследствие больших размеров не могут быть фагоцитированы, окружаются плазмоцитами или/ и гранулоцитами и инкапсулируются. Реакции инкапсуляции и фагоцитоза фундаментально сходны:
распластывание клеток при инкапсуляции можно представить как попытку поглощения слишком крупного объекта [7, c. 322-324].
Ранее петалоидная (с лепестковыми образованиями), ламеллярная и филоподиальная формы рассматривались как разные клеточные типы, однако после исследования Эддса [б, c.492; 8, c.479-480; 9, c.174-176] стало известно, что морфологическая трансформация одной формы клеток в другую обусловлена перестройками цитоскелета (контактно-зависимая
филоподиальная трансформация после прикрепления к субстрату). Нами отмечено, что в период распластывания в гипертонической среде плазмоциты приобретают ламеллярно-филоподиальную форму, на периферии клетки появляются длинные тонкие ветвящиеся филоподии. У прикреплённых ко дну чашек гемоцитов в гипотонических условиях возникает ореол в виде кругового распластанного по субстрату ободка (ламеллы), который через 10-15 минут достигает максимального диаметра. К этому времени почти вся цитоплазма с гранулами оказывается в данном ободке; становится заметным ядро, скрытое в интактной клетке включениями. Сетчатые цитоплазматические тяжи лежащих рядом гемоцитов, объединяются в
общую массу. Агрегацию и распластывание
4АУЧ РЕЗУЛЬТАТ
Гребцова Е.А. Особенности осморегуляторных реакций гемоцитов представителей отряда Dictyoptera //Научный результат. Физиология. - Т.2, №4, 2016.
RESEARCH Д Е 5 U L ТI
гемоцитов по субстрату можно рассматривать как контактную активацию с преобладанием контактов клетка-клетка или клетка-субстрат и проявление in vitro защитных клеточных реакций в условиях, имитирующих повреждение организма [10, c.162].
В случае коагулоцитов при распластывании в гипотонической среде формируется широкий обод ламеллоплазмы, причём внутриклеточные гранулы остаются вокруг ядра, не смещаясь к периферии, но располагаются не плотно друг к другу.
Заключение
В результате проведенных исследований определены площадь и объем гемоцитов, инкубированных в растворах разной осмолярности.
1) Максимальное использование мембранного резерва свойственно гемоцитам N. cinerea. Для фагоцитов (плазмоцитов, гранулоцитов, вермицитов) отмечены высокие значения MR и более быстрое распластывание. Плазмоциты претерпевают морфологическую трансформацию: в гипертонической среде они приобретают ламеллярно-филоподиальную форму, в гипотонической - ламеллярную. Подобные изменения также характерны и для гранулоцитов, но переход от одной формы к другой выражен не так ярко.
2) Коагулоциты и сферулоциты N. cinerea менее устойчивы к осмотической нагрузке, часть клеток разрушается в гипотонической среде. Они характеризуются наибольшими значениями MR в сравнении с этими же клетками у других видов. Коагулоциты в условиях повышенного осмотического давления уменьшаются в объеме, сохраняя прежние очертания. В среде с пониженной концентрацией солей они приобретают ламеллярную форму. Сферулоцитам изменение формы не свойственно.
3) Морфология и размеры прогемоцитов и эноцитоидов у всех исследованных видов насекомых остаются практически неизменными при инкубации в различных условиях.
Список литературы
1. Орлов С.Н., Новиков К.Н. Регуляция объема клеток: механизмы, сопряженные клеточные реакции и патофизиологическое значение // Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 1996. Т.82, № 8-9. С. 1-15.
2. Присный А.А., Гребцова Е.А. Механические свойства плазматической мембраны гемоцитов некоторых представителей отряда Dictyoptera // Вестник Тамбовского университета. Серия Естественные и технические науки. 2013. Т. 18, Вып. 4. С. 1635-1636.
3. Трасатти С., Петрий О.А. Измерения истинной площади поверхности в электрохимии // Электрохимия. 1993. Т. 29. № 4. С. 557-575.
4. Bagge U., Amundson B., Lauritzen C. White blood cell deformability and plugging of skeletal muscle capillaries in hemorrhagic shock // Acta Physiol. Scand. 1980. Vol. 108(2). Pp. 159-163.
5. Bagge U., Skalak R., Attefors R. Granulocyte rheology. Experimental studies in an in vitro microflow system // Adv. Microcirc. 1977. Vol. 7. Pp. 29-49.
6. DeRosier D.J., Edds K.T. Evidence for fascin crosslinks between the filaments in coelomocyte filopodia // Exp. Cell Res. 1980. Vol. 126. Pp. 490-494.
7. Dybas L., Fankboner P.V. Holothurian survival strategies: Mechanisms for the maintenance of a bacteriostatic environment in the coelomic cavity of the sea cucumber // Dev. Comp. Immunol. 1986. Vol. 10. Pp. 311-330.
8. Edds K.T. Dynamic aspects of filopodial formation by reorganization of microfilaments // J. Cell Biol. 1977. Vol. 73(2). Pp. 479-480.
9. Edds K.T. Cell biology of echinoid coelomocytes. I. Diversity and characterization of cell types // J. Invertebr. Pathol. 1993. Vol. 61. Pp. 173-178.
10. Gotz P. Encapsulation in arthropods. In: Immunity in Invertebrates. Cells, Molecules and Defense Reactions. 1986. Pp. 153-170.
11. Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Effects of colcemid on morfogenetic processes and locomotion of fibroblasts. In: Cell Motility. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. 1976. 280 p.
References
1. Orlov S.N., Novikov K.N. Regulation of cells' volume: mechanisms, coupled cells reactions and pathophysiological significance // Fiziologicheskij zhurnal im. I.M. Sechenova. 1996. Vol. 82, No. 8-9. Pp. 1-15.
2. Prisnyi A.A., Grebtsova E.A. Mechanical properties of the hemocytes' plasma membrane of several representatives of the Dictyoptera // Bulletin of Tambov University. Series Natural and Technical Sciences. 2013. Vol. 18. No. 4. Pp. 1635-1636.
3. Trasatti S. Measurements of the real surface area in electrochemistry // Electrochemistry. 1993. Vol. 29. No. 4. Pp. 557-575.
4. Bagge U., Amundson B., Lauritzen C. White blood cell deformability and plugging of skeletal muscle capillaries in hemorrhagic shock // Acta Physiol. Scand. 1980. Vol. 108(2). Pp. 159-163.
5. Bagge U., Skalak R., Attefors R. Granulocyte rheology. Experimental studies in an in vitro microflow system // Adv. Microcirc. 1977. Vol. 7. Pp. 29-49.
6. DeRosier D.J., Edds K.T. Evidence for fascin cross-links between the filaments in coelomocyte filopodia //Exp. Cell Res. 1980. Vol. 126. Pp. 490-494.
7. Dybas L., Fankboner P.V. Holothurian survival strategies: Mechanisms for the maintenance of a bacteriostatic environment in the coelomic cavity of the sea cucumber // Dev. Comp. Immunol. 1986. Vol. 10. Pp. 311-330.
Н1АУЧ
РЕЗУЛЬТАТ
RESEARCH НЕ ^TITT^M
4ЫЙ
Гребцова Е.А. Особенности осморегуляторных реакций гемоцитов представителей отряда Dictyoptera //Научный результат. Физиология. - Т.2, №4, 2016.
8. Edds K.T. Dynamic aspects of filopodial formation by reorganization of microfilaments // J. Cell Biol. 1977. Vol. 73(2). Pp. 479-480.
9. Edds K.T. Cell biology of echinoid coelomocytes. I. Diversity and characterization of cell types // J. Invertebr. Pathol. 1993. Vol. 61. Pp. 173-178.
10. Gotz P. Encapsulation in arthropods. In: Immunity in Invertebrates. Cells, Molecules and Defense Reactions. 1986. Pp. 153-170.
11. Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Effects of colcemid on morfogenetic processes and locomotion of fibroblasts. In: Cell Motility. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. 1976. 280 p.
Гребцова Елена Александровна, аспирант, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»,
ул. Победы 85, г. Белгород, 308015, Россия E-mail: grebtsova_e@mail.ru
Grebtsova Elena Alexandrovna, Post-graduate Student
Belgorod National Research University, 85 Pobedy St., Belgorod, 308015, Russia E-mail: grebtsova_e@mail.ru
