CC BY
24
Научная статья
УДК 634.74
doi: 10.37670/2073-0853-2022-98-6-93-97
Особенности органогенеза лимонника китайского при клональном микроразмножении с использованием современных ростостимулирующих препаратов
Ирина Борисовна Кузнецова1, Сергей Сергеевич Макаров2,
Владимир Викторович Суров3, Андрей Николаевич Кульчицкий4
1 Костромская государственная сельскохозяйственная академия, Караваево, Костромская область, Россия
2 Центрально-европейская лесная опытная станция ВНИИЛМ, Кострома, Россия
3 Вологодская государственная молочнохозяйственная академия, Молочное, Вологодская область, Россия
4 Северный (Арктический) федеральный университет, Архангельск, Россия
Аннотация. В статье приведены результаты исследований по клональному микроразмножению лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) с использованием питательных сред MS и QL в различных модификациях, цитокининов 6-БАП и 2-iP в разных концентрациях и добавки ростостимулирующего препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л. На этапе «введение в культуру in vitro» наилучшие показатели приживаемости (86 - 90 %) выявлены при стерилизации эксплантов лимонника 0,2%-ным раствором нитрата серебра, 5%-ными растворами препаратов Лизоформин 3000 и Экостерилизатор бесхлорный в течение 15 мин. и 0,2%-ным раствором сулемы в течение 10 мин. На этапе «собственно микроразмножение» при повышении в питательной среде концентрации цитокининов количество микропобегов растений-регенерантов лимонника китайского увеличивалось при использовании 6-БАП в среднем в 2,8 раза, при использовании 2-iP - в 1,4 раза. Увеличение суммарной длины микропобегов лимонника в 2,9 раза отмечено при повышении концентрации 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л. Добавление препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л способствовало значительному увеличению суммарной длины микропобегов лимонника китайского in vitro при использовании 6-БАП и 2-iP в концентрации 0,5 мг/л.
Ключевые слова: лимонник китайский, клональное микроразмножение, in vitro, побегообразование, питательная среда, регуляторы роста, ростостимулирующие вещества.
Для цитирования: Особенности органогенеза лимонника китайского при клональном микроразмножении с использованием современных ростостимулирующих препаратов / И.Б. Кузнецова, С.С. Макаров, В.В. Суров, А.Н. Кульчицкий // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2022. № 6 (98). С. 93 - 97. https://doi.org/10.37670/2073-0853-2022-98-6-93-97.
Original article
Peculiarities of Schisandra chinensis organogenesis during clonal micropropagation using modern growth-stimulating preparations
Irina B. Kuznetsova1, Sergey S. Makarov2, Vladimir V. Surov3, Andrey N. Kulchitsky4
1 Kostroma State Agricultural Academy, Karavaevo village, Kostroma region, Russia
2 Central European Forest Experiment Station - Branch of All-Russian Research Institute of Silviculture and Mechanization of Forestry, Kostroma, Russia
3 Vologda State Dairy Academy, Molochnoe village, Vologda, Russia
4 Northern (Arctic) Federal University, Arkhangelsk, Russia
Abstract. The results of studies on clonal micropropagation of Schisandra chinensis (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.) using MS and QL nutrient medias in various modifications, cytokinins 6-BAP and 2-iP in different concentrations, and the addition of the growth-stimulating preparation HB-101 in concentration 0.1 ml/l. The best survival rates (86 - 90 %) of Schisandra explants are found during sterilization with solutions of silver nitrate 0.2 %, Lysoformin 3000 5 % and Ecosterilizer chlorine-free 5 % for 15 minutes, and sublimate 0,2 % -for 10 minutes at the stage of "introduction into in vitro culture". The number of microshoots of regenerated Schisandra chinensis plants increased by an average of 2.8 times when using 6-BAP, and by 1.4 times when using 2-iP with an increase in the concentration of cytokinins in the nutrient medium at the "proper micropropagation" stage. An increase in the total length of magnolia vine microshoots by 2.9 times is noted with an increase in the concentration of 6-BAP from 0.5 to 1.0 mg/l. The addition of the preparation HB-101 at a concentration of 0.1 ml/l contributed to a significant increase in the total length of Schisandra chinensis microshoots in vitro when using 6-BAP and 2-iP at a concentration of 0.5 mg/l.
Keywords: Schisandra chinensis, clonal micropropagation, in vitro, shoot formation, nutrient medium, growth regulators, growth stimulants.
For citation: Peculiarities of Schisandra chinensis organogenesis during clonal micropropagation using modern growth-stimulating preparations / I.B. Kuznetsova, S.S. Makarov, V.V. Surov, A.N. Kulchitsky. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2022; 98(6): 93-97. (In Russ.). https://doi.org/10.37670/2073-0853-2022-98-6-93-97.
В последние годы среди потребителей значительно увеличивается спрос на ягодную продукцию и посадочный материал, адаптированные к нетрадиционным для их выращивания природно-климатическим условиям. Большую популярность среди таких растений получил лимонник китайский (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.), что подтверждается положительным опытом его культивирования в ряде регионов европейской части России [1 - 3]. Данный вид отличается высоким содержанием природных биологически активных веществ (БАВ), обладающих адапто-генными и антиоксидантными свойствами, а, кроме того, являясь лианой, привлекателен в качестве декоративного растения [4 - 7]. Рост потребительского спроса на такую плодово-ягодную продукцию приводит к расширению её выращивания в промышленных масштабах на специализированных плантациях, к поиску и внедрению более интенсивных, продуктивных и экономических выгодных способов и технологий производства. Наиболее целесообразным для этих целей является использование метода клонального микроразмножения [8, 9].
На сегодняшний день имеется некоторый опыт выращивания лимонника китайского в культуре in vitro как российскими, так и зарубежными исследователями [10 - 16], однако до сих пор существуют разногласия относительно использования минерального и гормонального состава питательных сред и концентраций рострорегулирующих веществ, а также практически не встречается работ с применением современных экологически безопасных стимуляторов роста для улучшения морфогенеза выращиваемых растений.
Исследование проведено с целью изучения влияния добавки ростостимулирующего препарата HB-101 на органогенез лимонника китайской при клональном микроразмножении.
Материал и методы. Исследование проведено в 2020 - 2022 гг. на базе Центрально-европейской лесной опытной станции ВНИИЛМ по общепринятым методикам [9]. В качестве объектов исследований использовали эксплан-ты лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.), полученные из пазушных почек
растений. На этапе «введение в культуру in vitro» в качестве основных стерилизующих агентов использовали растворы: сулемы (0,2%-ный), перекиси водорода (30%-ный), хлорной извести (в соотношении 1:1), нитрата серебра (0,2%-ный), препаратов Экостерилизатор бесхлорный (5%-ный) и Лизоформин 3000 (5%-ный). Время стерилизации составляло 5, 10, 15 и 20 мин.
Растения-регенеранты культивировали в условиях световой комнаты при фотопериоде 16/8 час., поддержании температуры +23...+25 °C и влажности воздуха 75 - 80 %. Использовали питательные среды по прописи Мурасиге - Скуга (MS) [17] и Кворина - Лепуавра (QL) [18], в том числе в вариантах с разбавлением минерального состава в 2 раза. На этапе «собственно микроразмножение» в качестве росторегулирующих веществ цитокининовой группы использовали 6-БАП и 2-iP в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л. Также использовали добавку современного экологически безопасного ростостимулирующего препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л. Учитывали количество, среднюю и суммарную длину микропобегов в расчёте на одно растение. Повторность опыта 10-кратная, в каждом варианте было по 15 раст.
Результаты и обсуждение. На этапе введения в культуру in vitro эксплантов лимонника китайского наибольшую эффективность продемонстрировали растворы-стерилизаторы нитрат серебра - 0,2%-ный и Лизоформин 3000 - 5%-ный, при этом время стерилизации составляло 15 мин. (жизнеспособность эксплантов достигала 90 %). Достаточно высокая жизнеспособность (86 - 89 %) эксплантов лимонника китайского была отмечена также при использовании 5%-ного раствора Экостерилизатора бесхлорного в течение 15 мин. и сулемы в течение 10 мин. При увеличении времени стерилизации до 15 - 20 мин. жизнеспособность резко снижалась до 23 - 35 %, что связано, по всей видимости, с фитотоксичностью хлорида ртути. При времени стерилизации 5 мин. процент жизнеспособных эксплантов при обработке исследуемыми стерилизующими агентами был низким и не превышал 40 %, остальные экспланты погибали от инфекции (табл. 1).
1. Жизнеспособность эксплантов лимонника китайского в зависимости от стерилизующих агентов и времени стерилизации, %
Стерилизующий агент, раствор Время стерилизации, мин.
5 10 15 20
Сулема, 0,2%-ный 8 86 40 12
Перекись водорода, 30%-ный 6 18 56 40
Хлорная известь 1:1 10 14 52 60
AgNOз, 0,2%-ный 40 54 90 30
Экостерилизатор бесхлорный, 5%-ный 16 28 89 72
Лизоформин 3000, 5%-ный 16 30 90 28
На этапе «собственно микроразмножение» статистически значимых различий по количеству микропобегов (в среднем 1,8 - 1,9 шт.) у растений-регенерантов лимонника китайского in vitro в зависимости от состава питательной среды не выявлено. При повышении концентрации ци-токинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л количество побегов у растений-регенерантов увеличивалось в среднем в 2,8 раза, а при использовании 2-iP -лишь в 1,4 раза (табл. 2).
При добавлении в питательную среду препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л количество микропобегов увеличивалось в среднем в 1,2 - 1,7 раза по сравнению с вариантами без использования ростостимулирующих веществ.
Средняя длина микропобегов лимонника китайского in vitro не имела статистически значимых различий как в зависимости от состава
питательной среды (в среднем 1,1 - 1,4 см), так и от концентраций цитокининов 6-БАП и 2-iP (в среднем 1,1 - 1,5 см) (табл. 3). С добавлением в питательную среду препарата HB-101, 0,1 мл/л, отмечено увеличение средней длины микропобегов в 1,1 - 1,8 раза, однако в варианте с цитоки-нином 2-iP в концентрации 1,0 мг/л наблюдалось незначительное уменьшение данного показателя.
Суммарная длина микропобегов лимонника китайского in vitro в зависимости от состава питательной среды варьировала в среднем от 1,8 до 2,7 см. При повышении концентрации в питательной среде цитокинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л суммарная длина побегов лимонника китайского увеличилась в среднем в 2,9 раза. При аналогичном повышении концентрации ци-токинина 2-iP статистически значимых различий не отмечалось (табл. 4).
2. Количество микропобегов лимонника китайского in vitro в зависимости от состава питательной среды и концентраций регуляторов роста, шт.
Питательная среда Концентрация цитокинина, мг/л
6-БАП 2-iP среднее
0,5 1,0 0,5 1,0
Без добавления ростостимулирующих препаратов
MS 1,0 3,5 1,0 1,5 1,8
MS 1/2 1,4 3,3 1,1 1,8 1,9
QL 1,2 3,4 1,2 1,4 1,8
QL 1/2 1,3 3,3 1,1 1,7 1,9
Среднее 1,2 3,4 1,1 1,6 -
НСР05 фактор А = 1,96; фактор B = 1,84; общ. = 2,02
С добавлением препарата HB-101, 0,1 мл/л
MS 1,6 5,5 1,8 2,5 2,8
MS 1/2 1,8 3,8 2,1 2,0 2,4
QL 1,5 6,4 1,9 1,7 2,9
QL 1/2 1,7 5,3 2,0 1,3 2,6
Среднее 1,6 5,2 1,9 1,9 -
НСР05 фактор А = 1,36; фактор B = 1,24; общ. = 1,42
Питательная среда Концентрация цитокинина, мг/л
6-БАП 2-iP среднее
0,5 1,0 0,5 1,0
Без добавления ростостимулирующих препаратов
MS 1,2 1,0 1,0 0,9 1,0
MS 1/2 1,4 1,8 1,1 1,0 1,3
QL 1,5 1,6 1,0 1,0 1,3
QL 1/2 1,4 1,5 1,3 1,3 1,4
Среднее 1,4 1,5 1,1 1,1 -
НСР05 фактор А = 1,25; фактор B = 1,03; общ. = 1,48
С добавлением препарата HB-101, 0,1 мл/л
MS 2,2 1,5 1,5 0,9 1,5
MS 1/2 2,6 1,6 1,9 0,5 1,6
QL 2,9 1,4 1,5 1,2 1,7
QL 1/2 2,4 1,8 2,0 1,1 1,8
Среднее 2,5 1,6 1,7 0,9 -
НСР05 фактор А = 1,14, фактор B = 1,10; общ. = 1,06
3. Средняя длина микропобегов лимонника китайского in vitro в зависимости от состава питательной среды и концентрации регуляторов роста, см
4. Суммарная длина микропобегов лимонника китайского in vitro в зависимости от состава питательной среды и концентрации регуляторов роста, см
Питательная среда Концентрация цитокинина, мг/л
6-БАП 2-iP среднее
0,5 1,0 0,5 1,0
Без добавления ростостимулирующих препаратов
MS 1,2 3,5 1,0 1,4 1,8
MS 1/2 2,0 5,9 1,2 1,8 2,7
QL 1,8 5,4 1,2 1,4 2,6
QL 1/2 1,8 5,0 1,4 2,2 2,6
Среднее 1,8 5,2 1,3 1,9 -
НСР05 фактор А = 1,71; фактор B = 1,65; общ. = 2,12
С добавлением препарата HB-101, 0,1 мл/л
MS 3,5 8,3 2,7 2,3 4,2
MS 1/2 4,7 6,2 4,1 1,1 4,1
QL 4,3 2,9 2,8 2,2 3,1
QL 1/2 4,1 4,1 4,0 1,4 3,4
Среднее 4,1 5,3 3,4 1,7 -
НСР05 фактор А = 1,41; фактор B = 1,26; общ. = 1,10
Применение препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л в сочетании с ростостимулирующими добавками - цитокининами 6-БАП и 2-iP в концентрации 0,5 мг/л способствовало увеличению суммарной длины микропобегов в среднем в 2,3 - 2,6 раза по сравнению с вариантами без ростостимулирующих препаратов. Применение 6-БАП в дозе 1,0 мг/л привело к незначительному увеличению данного показателя, а цитокинин 2-iP в аналогичной дозе незначительно уменьшил значение суммарной длины микропобегов.
Выводы. При клональном микроразмножении лимонника китайского на этапе введения в культуру in vitro следует применять при стерилизации в течение 15 мин. наиболее эффективные агенты - 0,2%-ный раствор нитрата серебра и 5%-ный раствор препарата Лизоформин 3000. Для увеличения суммарной длины побегов лимонника китайского целесообразно повышение концентрации в питательной среде цитокинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л. Добавление ростостимулирующего препарата HB-101, 0,1 мл/л, при использовании цитокининов 6-БАП и 2-iP в концентрации 0,5 мг/л способствует значительному увеличению длины микропобегов лимонника китайского в культуре in vitro.
Список источников
1. Колбасина Э.И. Актинидии и лимонник в России (биология, интродукция, селекция). М.: Россельхозака-демия, 2000. 264 с.
2. Барабаш С.В., Ляшенко М.В., Куркин В.А. Лимонник китайский: итоги и перспективы исследований // Рынок БАД. 2006. № 3 (29). C. 14 - 17.
3. Кулагина В.Л., Евдокименко С.Н. Малораспространённые плодовые культуры для средней полосы России: учеб.-методич. пособ. Брянск: Изд-во Брянской ГСХА, 2012. 52 с.
4. Плеханова М.Н. Актинидия, лимонник, жимолость. Л.: Агропромиздат, Ленингр. отд-ние, 1990. 87 с.
5. Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е. Растения-антигипоксанты (фитотерапия). СПб., 1991. 96 с.
6. Кротова И.В., Ефремов А.А. Исследование химического состава плодов лимонника китайского // Химия растительного сырья. 1999. № 4. С. 131 - 133.
7. Иваненко Н.В., Ковековдова Л.Т. Микроэлементный состав лекарственных растений Приморского края // Тихоокеанский медицинский журнал. 2014. № 2. С. 18 - 21.
8. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. / В.С. Шевелуха и др. М.: Высшая школа, 2008. 416 с.
9. Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений: учеб. и практикум для вузов. М.: Юрайт, 2020. 333 с.
10. Упадышев М.Т., Туть Е.А. Особенности размножения актинидии и лимонника китайского in vitro и зелёными черенками // Плодоводство и ягодоводство России. 2004. Т. 11. С. 200 - 209.
11. Совершенствование метода клонального микроразмножения актинидии и лимонника китайского / С.А. Муратова, Д.Г. Шорников, М.Б. Янковская, Р.В. Папихин // Современное садоводство. 2010. № 1. С. 96 - 100.
12. Validated Method for Bioactive Lignans in Schisandra chinensis In Vitro Cultures Using a Solid Phase Extraction and a Monolithic Column Application / L. Brezinova, H. Vlasinova, L. Havel et al. Biomed. Chromatogr. 2010; 24: 954-960.
13. Szopa A., Ekiert H. In Vitro Cultures of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (Chinese Magnolia Vine) - A Potential Biotechnological Rich Source of Therapeutically Important Phenolic Acids. Appl. Biochem. Biotechnol. 2012; 166: 1941-1948. https://doi.org/10.1007/s12010-012-9622-y
14. Ахметова А.Ш. Размножение лимонника китайского (Schisandra chinensis (Turcz) Baill.) in vitro // Агрохимия. 2014. № 11. С. 52 - 57.
15. Shornikov D. The Effect of Nitrogen Sources on the Growth Response of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill in the In Vitro Culture. Russian Journal of Horticulture. 2015; 2: 113-118.
16. Зонтиков Д.Н., Марамохин Э.В., Малахова К.В. Особенности клонального микроразмножения Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. // Перспективы лекарственного растениеведения: сб. науч. тр. Междунар. науч. конф.,
посв. 100-летию со дня рождения проф. А.И. Шретера. М.: ВИЛАР, 2018. С. 318 - 323.
17. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Phisiol. Plantarum. 1962; 15(3): 473-497.
18. Quoirin M., Lepoivre P. Improved Media for In Vitro Culture of Prunus species. Acta Horticulturae. 1977; 78: 437-442.
References
1. Kolbasina E.I. Actinidia and Schisandra in Russia (Biology, Iintroduction, Selection). M.: Russian Agricultural Academy, 2000. 264 p.
2. Barabash S.V., Lyashenko M.V., Kurkin V.A. Schisandra Chinensis: Results and Prospects of Research. BAA Market. 2006; 29(3): 14-17.
3. Kulagina V.L., Evdokimenko S.N. Rare Fruit Crops for Central Russia: textbook. Bryansk: Bryansk State Agricultural Academy Publ., 2012. 52 p.
4. Plekhanova M.N. Actinidia, Schisandra, Honeysuckle. Leningrad: Agropromizdat, Leningrad Department, 1990. 87 p.
5. Pastushenkov L.V., Lesiovskaya E.E. Plants-antihy-poxants (Phytotherapy). St. Petersburg, 1991. 96 p.
6. Krotova I.V., Efremov A.A. Study of the Chemical Composition of the Fruits of Schisandra chinensis. Chemistry of Vegetable Raw Materials. 1999; 4: 131-133.
7. Ivanenko N.V., Kovekovdova L.T. Trace Element Composition of Medicinal Plants of Primorsky Krai. Pacific Medical Journal. 2014; 2: 18-21.
8. Agricultural Biotechnology: textbook / V.S. Shev-elukha et al. M.: Vysshaya shkola, 2008. 416 p.
9. Kalashnikova E.A. Cellular Engineering of Plants: textbook. M.: Urait, 2020. 333 p.
10. Upadyshev M.T., Tut E.A. Peculiarities of Propagation of Actinidia and Schisandra chinensis In Vitro and by Green Cuttings. Fruit Growing and Berry Growing in Russia. 2004; 11: 200-209.
11. Improvement of Clonal Micropropagation Method of Actinidia and Schisandra chinensis / S.A. Muratova, D.G. Shornikov, M.B. Yankovskaya, R.V. Papikhin. Modern Gardening. 2010; 1: 96-100.
12. Validated Method for Bioactive Lignans in Schisandra chinensis In Vitro Cultures Using a Solid Phase Extraction and a Monolithic Column Application / L. Brezinova, H. Vlasinova, L. Havel et al. Biomed. Chromatogr. 2010; 24: 954-960.
13. Szopa A., Ekiert H. In Vitro Cultures of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. (Chinese Magnolia Vine) - A Potential Biotechnological Rich Source of Therapeutically Important Phenolic Acids. Appl. Biochem. Biotechnol. 2012; 166: 1941-1948. https://doi.org/10.1007/s12010-012-9622-y
14. Akhmetova A.Sh. Reproduction of Schisandra chinensis (Turcz) Baill. In Vitro. Agrochemistry. 2014; 11: 52-57.
15. Shornikov D. The Effect of Nitrogen Sources on the Growth Response of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill in the In Vitro Culture. Russian Journal of Horticulture. 2015; 2: 113-118.
16. Zontikov D.N., Maramokhin E.V., Malakhova K.V. Peculiarities of Clonal Micropropagation of Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. // Proc. Int. Sc. Conf. "Perspectives of Medicinal Plant Science". M., 2018. P. 318-323.
17. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Phisiol. Plantarum. 1962; 3 (15): 473-497.
18. Quoirin M., Lepoivre P. Improved Media for In Vitro Culture of Prunus Species. Acta Horticulturae. 1977; 78: 437-442.
Ирина Борисовна Кузнецова, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5011-3271
Сергей Сергеевич Макаров, доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-0564-8888
Владимир Викторович Суров, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-1095-660X
Андрей Николаевич Кульчицкий, магистрант, [email protected]
Irina B. Kuznetsova, Candidate of Agriculture, Associate Professor, [email protected], https://orcid.org/0000-0001-5011-3271
Sergey S. Makarov, Doctor of Agriculture, Senior Researcher, [email protected], https://orcid.org/0000-0003-0564-8888
Vladimir V. Surov, Candidate of Agriculture, Associate Professor, [email protected], https://orcid.org/0000-0002-1095-660X
Andrey N. Kulchitsky, Master's degree student, [email protected]
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests. Статья поступила в редакцию 07.09.2022; одобрена после рецензирования 19.09.2022; принята к публикации 31.10.2022.
The article was submitted 07.09.2022; approved after reviewing 19.09.2022; accepted for publication 31.10.2022.
-Ф-
