CC BY
13
Научная статья
УДК 634.74
doi: 10.37670/2073-0853-2022-98-6-88-92
Органогенез актинидии коломикта при клональном микроразмножении с применением современных ростостимулирующих добавок
Сергей Сергеевич Макаров1, Ирина Борисовна Кузнецова2,
Андрей Николаевич Кульчицкий3, Елена Ивановна Куликова4
1 Костромская государственная сельскохозяйственная академия, Караваево, Костромская область, Россия
2 Центрально-европейская лесная опытная станция ВНИИЛМ, Кострома, Россия
3 Северный (Арктический) федеральный университет им. М.В. Ломоносова, Архангельск, Россия
4 Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина, Молочное, Вологодская область, Россия
Аннотация. В статье приведены результаты исследований по изучению влияния составов питательных сред MS и QL, концентраций цитокининов 6-БАП, 2-iP и добавки препарата HB-101 на органогенез in vitro актинидии коломикта (Actinidia kolomikta (Maxim. & Rupr.) Maxim.). На этапе «введение в культуру in vitro» наибольшая жизнеспособность эксплантов актинидии (82 - 90 %) отмечена при стерилизации их 5%-ными растворами препаратов Лизоформин 3000 и Экостерилизатор бесхлорный в течение 15 мин. и 0,2%-ным раствором нитрата серебра в течение 10 и 15 мин. На этапе «собственно микроразмножение» при повышении в питательной среде концентрации цитокининов от 0,5 до 1,0 мг/л количество микропобегов актинидии коломикта in vitro увеличивалось при использовании 6-БАП в среднем в 1,9 раза, при использовании 2-iP - в 1,6 раза. Суммарная длина микропобегов актинидии in vitro увеличивалась в среднем в 1,5 раза при повышении в питательной среде концентрации цитокинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л. Добавление в питательную среду препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л способствовало увеличению количества (в 1,1 - 1,3 раза) и суммарной длины (в 1,6 - 3,3 раза) микропобегов актинидии коломикта по сравнению с вариантами без использования ростостимулирующих веществ.
Ключевые слова: актинидия коломикта, клональное микроразмножение, in vitro, побегообразование, питательная среда, регуляторы роста, ростостимулирующие вещества.
Для цитирования: Органогенез актинидии коломикта при клональном микроразмножении с применением современных ростостимулирующих добавок / С.С. Макаров, И.Б. Кузнецова, А.Н. Кульчицкий, Е.И. Куликова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2022. № 6 (98). С. 88 - 92. https://doi.org/10.37670/2073-0853-2022-98-6-88-92.
Original article
Organogenesis of actinidia kolomikta during clonal micropropagation using modern growth-stimulating additives
Sergey S. Makarov1, Irina B. Kuznetsova2,
Andrey N. Kulchitsky3, Elena I. Kulikova4
1 Kostroma State Agricultural Academy, Karavaevo village, Kostroma region, Russia
2 Central European Forest Experiment Station - Branch of All-Russian Research Institute of Silviculture and Mechanization of Forestry, Kostroma, Russia
3 Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov, Arkhangelsk, Russia
4 Vologda State Dairy Academy named after N.V. Vereshchagin, Molochnoe village, Vologda, Russia
Аbstract. The results of studies on the influence of the compositions of the MS and QL nutrient medias, the concentrations of cytokinins 6-BAP, 2-iP and the addition of the HB-101 preparation on the in vitro organogenesis of actinidia kolomikta (Actinidia kolomikta (Maxim. & Rupr.) Maxim.). The highest viability of actinidia explants (82 - 90 %) is observed when sterilized with 5 % solutions of preparations Lysoformin 3000 and Ecosterilizer chlorine-free for 15 minutes and 0.2 % solution of silver nitrate for 10 and 15 minutes at the stage of "introduction into in vitro culture". The number of microshoots of actinidia kolomikta in vitro increased by an average of 1.9 times with the use of 6-BAP, with the use of 2-iP - 1.6 times with an increase in the concentration of cytokinins in the nutrient medium from 0.5 to 1.0 mg/l at the stage of "proper micropropagation". The total length of actinidia microshoots in vitro increased on average 1.5 times with an increase in the concentration of cytokinin 6-BAP in the nutrient medium from 0.5 to 1.0 mg/l. The addition of the HB-101 preparation at a concentration of 0.1 ml/l to the nutrient medium contributed to an increase in the number (by 1.1 - 1.3 times) and the total length (by 1.6 - 3.3 times) of actinidia kolomikta microshoots compared to options without the use of growth-stimulating substances.
Keywords: actinidia kolomikta, clonal micropropagation, in vitro, shoot formation, nutrient medium, growth regulators, growth stimulants.
For citation: Organogenesis of actinidia kolomikta during clonal micropropagation using modern growth-stimulating additives / S.S. Makarov, I.B. Kuznetsova, A.N. Kulchitsky, E.I. Kulikova. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2022; 98(6): 88-92. (In Russ.). https://doi.org/10.37670/2073-0853-2022-98-6-88-92.
За последние десятилетия наблюдается увеличение интереса к интродукции плодово-ягодных культур, имеющих высокую пищевую и лекарственную ценность, в нехарактерных для них природно-климатических условиях и являющихся редкими и исчезающими даже в границах собственного ареала. Одним из наиболее популярных дальневосточных видов, культивируемых в европейской части России, является актинидия коломикта (Actinidia kolomikta (Maxim. & Rupr.) Maxim.) [1 - 5]. Её плоды со вкусом, напоминающим ананас, ценятся за гармоничное сочетание сахаров, органических кислот, витаминов и обладают широким диапазоном лекарственных свойств [6 - 10].
Для удовлетворения возрастающего потребительского спроса на ягодную продукцию необходимо создание специализированных плантаций. Актинидию возможно успешно размножать зелёным черенкованием [11], однако традиционные способы размножения оказываются технологически и экономически малоэффективными для выращивания в промышленных масштабах. Для этих задач целесообразно использовать метод клонального микроразмножения, позволяющий круглогодично и в короткие сроки получать большое количество высококачественного однородного посадочного материала в лабораторных условиях [12, 13]. Несмотря на существующие исследования ряда зарубежных и российских учёных в области выращивания актинидии in vitro [14 - 18], до сих пор не разрешены разногласия в плане использования составов питательных сред, регуляторов роста и их концентраций, а также не встречается работ с использованием современных экологически безопасных стимуляторов роста с целью повышения качества роста и развития культивируемых растений.
Цель исследования - изучение влияния добавки ростостимулирующего препарата HB-101 на органогенез актинидии коломикта в культуре in vitro.
Материал и методы. Исследования проводили в 2020 - 2022 гг. в лаборатории клонального микроразмножения растений на базе Центрально-европейской лесной опытной станции ВНИИЛМ по общепринятым методикам [13, 19]. В качестве объектов исследований использовали экспланты актинидии коломикта (Actinidia kolomikta (Maxim. & Rupr.) Maxim.), полученные из пазушных почек. На этапе «введение в культуру in vitro» в качестве стерилизующих агентов использовали растворы: хлорной извести (в соотношении 1:1), перекиси водорода (30 %), сулемы (0,2 %), нитрата серебра (0,2 %), препаратов Лизофор-мин 3000 (5 %) и Экостерилизатор бесхлорный (5 %). Время стерилизации - 5, 10, 15 и 20 мин. Учитывали жизнеспособность эксплантов как процент выживших от общего числа.
Растения-регенеранты культивировали в условиях световой комнаты при 16-часовом фотопериоде, температуре +23.. .+25 °C и влажности воздуха 75 - 80 %. Использовали питательные среды по прописи Мурасиге - Скуга (MS) [20] и Кворина - Лепуавра (QL) [21], в том числе в вариантах с разбавлением минерального состава в 2 раза. На этапе «собственно микроразмножение» в качестве росторегулирующих веществ цитокининовой группы использовали 2-изопанталаденин (2-iP) и 6-бензниламинопурил (6-БАП) в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л. В качестве ростостимулирующей добавки использовали современный экологически безопасный препарат HB-101 (на основе хвои кипариса, сосны, коры платана и листьев подорожника) в концентрации 0,1 мл/л. Учитывали количество, среднюю и суммарную длину микропобегов в расчёте на одно растение. Повторность опыта 10-кратная, в каждом варианте по 15 растений.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2016 и AGROS v. 2.11. Достоверность опытов оценивали при помощи наименьшей существенной разности на 5%-ном уровне значимости (НСР05), где в качестве одного фактора влияния принимали состав питательной среды, в качестве другого - концентрацию регуляторов роста.
Результаты и обсуждение. В результате проведённых экспериментальных исследований установлено, что на этапе введения в культуру in vitro эксплантов актинидии коломикта наиболее эффективными основными стерилизующими агентами оказались 5%-ные растворы препаратов Лизоформин 3000 и Экостерилизатор бесхлорный при времени стерилизации 15 мин., где жизнеспособность достигала 90 %, а также нитрат серебра 0,2%-ный при времени стерилизации 10 и 15 мин., где жизнеспособность эксплантов составляла 82 - 86 %. При экспозиции 5 мин. процент жизнеспособных эксплантов при обработке исследуемыми стерилизующими агентами был низким и не превышал 32 %, тогда как остальные экспланты погибали от инфекции (табл. 1).
На этапе «собственно микроразмножение» статистически значимых различий по количеству побегов (в среднем 3,1 - 4,0 шт.) у растений-регенерантов актинидии коломикта in vitro в зависимости от состава питательной среды не выявлено. При повышении концентрации цитокинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л количество микропобегов актинидии увеличивалось в среднем в 1,9 раза, при использовании 2-iP - в 1,6 раза (табл. 2).
При добавлении в питательную среду препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л количество микропобегов увеличивалось в среднем
в 1,1 - 1,3 раза по сравнению с вариантами без ростостимулирующих веществ.
Средняя длина микропобегов актинидии коломикта in vitro не имела статистически значимых различий как в зависимости от состава питательной среды (в среднем 1,6 - 2,0 см), так
и от концентраций цитокининов 6-БАП и 2^Р (в среднем 1,0 - 2,7 см) (табл. 3). Добавление в питательную среду препарата НВ-101, 0,1 мл/л, способствовала увеличению длины в среднем в 1,3 - 2,6 раза по сравнению с вариантами без использования ростостимулирующих веществ.
1. Жизнеспособность эксплантов актинидии коломикта в зависимости от стерилизующих агентов и времени стерилизации, %
Стерилизующий агент Время стерилизации, мин.
5 10 15 20
Хлорная известь 1:1 8 10 40 62
Перекись водорода, 30%-ный р-р 2 10 44 60
Сулема, 0,2%о-ный р-р 10 74 30 10
AgNO3, 0,2%-ный р-р 32 86 82 32
Экостерилизатор бесхлорный, 5%-ный р-р 4 32 90 62
Лизоформин 3000, 5%-ный р-р 10 45 90 58
2. Количество микропобегов актинидии коломикта in vitro в зависимости от состава питательной среды и концентрации регуляторов роста, шт.
Питательная среда Концентрация цитокинина, мг/л
6-БАП 2-iP среднее
0,5 1,0 0,5 1,0
Без ростостимулирующих препаратов
MS 3,3 6,5 1,8 3,1 3,7
MS 1/2 3,0 5,2 1,5 2,8 3,1
QL 4,2 7,8 1,6 2,5 4,0
QL 1/2 3,2 6,3 2,0 2,4 3,5
Среднее 3,4 6,5 1,7 2,7 -
НСР05 фактор А = 2,15; фактор B = 2,10; общ. = 2,73
С добавкой HB-101, 0,1 мл/л
MS 3,8 6,9 1,2 3,0 3,7
MS 1/2 2,8 7,4 2,4 3,7 4,1
QL 6,2 8,1 1,9 4,1 5,1
QL 1/2 4,7 6,9 3,1 3,2 4,5
Среднее 4,4 7,3 2,1 3,5 -
НСР05 фактор А = 1,95; фактор B = 1,80; общ. = 2,23
3. Средняя длина микропобегов актинидии коломикта in vitro в зависимости от состава питательной среды и концентрации регуляторов роста, см
Питательная среда Концентрация цитокинина, мг/л
6-БАП 2-iP среднее
0,5 1,0 0,5 1,0
Без ростостимулирующих препаратов
MS 2,8 2,0 1,1 0,9 1,7
MS 1/2 2,5 2,1 1,2 0,8 1,6
QL 3,0 2,5 1,3 1,2 2,0
QL 1/2 2,4 2,1 1,2 1,0 1,7
Среднее 2,7 2,2 1,2 1,0 -
НСР05 фактор А = 1,82; фактор B = 1,73; общ. = 2,09
С добавкой HB-101, 0,1 мл/л
MS 3,4 2,6 1,9 1,2 2,3
MS 1/2 3,6 2,9 3,2 1,6 2,8
QL 4,2 3,5 4,3 1,5 3,4
QL 1/2 3,6 3,6 3,0 1,4 2,9
Среднее 3,7 3,1 3,1 1,4 -
НСР05 фактор А = 1,52; фактор B = 1,61; общ. = 1,89
4. Суммарная длина микропобегов актинидии коломикта in vitro в зависимости от состава питательной среды и концентрации регуляторов роста, см
Питательная среда Концентрация цитокинина, мг/л
6-БАП 2-iP среднее
0,5 1,0 0,5 1,0
Без ростостимулирующих препаратов
MS 9,3 13,0 2,0 3,1 6,9
MS 1/2 7,5 10,9 1,8 2,2 5,6
QL 12,6 19,5 2,1 3,0 9,3
QL 1/2 7,7 13,2 2,4 2,4 6,4
Среднее 9,3 14,2 2,1 2,7 -
НСР05 фактор А = 2,87; фактор B = 2,32; общ. = 2,56
С добавкой HB-101, 0,1 мл/л
MS 12,9 17,9 2,3 3,6 9,2
MS 1/2 10,1 21,5 7,7 5,9 11,3
QL 26,0 28,4 8,2 6,2 17,2
QL 1/2 16,9 24,8 9,3 4,5 13,9
Среднее 16,5 23,2 6,9 5,1 -
НСР05 фактор А = 2,17; фактор B = 2,11; общ. = 2,06
Суммарная длина побегов актинидии коломикта in vitro не имела статистически значимых различий в зависимости от состава питательной среды и варьировала в среднем от 6,4 до 9,3 см. Повышение в питательной среде концентрации цитокинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л способствовало существенному увеличению суммарной длины побегов актинидии коломикта в среднем в 1,5 раза. При аналогичном повышении концентрации цитокинина 2-iP статистически значимых различий не установлено (табл. 4). С добавлением в питательную среду препарата HB-101 в концентрации 0,1 мл/л значения суммарной длины микропобегов актинидии in vitro были в среднем в 1,6 - 3,3 раза больше, чем в вариантах без использования ростостимулирующих веществ.
Выводы
1. При клональном микроразмножении актинидии коломикта на этапе введения в культуру in vitro наиболее эффективными стерилизующими агентами оказались препараты Лизоформин 3000, 5%-ный, и Экостерилизатор бесхлорный, 5%-ный, при времени стерилизации 15 мин.
2. Количество, средняя и суммарная длина побегов актинидии коломикта in vitro не имели статистически значимых различий в зависимости от состава исследуемых питательных сред.
3. Повышение концентрации в питательной среде цитокинина 6-БАП от 0,5 до 1,0 мг/л способствовало существенному увеличению суммарной длины побегов актинидии коломикта in vitro, тогда как при аналогичном повышении концентрации цитокинина 2-iP значимых различий не отмечено.
4. Добавление в питательную среду экологически безопасного ростостимулирующего препарата HB-101, 0,1 мл/л, способствует значительному увеличению длины микропобегов актинидии коломикта in vitro.
Список источников
1. Ермаков Б.С. Лесные растения в вашем саду. М.: Лесная промышленность, 1987. 150 с.
2. Климович В.И., Климович И.В. Размножение и выращивание декоративных древесных пород. М.: Россельхозиздат, 1987. 110 с.
3. Колбасина Э.И. Актинидии и лимонник в России (биология, интродукция, селекция). М.: Россельхозака-демия, 2000. 264 с.
4. Козак Н.В. Интродукция и особенности технологии поддержания коллекции редких плодовых лиан - актинидии и лимонника китайского в Московской области // Плодоводство и ягодоводство России. 2012. Т. XXXIV. С. 341 - 347.
5. Кулагина В.Л., Евдокименко С.Н. Малораспространённые плодовые культуры для средней полосы России: учеб.-методич. пособ. Брянск: Изд-во Брянской ГСХА, 2012. 52 с.
6. Воробьев Д.П. Дикорастущие деревья и кустарники Дальнего Востока. Л.: Наука, Ленингр. отд-ние, 1968. 276 с.
7. Прогунков В.В. Медоносы юга Дальнего Востока // Пчеловодство. 1987. № 12. С. 13 - 14.
8. Плеханова М.Н. Актинидия, лимонник, жимолость. Л.: Агропромиздат, Ленингр. отд-ние, 1990. 87 с.
9. Зориков П.С. Основные лекарственные растения Приморского края: учеб. пособие. Владивосток: Даль-наука, 2004. 129 с.
10. Барнаулов О.Д., Поспелова М.Л. Лекарственные свойства фруктов и ягод. СПб.: Информ-Навигатор, 2013. 256 с.
11. Дорошенко Т.Н., Рязанова Л.Г. Биологические основы размножения плодовых растений: учеб. пособ. Краснодар: КубГАУ, 2015. 136 с.
12. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-Пресс, 1999. 160 с.
13. Сельскохозяйственная биотехнология: учеб. / В.С. Шевелуха и др. М.: Высшая школа, 2008. 416 с.
14. Kovac J. Micropropagation of Actinidia kolomikta. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993; 35: 301-303.
15. Liu Y.L., Masuda K., Harada T. Plantlet Regeneration, Organ Formation and Somatic Embryogenesis From In Vitro-cultured Root Tissue of Actinidia kolomikta.
Journal of the Japanese Society for Horticultural Science. 1998; 67(5): 734-738.
16. Туть Е.А., Упадышев М.Т, Особенности микроразмножения актинидии и лимонника китайского // Сельскохозяйственная биология. 2008. № 3. С. 96 - 101.
17. Шорников Д.Г. Разработка метода клонального размножения лимонника и актинидии // Плодоводство и ягодоводство России. 2008. Т. 18. С. 428 - 434.
18. Плаксина Т.В., Бородулина И.Д. Влияние регуляторов роста на клональное микроразмножение представителей рода Актинидия. Acta Biologica Sibirica. 2016; 3(2): 54-60. https://doi.org/10.14258/abs.v2i3.1455
19. Калашникова Е.А. Клеточная инженерия растений: учеб. и практикум для вузов. М.: Юрайт, 2020. 333 с.
20. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Phisiol. Plantarum. 1962; 15(3): 473-497.
21. Quoirin M., Lepoivre P. Improved Media for In Vitro Culture of Prunus species. Acta Horticulturae. 1977; 78: 437-442.
References
1. Ermakov B.S. Forest Plants in Your Garden. M.: Timber Industry, 1987. 150 p.
2. Klimovich V.I., Klimovich I.V. Reproduction and Cultivation of Decorative Tree Species. M.: Rosselkhoziz-dat, 1987. 110 p.
3. Kolbasina E.I. Actinidia and Schisandra in Russia (Biology, Iintroduction, Selection). M.: Russian Agricultural Academy, 2000. 264 p.
4. Kozak N.V. Introduction and Features of the Technology for Maintaining the Collection of Rare Fruit Vines - Actinidia and Schisandra chinensis in the Moscow Region. Pomiculture and small fruits culture in Russia. 2012; XXXIV: 341-347.
5. Kulagina V.L., Evdokimenko S.N. Rare Fruit Crops for Central Russia: textbook. Bryansk: Bryansk State Agricultural Academy Publ., 2012. 52 p.
6. Vorobyov D.P. Wild Trees and Shrubs of the Far East. Leningrad: Science, Leningrad. Department, 1968. 276 p.
7. Progunkov V.V. Honey Plants of the South of the Far East. Pchelovodstvo. 1987; 12: 13-14.
8. Plekhanova M.N. Actinidia, Schisandra, Honeysuckle. L.: Agropromizdat, Leningrad Department, 1990. 87 p.
9. Zorikov P.S. The Main Medicinal Plants of Primor-sky Krai: textbook. Vladivostok: Dalnauka, 2004. 129 p.
10. Barnaulov O.D., Pospelov M.L. Medicinal Properties of Fruits and Berries. St. Petersburg: Inform-Navigator, 2013. 256 p.
11. Doroshenko T.N., Ryazanov L.G. Biological Bases of Reproduction of Fruit Plants: textbook. Krasnodar: Kuban State Agrarian University, 2015. 136 p.
12. Butenko R.G. Biology of Cells of Higher Plants In Vitro and Biotechnologies Based on Them. Moscow: FBK-Press, 1999. 160 p.
13. Agricultural Biotechnology: textbook / V.S. Shev-elukha et al. M.: Vysshaya shkola, 2008. 416 p.
14. Kovac J. Micropropagation of Actinidia kolomikta. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1993; 35: 301-303.
15. Liu Y.L., Masuda K., Harada T. Plantlet Regeneration, Organ Formation and Somatic Embryogenesis from In Vitro-cultured Root Tissue of Actinidia kolomikta. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science. 1998; 67 (5): 734-738.
16. Tut E.A., Upadyshev M.T. Peculiarities of Micropropagation of Actinidia and Schisandra chinensis. Agricultural Biology. 2008; 3: 96-101.
17. Shornikov D.G. Development of Clonal Propagation Method of Schisandra and Actinidia. Pomiculture and small fruits culture in Russia. 2008; 18: 428-434.
18. Plaksina T.V., Borodulina I.D. Influence of Growth Regulators on Clonal Micropropagation of Representatives of the Genus Actinidia. Acta Biologica Sibirica. 2016; 2 (3): 54-60. https://doi.org/10.14258/abs.v2i3.1455.
19. Kalashnikova E.A. Cellular Engineering of Plants: textbook. M.: Yurayt, 2020. 333 p.
20. Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Cultures. Phisiol. plantarum. 1962; 15(3): 473-497.
21. Quoirin M., Lepoivre P. Improved Media for In Vitro Culture of Prunus species. Acta Horticulturae. 1977; 78: 437-442.
Сергей Сергеевич Макаров, доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, makarov_serg44@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0564-8888
Ирина Борисовна Кузнецова, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, sonneraiser@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-5011-3271
Андрей Николаевич Кульчицкий, магистрант, 5060637@mail.ru
Елена Ивановна Куликова, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, elena-kulikova@list.ru, https://orcid.org/0000-0002-5981-2609
Sergey S. Makarov, Doctor of Agriculture, Senior Researcher, makarov_serg44@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0564-8888
Irina B. Kuznetsova, Candidate of Agriculture, Associate Professor, sonneraiser@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-5011-3271
Andrey N. Kulchitsky, Master's degree student, 5060637@mail.ru
Elena I. Kulikova, Candidate of Agriculture, Associate Professor, elena-kulikova@list.ru, https://orcid.org/0000-0002-5981-2609
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 07.09.2022; одобрена после рецензирования 19.09.2022; принята к публикации 31.10.2022.
The article was submitted 07.09.2022; approved after reviewing 19.09.2022; accepted for publication 31.10.2022. -♦-
