CC BY
17© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Я.Н.Фролова1, Г.Г.Харсеева1, В.Н.Герасимов2, С.А.Котов2, И.А.Дятлов2
ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ БИОПЛЕНОК, ФОРМИРУЕМЫХ ШТАММАМИ mRYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GRAVIS tox+
Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону; 2ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Московская обл.
Цель. Изучение структуры однородных микробных сообществ штаммов Corynebacte-rium diphtheriae gravis tox+ при формировании биопленок in vitro. Материалы и методы. Объект исследования — типовая и биопленочная культуры музейного и циркулирующего штаммов С. diphtheriaе gravis tox+. Интенсивность биопленкообразования оценивали, измеряя ОП на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм, исследуя 120 и 720-часовую культуры. Для СЭМ использовали сканирующий электронный микроскоп S-450 (Hitachi, Япония). Результаты. Пик образования экзополисахаридного матрикса (ЭПС), который образуется в процессе биопленкообразования, музейным штаммом приходился на более ранние сроки культивирования (120 час), чем циркулирующим (720 час). При анализе изменений размеров бактериальных клеток музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae при формировании биопленки была установлена их обратная корреляция с интенсивностью образования ЭПС. При максимальном содержании ЭПС, которое приходилось на разные сроки культивирования для двух исследованных штаммов возбудителя дифтерии, наблюдали уменьшение размеров клеток коринебактерий. Заключение. Бактериальные биопленки музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae и закономерности динамики образования ЭПС отражают, вероятно, адаптивные возможности возбудителя, обусловливающие его конкурентоспособность в борьбе за сайты адгезии, устойчивость к факторам естественного иммунитета и, как результат, длительную перси-стенцию в организме бактерионосителей.
Журн. микробиол., 2015, № 2, С. 55—59
Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriae, типовая и биопленочная культуры, сканирующая микроскопия, экзополисаридный матрикс
Ya.N.Frolova1, G.G.Kharseeva1, V.N.Gerasimov2, S.A.Kotov2, I.A.Dyatlov2
FEATURES OF BIOFILM MORPHOLOGY, FORMED BY CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GRAVIS tox+ STRAINS
1Rostov State Medical University, Rostov-on-Don; 2State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russia
Aim. Study the structure of homogenous microbial communities of Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ strains during formation ofbiofilms in vitro. Materials and methods. Object of study — typical and biofilm cultures ofС. diphtheriaеgravis tox+ museum and circulating strains. Intensity of biofilm formation was evaluated by OD on microplate reader at 540 nm wave length studying 120 and 720 hour cultures. S-450 (Hitachi, Japan) scanning electron microscope was used. Results. The peak of exopolysaccharide matrix (EPS) formation, that is formed in the process of biofilm formation, by museum strain takes place at earlier terms of cultivation (120 hours) than circulating (720 hours). An inverse correlation was established during analysis ofbacterial cells of museum and circulating strains of C. diphtheriae during biofilm formation between them and intensity of EPS formation. At maximum EPS content, that took place at various terms of cultivation of the 2 studied strains of diphtheria causative agent, a reduction of corynebacteria cells was observed. Conclusion. Bacterial biofilms of museum and circulating strains of C. diphtheriae and patterns of dynamics of EPS reflect, probably, adaptive abilities of the causative agent, that determine its competitiveness in the fight for adhesion sites, resistance to factors of natural immunity and as a result — prolonged persistence in the organism of bacterial carriers.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 2, P. 55-59
Key words: Corynebacterium diphtheriae, typical and biofilm cultures, scanning microscopy, ex-opolysaccharide matrix
В настоящее время заболеваемость дифтерией как в России, так и за рубежом почти не регистрируется. Однако, в условиях проведения вакцинации дифтерийным анатоксином искоренить бактерионосительство невозможно, и циркуляция возбудителя среди населения сохраняется [2, 3]. Известно, что направленные на борьбу с возбудителем дифтерии антибактериальные препараты не всегда эффективны при проведении санации бактерионосителей, что может быть связано со способностью возбудителя формировать биопленки [1]. Многие заболевания, вызываемые бактериями, сопровождаются формированием в организме хозяина биопленок микроба-возбудителя данной патологии [4, 5].
Бактериальные биопленки представляют собой сложные микробные сообщества, сформированные множественными слоями бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и друг к другу, покрытых экзополисахаридом (ЭПС). Внутри ЭПС осуществляются коммуникационные взаимодействия клеток, в том числе, и при участии генетически детерминированного регуляторного механизма «Quorum Sensing» [9]. В биопленке, по сравнению с планктонными культурами бактерий, иначе протекают физиологические процессы, связанные с продукцией метаболитов и биологически активных веществ, что способствует усилению их защиты от воздействия антибиотиков, факторов врожденного и адаптивного иммунитета. Возникновение у бактерий подобных поведенческих особенностей является одним из факторов, способствующих развитию хронических инфекционных заболеваний у человека [5, 6].
Изучение процессов биопленкообразования у C. diphtheriae с помощью электронной сканирующей микроскопии, проводимой in situ, позволяет оценить структурно-функциональные характеристики биопленок, в том числе, клеточные структуры, участвующие в их образовании. Знание структуры биопленочных сообществ возбудителя дифтерии может дать информацию о возможных способах его защиты от внешних факторов и роли процессов биопленкообразования в длительной персистен-ции C. diphtheriae в организме бактерионосителей.
Целью настоящей работы явилось изучение структуры однородных микробных сообществ штаммов C. diphtheriae gravis tox+ при формировании биопленок in vitro.
Были использованы штаммы: C. diphtheriae gravis tox+ № 665, полученный из ГИСК им. Л.А.Тарасевича, и C. diphtheriae gravis tox+, выделенный от больного с диагнозом «локализованная форма дифтерии» бактериологической лабораторией ЦГСЭН Ростова-на-Дону.
Культивирование штаммов дифтерийных бактерий осуществляли в стеклянных пробирках, содержащих по 3 мл 20% сывороточного бульона. Тестирование штаммов на способность формировать биопленки проводили по методике P. R. Watnick [11]. Интенсивность биопленкообразования штаммов возбудителя дифтерии оценивали, измеряя оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм. Для исследования использовали 120- и 720-часовую биопленочные культуры исследованных штаммов C. diphtheriae gravis tox+.
При проведении сканирующей электронной микроскопии приготовление препаратов осуществляли путем погружения в среду культивирования нержавеющей подложки для поверхностной адгезии бактериальных клеток, формирующих биопленку. Образцы биопленочной культуры токсигенных штаммов C. diphtheriaе gravis tox+ № 665 и C. diphtheriaе gravis tox+ (циркулирующий), адгезированные к подложке, подвергали химической фиксации. Микробные клетки обрабатывали 4% раствором глутарового альдегида и 40% раствором формальдегида, фиксировали в течение 24
часов при комнатной температуре. Образцы биопленочных культур C. diphtheriae после фиксации дегидратировали. Дегидратацию образцов проводили в охлажденных до +4°С водных растворах этилового спирта возрастающей концентрации для предотвращения экстракции различных компонентов клеток (30% — 15 мин; 50% — 15 мин; 70% — 15 мин; 96% — 15 мин; 100% — 15 мин) и в 100% ацетоне (двукратно по 10 минут). Затем образцы биопленок высушивали на воздухе.
Обезвоженные образцы биопленки помещали на предметный столик сканирующего электронного микроскопа и напыляли золотом в напылительной вакуумной установке EicoIB-3 ion coater («Eico», Япония) при ионном токе 6 — 8 мА. Полученные образцы исследовали в сканирующем электронном микроскопе S-450 («Hitachi», Япония) при ускоряющем напряжении 30 кВ.
Динамика образования ЭПС при культивировании музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae имела общие закономерности. Так, с начала образования ЭПС (48 час культивирования) уровень ОП был минимальным и составил для музейного штамма C. diphtheriae № 665 — 0,233, для циркулирующего — 0,062. Затем к 120 часу культивирования интенсивность образования ЭПС у музейного штамма достигла максимума, составив 0,630, и значительно увеличилась у циркулирующего штамма C. diphtheriae (ОП — 0,290). К 168 часу роста наблюдали резкое снижение значений ОП у двух исследованных штаммов (0,395 — у музейного и 0,209 — у циркулирующего штамма). Далее происходило постепенное нарастание уровня ОП, которое достигло к 720 часу у музейного штамма значений 0,524, у циркулирующего — 0,481.
При сравнении процесса образования ЭПС музейным и циркулирующим штаммами C. diphtheriae gravis tox+ были выявлены и некоторые отличия. Так, интенсивность образования ЭПС музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ была выше (диапазон колебаний ОП находился в пределах от 0,233 до 0,630), чем циркулирующим (ОП — от 0,062 до 0,481). Причем, наиболее четко это прослеживалось с 48 часа по 456 час культивирования. Между показателями интенсивности образования ЭПС двумя исследованными штаммами максимальные различия (0,340) были обнаружены на 120 час культивирования, минимальные (0,043) — на 720 час. Обращает на себя внимание тот факт, что для пик образования ЭПС музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ № 665 приходился на ранние сроки (120 час культивирования), циркулирующим — на значительно более поздние (720 час культивирования).
Электронно-микроскопическое исследование препаратов биопленок возбудителя дифтерии проводили на 120 и 720 часы культивирования, что соответствовало пикам формирования ЭПС музейным и циркулирующим штаммами C. diphtheriae gravis tox+ при длительном их культивировании in vitro. Использование сканирующей микроскопии позволило получить изображения, отражающие особенности морфологии биопленочных культур дифтерийных бактерий. Образованные возбудителем дифтерии биопленки представляли собой погруженные в экзополисахаридный ма-трикс конгломераты клеток, которые варьировали по плотности, создавая открытые области, являющиеся, вероятно, водными каналами. Экзополисахарид имел вид множества слизистых, соединяющихся между собой тяжей паутины, которые покрывали микробные клетки общим слоем.
Известно, что размеры микробных клеток типовой культуры C. diphtheriae варьируют в пределах 0,3 — 0,8х1,5 — 8,0 мкм [1, 7]. При анализе их возможных изменений у биопленочных культур музейного и циркулирующего штаммов C. diph-theriae было установлено, что на пиках формирования ЭПС на 120 и 720 часы культивирования ширина микробных клеток не изменялась и находилась в диапазоне от 0,4±0,03 мкм до 0,7+0,1 мкм, тогда как длина клеток имела достоверные отличия. На пике образования ЭПС (120 час) длина микробных клеток музейного штамма C. diphtheriae gravis tox+ № 665 составляла 1,4+0,08 мкм. При более длительных сроках культивирования данного штамма (720 час) содержание ЭПС было меньше, однако длина клеток была достоверно (р<0,05) больше и составила 1,7+0,1 мкм.
При исследовании размеров клеток циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+ была обнаружена аналогичная закономерность: при максимальном количестве ЭПС, который у данного штамма приходился на 720 час культивирования, длина клеток была меньше (1,3±0,05 мкм), чем на более раннем этапе (120 час) биоплен-кообразования (1,6±0,05 мкм).
Как известно, процесс формирования биопленки сопровождается образованием экзополисахаридного матрикса — продукта жизнедеятельности самих микробных клеток [9, 10]. Микробные клетки как музейного, так и циркулирующего штаммов C. diphtheriae gravis tox+ в процессе биопленкообразования обладали разобщенным во времени процессом формирования ЭПС, что сопровождалось изменением их размеров и пространственной организации.
Пик образования ЭПС музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ приходился на более ранние сроки культивирования (120 час), чем циркулирующим (720 час). При анализе изменений размеров бактериальных клеток музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae при формировании биопленки была установлена их обратная корреляция с интенсивностью образования ЭПС. При максимальном содержании ЭПС, которое приходилось на разные сроки культивирования для двух исследованных штаммов возбудителя дифтерии, наблюдали уменьшение размеров клеток корине-бактерий. Это могло быть связано с тем, что клетки в составе биопленки растут значительно медленнее, чем планктонные, в результате чего происходит замедление метаболических процессов, приводящее к диссоциации R-формы колоний в S-форму, за счет чего биопленки оказываются более стабильными, чем планктонные формы клеток [6, 8]. Такие состояния бактерий могут запускать механизмы адаптации, а именно, устойчивости к антибиотикам [6]. При этом создаются условиях для длительной персистенции возбудителя дифтерии в организме бактерионосителей, что осложняет проводимую антибиотикотерапию.
Проведенная электронно-сканирующая микроскопия показала, что бактериальные клетки музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae в составе биопленки представляли собой палочки с хорошо видными зернами волютина, располагавшиеся хаотично и собранные в плотно сцепленные кластеры, между которыми находилось свободное пространство, формирующее, вероятно, водные каналы. Экзополисахаридный матрикс в виде «тяжей паутины» покрывал микробные клетки общим слоем.
Выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфологические особенности бактериальных биопленок музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae и закономерности динамики образования ЭПС отражали, вероятно, особые адаптивные возможности возбудителя, обусловливающие его конкурентоспособность в борьбе за сайты адгезии, устойчивость к факторам естественного иммунитета и, как результат, длительную персистенцию в организме бактерионосителей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дифтерия: микробиологические и иммунологические аспекты. Под ред. Г.Г.Харсеевой. М., Практическая медицина, 2014.
2. Иванова В. В., Родионова О. В., Корженевская Т. Б. Бактерионосительство токсигенных коринебактерий дифтерии на эпидемическом спаде заболеваемости дифтерией. Рос. мед. журн. 2003 (5): 38-41.
3. Костюкова H. Н., Гукасян Л. А. Патогенез дифтерийного бактерионосительства в иммунологическом аспекте. Журн. гиг., эпидемиол., микробиол., иммунол. 1977, 21 (4): 394-398.
4. Смирнова Т.А., Диденко Л.В., Азизбекян Р.Р. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок. Микробиология. 2010, 79 (4): 432-446.
5. Li Chen, Yu-mei Wen. The role of bacterial biofilm in persistent infections and control strategies. Int. J. Oral Sci. 2011, 3 (2): 66-73.
6. Burnolle M., Webb J. S., Rao D. Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in multispecies biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72: 3916-3923.
7. Burkovski A. Cell envelope of Corynebacteriaе Structure and influence on pathogenicity. J. Microbiology, 2013: 1-11.
8. Black C.E., Costerton J.W. Current concepts regarding the effect of wound microbial ecology and biofilms on wound healing. Surg. Clin. North. Am. 2010, 90: 1147-1160.
9. Hall-Stoodley L. Envolving conceptsin biofilm infections. Cell. Microbiol. 2009, 11 (7): 10341043.
10. Lewis K. Multidrug tolerance of biofilms and persistercells. Heidelberg, Springer Verlag, 2008.
11. Watnick P. R. Biofilm city of microbes. J. Bacteriol. 2000, 182 (10): 2675-2679.
Поступила 10.09.14
Контактная информация: Фролова Яна Николаевна,
344022, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29, р.т. (863)250-41-09
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
О.В.Островская1, Г.Н.Холодок1, Н.М.Ивахнишина1, Н.В.Морозова4, Т.Н.Каравянская3, Е.М.Голубева3, В.И.Резник2, Л.В.Савосина2, Л.А.Лебедева2, Е.Н.Присяжнюк2, В.К.Козлов1,4
МОНИТОРИНГ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГРИППА И ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ, ГОСПИТАЛИЗИРОВАННЫХ С ВНЕБОЛЬНИЧНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ В ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ СЕЗОН 2012 - 2013 ГГ.
1НИИ охраны материнства и детства, Хабаровск, 2Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае, 3Управление Роспотребнадзора по Хабаровскому краю, ^Дальневосточный государственный медицинский университет, Хабаровск
Цель. Изучение циркуляции респираторных вирусов у детей с внебольничной пневмонией (ВП) в период с октября 2012 по май 2013 гг. Материалы и методы. Обследованы 136 детей с ВП в возрасте от 3 месяцев до 16 лет с симптомами ОРЗ в дебюте заболевания. В мазках из носоглотки выявляли РНК/ДНК вирусов гриппа А, В, парагриппа (ПГ), аде-но-, рино-, РС-вирусов, корона-, метапневмо- (МПВ) и бокавирусов методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в реальном времени. В парных сыворотках крови методом РТГА определяли антитела к вирусам гриппа А/НШ1/рёш09 Калифорния/07/09, эпидемическим эталонным штаммам вирусов гриппа А/НШ1/ Брисбен/59/07, А/Н3Ш/Виктория/361/2011, В/Висконсия/1/10, к вирусам ПГ 1, 2, 3 типов. Результаты. В феврале—марте 2013 г. снизилось число детей, защищенных антителами к вирусам гриппа, и выявлена циркуляция вирусов гриппа А/Н3№/ и А/НШ1/ рёш09. Риновирусы и вирусы ПГ определяли в течение всего эпидемического сезона, бокавирус и аденовирусы — в осеннее-зимний период, РС-вирус и МПВ — в зимне— весенний. Коронавирус не выявляли. Пик детекции вирусов установлен в феврале, когда был превышен порог заболеваемости гриппом и ОРЗ. Основными патогенами детей первых 3 лет жизни являются риновирусы, РС-вирус, вирусы ПГ и бокавирус. РС-вирусная инфекция в дебюте ВП у детей до 3 лет в 55,5% случаев ассоциируется с развитием бронхо-обструктивного синдрома. Инфекция бокавирусом в 50% случаев протекает с ларинго-трахеитом и бронхиолитом. Заключение. Доля вирусов в этиологической структуре ОРЗ у детей варьирует в зависимости от иммунной прослойки, сезона и возраста детей. Этиология вирусной инфекции в дебюте заболевания ВП может быть доказана только специальными лабораторными исследованиями.
Журн. микробиол., 2015, № 2, С. 59—65
Ключевые слова: респираторные вирусы, дети, внебольничные пневмонии, ПЦР
