CC BY
67
4. Есипова И.К., Кауфман О.Я., Крючкова Г.С. Очерки по гемодинамической перестройке сосудистой стенки. — М., 1971.
5.Зубов Н.А., Кауфман О.Я. Сборник научных работ Тюменского НИИ краевой инфекционной патологии. -Тюмень, 1965. -С.13-17.
6. Кауфман О.Я. Гипертрофия и регенерация гладких мышц. -М., 1979.
7. Куликов С.В. // Ангиол. и сосуд. хир. -2004. -№3. -С.36-37.
8. Медведев В.Н., Курмаев Ш.М., Харитонов Г.И.// Казанский мед. ж. - 2001.- №3.- С. 161-164.
9. Шмырева Т.А. // Арх. патол. -1966. - №.8. -С.33-37.
10. Шорманов И.С. // Бюл. экспер. биол. -2004. -№ 3. -С.332-375.
11. Шорманов И.С. // Морфология. - 2004. -№ 1. -С. 40-44.
12. Шорманов СВ., Яльцев А.В. // Арх. патол. -1996. - №1. -С.37-41.
13. Шорманов С.В., Куликов С.В.// Морфология.- 2001.- №4.-С. 25-29.
14. Boneva R.S., Botto L.D., Moore S.A. // Circulation.- 2001.-Vol.103. - P. 2376-2381.
15. Imig J.D., Anderson G.L. // Hypertension. -1991. -Vol.17. -P.317-322.
16. Kreuser W., Sykes В., Schenk W.G. // Vasa. -1973. - Vol.2. - P.51-57.
17. Shormanov S.V. // Cor Vasa. -1979. -Vol.21. -P.I 17-123.
Поступила 23.05.06.
MORPHOLOGY OF DECOMPENSATION OF HAEMOCIRCULATION IN LIVER DURING PULMONARY TRUNK STENOSIS
S.V. Kulikov
S u m m a r y
Model of pulmonary trunk stenosis was used on 25 dogs. Structural changes of liver were studied on 9 dogs with circulatory decompensation and 10 control dogs. It was found that decompensation of pulmonary trunk stenosis lead to relaxation of efferent and deferent liver vessels, decreased the number and degree of adaptation processes. In arterial basin of liver increased the sclerotic processes. Chronic venous plethora occurred as a result of all these changes.
УДК 616. 248 - 07 : 616. 155. 32
ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
М.М.Д. Нсангу, А. С. Водунон, З.И. Абрамова, В.Н. Цибулькина, А.В. Лунцов
Лаборатория биохимии нуклеиновых кислот (зав. - докт. биол. наук З.И. Абрамова), кафедра клинической иммунологии с аллергологией (зав.- проф. В.Н. Цибулькина) Казанского государственного медицинского университета
Одной из важнейших популяций клеток крови, опосредующих аллергическое воспаление в дыхательных путях, являются лимфоциты. Их численность регулируется не только активностью хемотаксинов и других гуморальных факторов, но и таким важным явлением, как апоптоз. Эта форма программируемой гибели клеток характеризуется специфической морфологической динамикой и является одним из механизмов контроля гомеостаза лимфоцитов [6, 8]. Нарушение механизмов апоптоза, с одной стороны, затрудняет своевременную элиминацию воспалительных клеток, и в таком случае их численность в воспалительном инфильтрате возрастает, а с другой - в зоне персистирующего воспаления могут оказаться аутореактивные лимфоциты, активация которых приводит к развитию аутоиммунной патологии. В последнем варианте достаточно реальной становится перспектива тяжелого течения астмы.
Целью данной работы являлось изучение количественной и морфологической характеристики лимфоцитов периферической кро-
ви у больных атопической бронхиальной астмой (АБА) различной тяжести.
Диагноз АБА ставился на основании данных аллергического анамнеза, результатов кожных проб с бытовыми, эпидермальнымии, пыльцевыми аллергенами, провокационных назальных и ингаляционных тестов. Одновременно проводилось стандартное исследование периферической крови (общий анализ с определением лейкоцитарной формулы). Объектом изучения служили лимфоциты, выделенные из периферической крови 15 здоровых доноров и 66 больных АБА (мужчины/женщины: 41/25; возраст ± 8Б:31±15). Группу больных АБА составили лица с различной тяжестью заболевания: 17 - с интермиттирующим течением (мужчины/женщины:13/4; возраст ± ББ: 22±6), 17 - с легким персистирующим течением (12/5; 29±14), 15 - со средней тяжестью заболевания (8/7; 32±14) и 17 - с тяжелым персистирующим течением (8/9; 42±18), не получавших на момент взятия крови кортикостероиды и находившихся на стационар-
Изменения элементов лейкоцитарной формулы в зависимости от тяжести АБА
Интермиттирующая, клеток/мкл ±m (%) Персистирующая, клеток/мкл + m (%)
Степень тяжести легкая средняя тяжелая N*, % р
Клетки лимфоциты 1746,6+244,5 (28,8) 1947,8+1558 (37,8) 1837,8+165,4 (25,4) 1588,8+127,1 (17,3) (25-40) i 0,05
нейтрофилы 3572,6+785,9 (61,9) 32139+432,1 (52,4) 3266,9+424,7 (65) 5057,3+1770 (74,6) (45-65) т 0,04
моноциты 359,4±15,8 (5,9) 299,4±8,9 (4,5) 274,6+8,2 (6,5) 495,6+19,8 (5,8) (6-8) i 0,03
эозинофилы 215,8±6,5 (3,7) 281,2+5,6 (5,4) 429,8+25,8 (4,8) 211,9+6,4 (4,3) (2-4) т 0,26
Примечание: N* - элементы лейкоцитарной формулы (в %) у здорового человека.
ном лечении в пульмонологическом отделении РКБ МЗ РТ г. Казани.
Лимфоциты из периферической крови выделяли методом равновесного центрифугирования (3000 об/мин, К-24) в растворе фиколл-верографина ( р=1,077 г/см). Забор 5 мл крови осуществляли путем венопункции кубитальной вены. Кровь помещали в пробирки (Vacutainer, Becton-dickinsson, США), содержащие антикоагулянт Na2 гепарин. Образец крови с антикоагулянтом разводили в растворе Хенкса в равных соотношениях (4 мл крови + 4 мл раствора Хенкса) и наслаивали на 4 мл градиента плотности фиколл-верографина. Центрифугировали в течение 40 минут в бакет-роторе при 3000 об/мин при +4°С. Суспензию лимфоцитов собирали и промывали центрифугированием с ускорением 2000 об / мин в течение 10 минут при 20°С. Рабочая концентрация лимфоцитов в среде-199 содержала 2 106 клеток в 1 мл.
Для изучения структуры лимфицитов методом трансмиссионной электронной микроскопии клетки последовательно фиксировали в 2,5%-ом глутаровом альдегиде на
0,1М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) и 1%-ом растворе OsO4 в течение одного часа. Затем дважды промывали в ФСБ и обезвоживали в градиенте этилового спирта (25-100%, 5 мин каждый). Образцы заключали в Эпон-812 ("Serva", Германия). Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), контрастировали 2,5% раствором уранилацетата в метаноле 10 минут и 1-2 минуты в цитрате свинца. Срезы анализировали на электронном микроскопе Hitachi HU-125E (Япония).
Математический анализ полученных результатов проводился на персональном компьютере с использованием пакета программ "Excel (Microsoft office 2003)". Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса и T-критерия Манна-Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли по методу Фишера. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спир-мена-^ [3].
Число лейкоцитов в крови у здоровых доноров составило 6,3х109/л, что согласуется с данными литературы [7], при АБА-6,18х109, причем пониженное содержание лейкоцитов было связано с уменьшением количества лимфоцитов и моноцитов (количество лимфоцитов при АБА - 27,3%, в норме - 30% от общего числа лейкоцитов; количество моноцитов при АБА - 5,7%, в норме -6,6%). Содержание нейтрофилов и эозино-филов у больных с АБА было незначительно выше, чем у здоровых доноров (при АБА нейтрофилов - 63,5%, в норме - 59%; эози-нофилов при АБА - 4,6%, в норме - 2,5%).
В результате были установлены особенности в изменении количества форменных элементов крови в зависимости от тяжести АБА (см. табл.).
Математический анализ данных результатов показал, что в трех из четырех параметров (лимфоциты, моноциты и нейтрофи-лы) динамика форменных элементов крови в зависимости от тяжести АБА достоверна: для лимфоцитов р=0,05, моноцитов р = 0,03, нейтрофилов р=0,04, эозинофилов р=0,26.
При изучении взаимосвязи содержания лимфоцитов в зависимости от тяжести заболевания установлено, что показатели количества лимфоцитов у больных с интермит-тирующим течением астмы характеризуются большим разбросом значений (2,5-й перцентиль = 712; 97,5-й перцентиль = 3508,8). При переходе от интермиттирующего к легкому персистирующему течению количество лимфоцитов увеличивается (Ме =1760;
т интер. ’
Мелет = 2005; р = 0,13). При развитии заболевания с персистирующим течением число лимфоцитов по мере нарастания тяжести уменьшается (Ме =2005; Ме =1855;
лег. ’ сред. ’
Ме =1610). Различия в количестве лим-
тяж.
фоцитов между легкой и тяжелой АБА с персистирующими вариантами течения достоверны (р = 0,05). Содержание лимфоцитов в периферической крови больных АБА тяжелой персистирующей степени был на 30-50% ниже нормы (17,3% против 24-35% в норме по лейкоцитарной формуле).
4000 3000 2000 -1000 -
Ж
п = 49 г = -0,3 R2=0,0734 p = 0,04
* легкое среднее тяжелое
Персистирующее течение АБА
Рис. 1. Обратная корреляция между количеством лимфоцитов в периферической крови и тяжестью течения АБА.
Как следует из рис. 2, выявлены изменения в морфологии клеток больных с АБА (2б, в) по сравнению с контролем (здоровые клетки -2 а), по-видимому, обусловленные апоптозом. Клетки лимфатического узла здоровых лиц обычно имеют небольшой размер, характеризуются относительно крупным, округлым ядром, с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. Лимфоциты в периферической крови здоровых доноров относительно правильной формы. Ядра чаще округлой формы с небольшими инвагинациями располагаются центрально, в них заметны ядрышки, локализация хроматина - периферическая, кариоплазма электронно-свет-
Т?'
ВИС
Рис.2. Ультраструктура морфологических изменений лимфоцитов, обнаруженных в периферической крови здоровых доноров (а) и больных с АБА (б — интермиттирующая, в — тяжелая персиструющая стадии). Представлены типичные результаты одного из 7 экспериментов: б — морфологические признаки ранних стадий апоптоза в лимфоцитах, характеризующиеся неровностями ядра и появлением выпячиваний на поверхности клетки и ядра; в — признаки поздней стадии апоптоза, характеризующейся фрагментацией ядер и образованием блеббингов. а — 11600, б — 11000, в — 10900.
С помощью методов корреляционного анализа было установлено (рис.1), что у больных АБА прослеживается обратная корреляция между количеством лимфоцитов и тяжестью заболевания (г = -0,3, р=0,04).
Связан ли данный факт с апоптозом или с действием цитотоксических Т-лимфоцитов, которые могут уничтожать другие субпопуляции Т-клеток? Чтобы ответить на данный вопрос, мы изучили ультраструктуру лимфоцитов на разных стадиях заболевания.
лая. Все мембранные структуры клетки целостны и хорошо прорисованы, митохондрии правильной формы с хорошо заметными кристами. Чаще всего скопления митохондрий наблюдаются медиально, недалеко от ядра. В клетках имеется гладкий и шероховатый эндоплазматический ретикулум (ЭПР), в некоторых клетках четко прорисован комплекс Гольджи. Вещество цитоплазмы средней электронной плотности зернистой структуры, в ней заметны секреторные
а
гранулы, электронно-прозрачные и электронно-плотные везикулы.
Лимфоциты у больных АБА с интермит-тирующим течением имеют признаки апо-птотических клеток. Ядра приобретают лопастной вид, далее обычно происходят его коллапс и распад на микроядра. Хотя сама по себе неровность контуров ядра [4] не является специфическим признаком апоптоза и может выявляться при повышенной метаболической активности клетки, тем не менее в отдельных клетках обнаруживается мар-гинация хроматина, сущность которой заключается в концентрации хроматина по периферии ядра в виде полусфер или глыбок [2]. На клеточной поверхности (рис.2 б) появляются вдавливания и выпячивания. В лимфоцитах больных с тяжелым персисти-рующим течением АБА (рис. 2 в) обнаруживаются довольно глубокие вдавления ядерных мембран, происходит фрагментация ядер, фрагменты ядра ограничены мембраной внутри клетки. Среди тонких ультра-структурных сдвигов, характерных для поздних стадий апоптоза, выявляется изменение цитолеммы и поверхностных структур, в первую очередь происходит утрата микроворсинок и десмосом. На отдельных клетках появляются выпячивания и пузыри на мембране (рис.2 в), получившие в англоязычной литературе название блеббингов [5]. Нет четко видимых мембранных структур клетки - митохондрий, ЭПР, однако наблюдается большое количество везикул с электронно-светлым содержимым, мультиламелляр-ные тела, а также гранулы с содержимым средней электронной плотности. Очень часто в цитоплазме таких лимфоцитов имеются электронно-светлые крупные вакуоли. Но целостность мембран самих лимфоцитов не нарушена. Следует отметить, что большинство изученных образцов лимфоцитов больных с тяжелым персистирующим течением АБА имело подобную морфологию.
Таким образом, среди исследованных образцов было обнаружено довольно много клеток с признаками поздней стадии апо-птоза, но не распавшихся на апоптотические тельца, что может быть свидетельством нарушения биохимического (нуклеазного) состава лимфоцитов.
Нами были изучены белковые фракции, выделенные из ядер лимфоцитов здоровых доноров и больных АБА. В этих фракциях обнаружены Са2+,М^2+- и Мп2+-зависимые ДНКазные активности. Результаты изучения характера действия этих ДНКаз на плаз-мидную ДНК рБИ322 выявили падение Ca2+,Mg2+-зависимой ДНКазной активности при тяжелой персистирующей форме АБА
и повышение Мп2+-зависимой ДНКазной активности, которая не способна к межнук-леосомной деградации ДНК [1]. В связи с недостаточностью информации и неоднозначностью имеющихся литературных сведений по этому вопросу наша дальнейшая работа будет посвящена результатам изучения нуклеазного состава лимфоцитов больных астмой, которые характеризуются устойчивостью к апоптозу.
ВЫВОДЫ
1. Установлена обратная корреляция между тяжестью заболевания и количеством лимфоцитов (г = -0,3; p = 0,04).
2. Методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлены морфологические различия в структуре лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных АБА.
3. В лимфоцитах больных АБА возрастает активность Мп2+-зависимой ДНКазы и подавляется активность Ca2+, Mg2+-зависимой ДНКазы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абрамова З.И., Нсангу М.М.Д., Винтер В.Г. // Ученые записки Казанского государственного университета. - Казань, 2006.-Том 148.-Кн. 1. -С.123-137.
2. Белушкина Н.Н., Северин С.Е.//Архив пат.-
2001.-№1.-С.51-60.
3. Лакин Г. Ф. Биометрия.- М, 1990.-С.352.
4. Манских В.Н. // Бюлл. Сибир. мед.-2004.-№1.-С.63-70.
5. Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н.// Вопр. онкол.-
2002.-№2.-С.159-171.
6. Cohen J.J., Duke R.S., Fadok V.A., Sellins K.S. // Annu. Rev. Immunol.-1992.-Vol.10.-P.267-293.
7. Kogg J. C., Doerschux C. M. // Anni. Rev. Physiol.-1995. -V.57. -Р.97-114.
8. Leonardo M.J., Boehme S., Chen L. et al. // Int. Rev. Immunol.-1995.-Vol.13.-P.115-134.
Поступила 03.11.06.
PECULIARITIES OF MORPHOLOGICAL INDEXES AND QUANTITY EVALUATION OF PERIPHERAL LYMPHOCYTES INPATIENTS WITH ATOPIC BRONCHIAL ASTHMA M.M.D. Nsangu, A.C. Vodunon, Z.I. Abramova, V.N. Tsibulkina, A.V. Luntsov
S u m m a г y
Quantity and morphological analysis of peripheral blood lymphocytes was carried out in 66 patients with different degree of atopic bronchial asthma and 15 healthy volunteers. The result of electron-microscopy analysis showed significant differences in morphology of lymphocytes of healthy donors and that of patients with intermittent and severe persistent atopic bronchial asthma. Lymphocytes of patients with intermittent atopic bronchial asthma had features similar to that of apoptotic cells, while in patients with severe persistent asthma disorder of apoptotic processes was established which believed is due to abnormalities of biochemical composition of lymphocytes.
