Научная статья УДК 637.13
DOI: 10.52653/РР1.2022.2.2.007
Особенности молекулярно-массового фракционирования молока, полученного от коров с полиморфизмом гена СБЫЗ
Александр Геннадьевич Кручинин1, Екатерина Ивановна Большакова2
'' 2ВНИИ молочной промышленности, Москва a_kruchinin@vnimi.org
Аннотация. Исследованы закономерности изменения физико-химических свойств обезжиренного молока, полученного из молока от коров черно-пестрой породы с генотипами АА, АВ, ВВ по гену CSN3 после концентрирования путем нанофильтрации с применением полиэфирсульфоновых мембран. В ходе исследования выявлено, что при изменении фактора концентрирования с 1 до 2,5 во всех образцах продолжительность процесса нанофильтрации изменяется незначительно, удельная производительность мембраны снижается при достижении фактора концентрирования 1,75, а динамика концентрирования сухих веществ в ретентатах образцов CSN3АА, CSN3АВ и CSN3ВВ является схожей. Сохранение сухих веществ по окончании процесса фильтрации в опытном образце CSN3АА оказалось несколько ниже (92 %), чем в образцах CSN3АВ (95 %), CSN3ВВ (94 %). Значимых различий в концентрировании отдельных компонентов (белков, лактозы, минеральных веществ) не наблюдалось. В процессе нанофильтрации с увеличением фактора концентрирования активная кислотность изменяется незначительно (на 0,10-0,14) в ретентатах всех образцов в сравнении с концентрируемым сырьем; титруемая кислотность повышается на 7-8 °Т. Проведена сравнительная оценка размеров белковых частиц ретентатов нанофильтрации и ультрафильтрации, которая позволила установить возможное конформационное изменение белковой микроструктуры по уменьшению среднего диаметра белковых частиц при ультрафильтрации на 1-2 нм (CSN3АА и CSN3АВ) и на 3-4 нм (CSN3ВВ), чего при нанофильтрации обнаружено не было.
Ключевые слова: к-казеин, ген, полиморфизм, нанофильтрация, ретентат, пермеат, размер частиц
Для цитирования: Кручинин А. Г., Большакова Е. И. Особенности молекулярно-массового фракционирования молока, полученного от коров с полиморфизмом гена CSN3 // Пищевая промышленность. 2022. № 2. С. 32-35.
Original article
Peculiarities of molecular weight fractionation of milk obtained from cows with CSN3 gene polymorphism
Alexander G. Kruchinin1, Ekaterina I. Bolshakova2
'' 2All-Russian Dairy Research Institute, Moscow a_kruchinin@vnimi.org
Abstract. This paper describes the regularities of changes in physicochemical properties of skimmed milk produced from milk of black-and-white breed cows with genotypes AA, AB, BB of the CSN3 gene in the process of nanofiltration using polyethersulfone membranes. Some studies have observed the dependence of various technological features of milk on the genotype of milk cows of the CSN3 gene, in particular the A and B alleles of the individuals' genome, that's why milk from cows with previously mentioned genotypes was chosen as the study object. It was found that the duration of the nanofiltration process changed insignificantly in all samples on change the concentration factor from 1 to 2.5; the specific membrane productivity decreased at the concentration factor of 1.75 and the dynamics of milk solids' concentration in the retentates of CSN3A, CSN3AB and CSN3B samples was similar. Retention of solids in the CSN3AA test sample at the end of the filtration process was slightly lower (92 %) than in the CSN3AB (95 %) and CSN3BB (94 %) samples and significant differences in the concentration of individual components (proteins, lactose and minerals) weren't observed. With the increase of the concentration factor during nanofiltration, the active acidity changes insignificantly (by 0.10-0.14) in the retentates of all samples compared to the raw material; the titratable acidity increases by 7-8 °T. The protein particles' size of nanofiltration and ultrafiltration retentates was assessed; thereby a possible conformational change in protein microstructure was established by decreasing the average diameter of protein particles in the process of ultrafiltration by 1-2 nm (CSN3AA and CSN3AB) and by 3-4 nm (CSN3BB), which wasn't detected in the process of nanofiltration.
Keywords: k-casein, gene, polymorphism, nanofiltration, retentate, permeate, particle size
For citation: Kruchinin A. G., Bolshakova E. I. Peculiarities of molecular weight fractionation of milk obtained from cows with CSN3 gene polymorphism // Food processing industry. 2022;(1):32-35 (In Russ.).
Автор, ответственный за переписку: Александр Геннадьевич Кручинин, a_kruchinin@vnimi.org Corresponding author: Alexander G. Kruchinin, a_kruchinin@vnimi.org
© Кручинин А. Г., Большакова Е. И., 2022 32 2/2022 ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ISSN 0235-2486
Введение. Тенденции в оптимизации производственных процессов переработки сельскохозяйственного сырья, в частности молока, предопределяются закономерностями процесса формирования качества готовых продуктов. Выход на новый уровень качества пищевой продукции априори достигается внедрением в производство высокоэффективных технологий, применение которых, в свою очередь, предполагает набор определенных свойств у сырья [1]. В связи с этим выявление взаимосвязей между качественными характеристиками сырьевой базы и технологическими факторами ее хранения и переработки, а также привлечение современных аналитических методов и инновационных наукоемких решений является важной задачей для пищевой промышленности.
Влияние различных факторов генотипи-ческого, паратипического и технологического характера на состав сырого молока является причиной значимых различий в показателях готовой продукции. Проблема стандартизации показателей пищевых продуктов из молока-сырья с разным химическим составом остается актуальной до сих пор, и одним из эффективных способов ее решения в технологическом аспекте является нормализация сырого молока по составным компонентам, в том числе посредством мембранного фракционирования.
С 70-х годов прошлого столетия наблюдается устойчивый рост успешного использования мембран в молочной промышленности. Первично их применение в основном было связано с концентрированием молока в производстве сыра и/или выделением белков из сыворотки [2, 3]. В настоящее время круг возможностей использования микрофильтрации, ультрафильтрации (УФ), нанофильтрации (НФ) и обратного осмоса в сфере переработки молочного сырья стал намного шире: «холодная» стерилизация, нормализация молочного сырья, переработка вторичного сырья и выделение из него веществ с высокой биологической активностью, получение белковых ретентатов с заданным содержанием технологически важных веществ и минорных компонентов, отделение бактериальной массы от культураль-ной жидкости, полученной в процессе производства заквасок, и т. д. [3].
Помимо интенсивного развития пищевых технологий возрастает популярность применения нетрадиционных для пищевой промышленности методов оценки качества. Для идентификации принадлежности составляющих компонентов продукции, определения ее бактериальной обсемененности, обнаружения и количественного определения аллергенных продуктов питания и т. д. активно используют методы молекулярно-генетического анализа [4-6]. В вопросе направленного регулирования влияния генотипического фак-
тора пищевого сырья на технологические решения и качество готовой продукции в настоящее время актуально применение ПЦР-диагностики. Анализируя частный случай полиморфизма гена CSN3, следует отметить, что существует устойчивая взаимосвязь определенных его аллельных форм с термостабильностью и способностью к коагуляции белков молока.
симбиоз применяемых современных методов анализа и технологий позволяет расширить понимание кинетики процессов переработки сырья, изменения его свойств и факторов, влияющих на эффективность использования технических возможностей для дальнейшей корректировки и оптимизации производства пищевых продуктов. В связи с этим цель данной работы заключалась в исследовании закономерностей изменений физико-химического состава молочного сырья, полученного из молока коров с генотипами АА, АВ и ВВ по гену CSN3 в процессе молекулярно-массового фракционирования путем нФ.
Объекты и методы исследований.
Объектом исследований являлось обезжиренное молоко, полученное из молока от коров черно-пестрой породы с гомозиготными АА и ВВ (образцы СБШАА и СБШВВ соответственно) и гетерозиготными АВ (образец С5Ы3АВ) генотипами по гену CSN3. Подготовка сырого молока включала в себя подогрев до температуры 40...45 °С и сепарирование на лабораторном сепараторе-сливкоотделителе MilkyDay FJ 90 РР (Австрия). Остаточная массовая доля жира в обезжиренном молоке составляла не более 0,05 %. Пастеризация обезжиренного молока осуществлялась на вискубаторе Petrotest DP (Германия) при температуре 74±2 °С с выдержкой 15-20 с и последующим охлаждением до температуры 15-18 °С. Концентриро-
вание охлажденного молока проводилось при температуре 15.20 °с на пилотной установке AL 362 (Россия) с блоком полиэфирсульфонных мембранных элементов, с порогом задержки 0,6 кДа (1,22 нм). Объемный фактор процесса концентрирования (Фк) - 2,5. Контролем служило обезжиренное молоко, полученное из молока коров с генотипами АА, АВ, ВВ по гену CSN3. Размер белковых частиц определяли с использованием лазерного дифракционного анализатора Весктап LS 13 320 XR (США). Пробоподготовка для анализа размера частиц включала предварительное обезжиривание образцов гексаном с последующим его удалением путем центрифугирования (5 мин при 3500 мин-1) и дополнительной двойной промывкой теплой деионизированной водой (60 °С) с повторным центрифугированием при том же режиме.
Результаты и их обсуждение. На
первом этапе исследования были установлены закономерности процесса НФ обезжиренного молока, полученного из молока коров с различными генотипами по гену CSN3 (рис. 1).
Анализ кинетики изменения удельной производительности в процессе НФ образцов обезжиренного молока CSN3АА и CSN3АВ показал отсутствие между образцами значимых различий, как в изменении динамики, так и в продолжительности фильтрации. Противоположная картина наблюдалась при исследовании закономерностей процесса УФ образцов обезжиренного молока CSN3АА и CSN3ВВ, представленная в работе [7]. Авторами отмечено, что скорость УФ при работе с молоком-сырьем коров с генотипами АА и ВВ по гену CSN3 различается, а именно снижается на 5-6 % в первом случае по причине более активного загрязнения мембранных элементов,
20 18 16
14
10
6
2
CD
0 1,00
1,25
Рис.
1,50 1,75 2,00 2,25
Фактор концентрирования
<^N3 АА-^ CSN3 АВ-^ CSN3 ВВ-^ '. Закономерности процесса НФ обезжиренного молока
2,50
12
8
4
Исследование закономерностей изменения физико-химических показателей ретентата и пермеата в процессе НФ-обработки
образцов обезжиренного молока СБШАА, СБШАВ и СБШВВ
Наименование показателя Титруемая кислотность, °Т Aктивная кислотность, рН Массовая доля жира, % Массовая доля белка, % Массовая доля казеиновых белков, % Массовая доля сывороточных белков, % Массовая доля лактозы, % Массовая доля золы, % Массовая доля сухих веществ, %
Контроль 16,5 6,85 0,06 3,31 2,66 0,67 4,89 0,74 9,24
ФК 1,5 17,5 6,82 0,09 4,93 3,95 0,98 7,22 0,97 13,42
Ретентат ФК 2,0 19,1 6,74 0,12 6,51 5,21 1,30 9,49 1,19 17,47
CSN3AA ФК 2,5 23,5 6,71 0,15 8,2 6,58 1,62 11,53 1,34 21,25
ФК 1,5 2,0 7,03 0,00 0,00 0,00 0,00 0,23 0,14 0,67
Пермеат ФК 2,0 2,5 7,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,29 0,22 0,73
ФК 2,5 3,3 6,94 0,00 0,00 0,00 0,00 0,31 0,32 0,75
Контроль 16,0 6,86 0,10 3,20 2,53 0,67 5,03 0,72 9,21
ФК 1,5 16,5 6,85 0,15 4,71 3,72 0,99 7,31 1,01 13,42
Ретентат ФК 2,0 18,6 6,77 0,20 6,31 4,98 1,33 9,65 1,21 17,65
CSN3AВ ФК 2,5 23,4 6,73 0,24 8,12 6,41 1,71 11,91 1,38 21,85
ФК 1,5 2,1 7,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,25 0,16 0,69
Пермеат ФК 2,0 2,9 6,96 0,00 0,00 0,00 0,00 0,30 0,24 0,75
ФК 2,5 3,6 6,91 0,00 0,00 0,00 0,00 0,34 0,29 0,80
Контроль 17,0 6,85 0,12 3,44 2,79 0,65 5,12 0,76 9,55
ФК 1,5 18,5 6,83 0,18 5,12 4,15 0,97 7,45 1,06 13,97
Ретентат ФК 2,0 23,6 6,78 0,23 6,73 5,45 1,28 9,84 1,27 18,31
ФК 2,5 25,0 6,76 0,29 8,47 6,86 1,61 12,03 1,42 22,43
ФК 1,5 1,8 7,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,26 0,17 0,71
Пермеат ФК 2,0 3,3 6,93 0,00 0,00 0,00 0,00 0,31 0,19 0,79
ФК 2,5 4,3 6,88 0,00 0,00 0,00 0,00 0,35 0,26 0,83
поскольку на их поверхности образуется концентрационно-поляризационный слой.
Сравнительная оценка условий проведения процесса НФ образцов обезжиренного молока CSN3AA и CSN3AB с CSN3BB позволила выявить снижение производительности, обусловленное различием массовой доли сухих веществ в исходных концентрируемых системах. По достижении Фк = 1,75 разница в удельной производительности нивелировалась, что свидетельствует об образовании органического мембранного слоя, не смываемого тангенциальным потоком, вследствие необратимого повышения массовой доли белка и сухих веществ в ретентатах.
На втором этапе работы для понимания процесса НФ был исследован основной физико-химический состав ретентата и пермеата (см. таблицу).
Данные, представленные в табл. 1, свидетельствуют о схожей динамике концентрирования белка и сухих веществ в образцах обезжиренного молока CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB в процессе НФ. По окончании процесса концентрирования сохранение сухих веществ в ретентатах образцов CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB находилось в диапазоне 92-95 %. В образце CSN3AA массовая доля сухих веществ ниже (92 %), чем в CSN3AB (95 %) и CSN3BB (94 %).
Кроме того, отмечено закономерное отсутствие белка в пермеатах всех образцов, что свидетельствует о 100 %-ной селективности используемых мембран по
отношению к белку. При этом селективность по лактозе составляла 94 %.
В процессе НФ с увеличением фактора концентрирования зафиксированы незначительные изменения активной кислотности (на 0,10-0,14) в ретентатах всех образцов в сравнении с концентрируемым сырьем и повышение титруемой кислотности на 7-8 °Т. Также следует отметить, что селективность по лактозе составила 94 %, по белку - 100 %. В ретентатах образцов обезжиренного молока CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB сохранилось 72, 77 и 75 % минеральных веществ соответственно.
В процессе УФ и НФ, как правило, происходят изменения в минеральном составе, который, в свою очередь, может влиять на размер казеиновых мицелл и их стабильность.
Для выявления зависимости между генотипической принадлежностью молока и изменением состояния белковых микроструктур, в частности агрегации белковых частиц и нарушения целостности мицелл казеина в процессе баромембран-ной обработки, было проведено определение среднего размера частиц.
Вследствие обезжиривания образцов при помощи сепарирования и отмывки их гексаном были получены репрезентативные данные, позволяющие посредством
РЮБ (технологии дифференциальной интенсивности рассеянного поляризованного света) и лазерной дифракции сравнить средние диаметры белковых частиц исследуемых образцов, полученных с помощью УФ и НФ (рис. 2).
Анализ данных рис. 2 позволил выявить и подтвердить закономерности, полученные в результате исследований [8, 9], в соответствии с которыми образец обезжиренного молока СБЫЗАА имел примерно сопоставимый средний размер белковых частиц (139-145 нм) в сравнении с образцом СБЫЗАВ (141-143 нм) и незначительно больший размер, чем в образце СБЫ3ВВ (134-137 нм). При этом вид баромембранной обработки оказы-
155
5
х. i:; £ ;
! Ж №
УФ НФ
Способы концентрирования
" CSN3AA (Ретентат) - CSN3AB (Ретентат) CSN3BB (Ретентат) CSN3AA (Контроль) CSN3AB (Контроль) nCSN3BB (Контроль)
Рис. 2. Исследование среднего размера частиц в молоке, полученном от коров с генотипами АА, АВ и ВВ по гену CSN3 в зависимости от способов концентрирования
34 2/2022 ПИЩEВAЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ISSN 0235-2486
вал существенное воздействие на размер белковых частиц. Так, средний диаметр частиц в ретентате при НФ практически не изменился по отношению к контрольным образцам обезжиренного молока как для CSN3AA, CSN3AB, так и для CSN3BB. В результате концентрирования УФ средний диаметр белковых частиц в ретентате незначительно уменьшился по сравнению с обезжиренным молоком на 1-2 нм (CSN3AAи CSN3AB) и на 3-4 нм (CSN3BB). Это может свидетельствовать о возможном частичном разрушении или конфор-мационном изменении белковых матриц.
Заключение. Данные, полученные в результате концентрирования белка, лактозы и минеральных веществ путем НФ в образцах ретентатов CSN3AA, CSN3AB и CSN3BB, практически не отличались. Aнализ размера частиц в концентрируемом сырье и ретентатах CSN3AA, CSN3AB, CSN3BB позволил получить сведения о различном влиянии баромембранной обработки (НФ и УФ) на микроструктуру белка с учетом полиморфизма гена CSN3. Таким образом, для процесса НФ отсутствует значимое влияние генетических факторов, связанных с изменением размеров белковых частиц в получаемых ретентатах, их физико-химического состава и удельной производительности мембран. Незначительные различия в физико-химических показателях пер-меатов попадают в зону погрешности методов измерений.
Список источников
1. Галстян А. Г., Аксенова Л. М., Лисицын А. Б. и др. Современные подходы к хранению и эффективной переработке сельскохозяйственной продукции для получения высококачественных пищевых продуктов // Вестник Российской академии наук. 2019. Т. 89. № 5. С. 539-542. DOI: 10.31857/S0869-5873895539-542.
2. Pouliot Yu. Membrane processes in dairy technology - From a simple idea to worldwide panacea // International Dairy Journal. 2008. Vol. 18. Issue 7. P. 735-740. DOI: 10.1016/j. idairyj.2008.03.005.
3. Белякова З. Ю., Макеева И. А., Донская Г. А. и др. Инновационные технологии обогащения молочной продукции (теория и практика). Москва: Франтера, 2016. 396 с. ISBN 9785940091318.
4. Юрова Е. А., Жижин Н. А., Фильчакова С. А. Применение молекулярно-генетических методов анализа для идентификации видовой принадлежности сырьевого состава пищевой продукции // Вестник МГТУ. Труды Мурманского государственного технического университета. 2020. Т. 23. № 3. С. 214-223. DOI: 10.21443/1560-9278-2020-23-3-214-223.
5. Kang T. S. Basic principles for developing real-time PCR methods used in food analysis: a review // Trends in Food Science & Technology. 2019. Vol. 91. P. 574-585. DOI: 10.1016/j. tifs.2019.07.037.
6. Medici D., Dario & Kuchta T. & Knutsson Rickard & Angelov Angel & Auricchio B. & Barbanera M. & Diaz-Amigo, Carmen & Fiore A. & Kudirkiene, Egle & Hohl A. & Horvatek, Danijela & Gotcheva, Velitchka & Popping Bert & Prukner-Radovcic, Estella & Scaramaglia S. & Siekel Peter & To Kim & Wagner M. Rapid Methods for Quality Assurance of Foods: the Next Decade with Polymerase Chain Reaction (PCR)-Based Food Monitoring // Food Analytical Methods. 2014. Vol. 8. No. 2. P. 255-271. DOI: 10.1007/s12161-014-9915-6.
7. Кручинин А. Г., Илларионова Е. Е., Туровская С. Н., Бигаева А. В. Особенности ультрафильтрации молока, полученного от коров с полиморфизмом CSN3 // Пищевая промышленность. 2021. № 8. С. 33-35. DOI: 10.52653/PPI.2021.8.8.008.
8. Frederiksen P. D., Andersen K. K., Hammershоj M., Poulsen H. D., Sоrensen J., Bakman M., Qvist K. B., Larsen L. B. Composition and effect of blending of noncoagulating, poorly coagulating, and well-coagulating bovine milk from individual Danish Holstein cows // Journal of Dairy Science. 2011. Vol. 94. Issue 10. P. 4787-4799. DOI: 10.3168/ jds.2011-4343.
9. Bijl E., de Vries R., van Valenberg H., Huppertz T., van Hooijdonk T. Factors influencing casein micelle size in milk of individual cows: Genetic variants and glycosylation of к-casein. // International Dairy Journal. 2014. Vol. 34. Issue 1. P. 135-141. DOI: 10.1016/j. idairyj.2013.08.001.
References
1. Galstyan A. G., Aksenova L. M., Lisi -tsyn A. B. et al. Modern approach to storage and efficient processing of high-quality food products. Vestnik Rossiyskoy akademii nauk = Bulletin of the Russian Academy of Sciences. 2019;89(5):539-542 (In Russ.). DOI: 10.31857 / S0869-5873895539-542.
2. Pouliot Yu. Membrane processes in dairy technology - From a simple idea to worldwide panacea. International Dairy Journal. 2008;18(7):735-740. DOI: 10.1016/j. idairyj.2008.03.005.
3. Belyakova Z. U., Makeyeva I. A., Donskaya G. A. et al. Innovative technologies for enrichment of dairy products (theory and practice). Moscow: Frantera, 2016. 396 p. (In Russ.) ISBN 9785940091318.
4. Yurova E. A., Zhizhin N. A., Fil'chakova S. A. Application of molecular genetic methods of analysis to identify the species composition of food raw materials. Vestnik MGTU. Trudy Murmanskogo gosudarstvennogo tekh-nicheskogo universiteta = MSTU Bulletin. Proceedings of the MSTU. 2020;23(3):214-223 (In Russ.). DOI: 10.21443/1560-9278-2020-23-3214-223.
5. Kang T. S. Basic principles for developing real-time PCR methods used in food analysis: a review. Trends in Food Science & Technology. 2019;91:574-585. DOI: 10.1016/j. tifs.2019.07.037.
6. Medici D., Dario & Kuchta T. & Knutsson Rickard & Angelov Angel & Auricchio B. & Barbanera M. & Diaz-Amigo, Carmen & Fiore A. & Kudirkiene Egle & Hohl A. & Horvatek, Danijela & Gotcheva, Velitchka & Popping Bert & Prukner-Radovcic Estella & Scaramaglia S. & Siekel Peter & To Kim & Wagner M. Rapid Methods for Quality Assurance of Foods: the Next Decade with Polymerase Chain Reaction (PCR)-Based Food Monitoring. Food Analytical Methods. 2014;8(2):255-271. DOI: 10.1007/ s12161-014-9915-6.
7. Kruchinin A. G., Illarionova E. E., Turovskaya S. N., Bigayeva A. V., Peculiarities of ultrafiltration of milk obtained from cows with the CSN3 polymorphism. Pischevaya promysh-lennost' = Food Industry. 2021:(8):33-35 (In Russ.). DOI 10.52653/PPI.2021.8.8.008.
8. Frederiksen P. D., Andersen K. K., Hammershoj M., Poulsen H. D., Sorensen J., Bakman M., Qvist K. B., Larsen L. B. Composition and effect of blending of nonco-agulating, poorly coagulating, and well-coagulating bovine milk from individual Danish Holstein cows. Journal of Dairy Science. 2011;94(10):4787-4799. DOI: 10.3168/ jds.2011-4343.
9. Bijl E., de Vries R., van Valenberg H., Huppertz T., van Hooijdonk T. Factors influencing casein micelle size in milk of individual cows: Genetic variants and glycosylation of K-casein. International Dairy Journal. 2014;34(1):135-141. DOI: 10.1016/j.idairyj.2013.08.001.
Информация об авторах
Кручинин Александр Геннадьевич, канд. техн. наук, Большакова Екатерина Ивановна
ВНИИ молочной промышленности, 115093, Москва, ул. Люсиновская, д. 35, к. 7, a_kruchinin@vnimi.org, e_bo1shakova@vnimi.org
Information about the authors
Alexander G. Kruchinin, Candidate of Technical Sciences, Ekaterina I. Bolshakova
All-Russian Dairy Research Institute, Moscow, 35, bld. 7, Lusinovskaya str., 115093, a_kruchinin@vnimi.org, e_bolshakova@vnimi.org
Статья поступила в редакцию 06.12.2021; одобрена после рецензирования 28.12.2021; принята к публикации 29.12.2021. The article was submitted 06.12.2021; approved after reviewing 28.12.2021; accepted for publication 29.12.2021.