Особенности мобилизации кальция из внутриклеточных депо при капацитации сперматозоидов быков Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

doi: 10.24411/0235-2451-2020-10214 УДК 636.2:612.621

Особенности мобилизации кальция из внутриклеточных депо при капацитации сперматозоидов быков*

В. Ю. ДЕНИСЕНКО, Т. И. КУЗЬМИНА

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал Федерального научного центра животноводства ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста (ВНИИГРЖ), Московское ш., 55а, Санкт-Петербург, 196601, Российская Федерация

Резюме. На сперматозоидах быков исследовали участие протеинкиназ А и С в активации процессов капацитации. Знание внутриклеточных механизмов, связанных с капацитацией, позволит воздействовать на сперматозоиды для улучшения результатов оплодотворения. С использованием ХТЦ-теста, определяющего местоположение флуоресценции хлортетра-циклина в сперматозоидах, изучали их распределение на группы с различным функциональным статусом - некапацити-рованные, капацитированные и акросома-реактивные. Исследовали сперму от трех быков, не менее 200 сперматозоидов в каждой группе. В качестве ингибитора протеинкиназы С использовали соединение Ro 31-8220 (10 нг/мл), ингибитора протеинкиназы А - Н-89 (10 мкМ). Оценивали воздействие на сперматозоиды веществ, стимулирующих выход Са2+ из внутриклеточных депо и способствующих капацитации: дибутирил циклического аденозинмонофосфата (дбцАМФ, 100 мкМ) и гуанозинтрифосфата (ГТФ, 10 мкМ) в присутствии прогестерона (1 мкг/мл). Количество капацитированных сперматозоидов с дбцАМФ + ГТФ в вариантах без ингибитора и с ингибитором протеинкиназы С не имело значимых отличий - 47,3 ± 2,4 и 42,5 ± 1,6 % соответственно. Ингибитор протеинкиназы А существенно снижал число капацитированных сперматозоидов при инкубации с дбцАМФ и ГТФ до 23,1±1,8 %, по сравнению с вариантом без ингибитора. Интенсивность флуоресценции кальция внутриклеточных депо определяли с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклина. В присутствии дбцАМФ + ГТФ в вариантах без ингибитора и с ингибитором протеинкиназы С она не имела значимых отличий - 72,3 ± 1,6 и 70,0 ± 1,9 % соответственно. Ингибитор протеинкиназы А отменял дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов, активированное совместным действием дбцАМФ и ГТФ. Интенсивность флуоресценции хлортетрациклина в присутствии дбцАМФ + ГТФ была значимо выше в варианте с ингибитором протеинкиназы А, чем без ингибитора - 85,0 ± 1,7 и 72,3 ± 1,6 % соответственно. Следовательно, протеинкиназа А увеличивает количество капацит ированных сперматозоидов при совместном действии дбцАМФ и ГТФ.

Ключевые слова: протеинкиназы, капацитация, кальций, внутриклеточные депо, сперматозоиды быков.

Сведения об авторах: В. Ю. Денисенко, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник; Т. И. Кузьмина, доктор

биологических наук, зав. лабораторией (e-mail: prof.kouzmina@mail.ru).

Для цитирования: Денисенко В. Ю., Кузьмина Т. И. Особенности мобилизации кальция из внутриклеточных депо при капацитации сперматозоидов быков // Достижения науки и техники АПК. 2020. Т. 34. № 2. С. 65-68. doi: 10.24411/02352451-2020-10214.

*работа выполнена при финансовой поддержке Минобразования (Госзадание №АААА-А18-118021590132-9).

Features of the mobilization of calcium from intracellular depots during the capacitation of bulls' spermatozoids

V. Yu. Denisenko, T. I. Kuzmina

All-Russian Research Institute of Genetics and Breeding of Farm Animals, branch of Federal Scientific Center of Animal Husbandry -Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, Moskovskoe sh., 55a, Sankt-Peterburg, 196601, Russian Federation

Abstract. We investigated the participation of the protein kinases A and C in the activation of capacitation processes on bulls' spermatozoids. Knowing the intracellular mechanisms associated with capacitation will allow affecting spermatozoids to improve fertilization results. Using the CTC test, which determines the location of chlortetracycline fluorescence in spermatozoid, we studied their distribution into groups with different functional status - uncapacitated, capacitated, and acrosome-reactive. Spermatozoids from three bulls were examined; each group was taken at least 200 spermatozoids. The compound Ro 31-8220 (10 ng/mL) was used as a protein kinase C inhibitor; the compound N-89 (10 umol) was used as a protein kinase A inhibitor. We evaluated how substances, which stimulate the release of Ca2+ from intracellular depots and promote capacitation, influence spermatozoids. These substances included dibutyryl cyclic adenosine monophosphate (dbcAMP, 100 umol) and guanosine triphosphate (GTP, 10 umol) in the presence of progesterone (1 ug/mL). The number of capacitated spermatozoid with dbcAMP + gTp in the variants without inhibitors and with the protein kinase C inhibitor did not have significant differences - (47.3 ± 2.4)% and (42.5 ± 1.6)%, respectively. The protein kinase A inhibitor significantly reduced the number of capacitated spermatozoid cells during incubation with dbcAMP and GTP to (23.1 ± 1.8)%, compared with the version without the inhibitor. The fluorescence intensity of intracellular calcium depots was determined using a chlortetracycline fluorescence probe. In the presence of dbcAMP + GTP in variants without inhibitors and with the protein kinase C inhibitor, it did not differ significantly and amounted to (72.3 ± 1.6)% and (70.0 ± 1.9)%, respectively. The protein kinase A inhibitor cancelled the additional release of Ca2+ from the intracellular spermatozoid depot, activated by the combined action of dbcAMP and GTP. The fluorescence intensity of chlortetracycline in the presence of dbcAMP + GTP was significantly higher in the variant with the protein kinase A inhibitor than in the variant without the inhibitor and amounted to (85.0 ± 1.7)% and (72.3 ± 1.6)%, respectively. Consequently, in the case of combined action of dbcAMP and GTP, protein kinase A increases the number of capacitated spermatozoid.

Keywords: protein kinases; capacitation; calcium; intracellular depots; bull spermatozoids.

Author details: V. Yu. Denisenko, D. Sc. (Biol.), leading research fellow; T. I. Kuzmina, D. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: prof.kouzmina@mail.ru).

For citation: Denisenko VYu, Kuzmina TI. [Features of the mobilization of calcium from intracellular depots during the capacitation of bulls' spermatozoids]. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2020;34(2):65-8. Russian. doi: 10.24411/0235-2451-2020-10214.

Капацитация сперматозоидов (постэякуляци-онное созревание) - важное внутриклеточное событие, предшествующее оплодотворению.

При этом происходят различные физиологические и биохимические изменения, связанные с липидным составом и проницаемостью мембран, внутрикле-

точной концентрацией ионов и фосфорилированием белков [1]. Знание внутриклеточных механизмов, связанных с капацитацией, позволит воздействовать на сперматозоиды для улучшения результатов оплодотворения.

Многие функции спермы, такие как капацитация, подвижность, хемотаксис и оплодотворение связаны с кальцием. Основные органеллы, которые участвуют в хранении кальция в соматических клетках, - эндо-плазматический ретикулум и митохондрии. В сперматозоидах места хранения Ca2+ точно не определены. Наиболее вероятно это акросома и редуцированная ядерная оболочка [2], на которых с помощью имму-ноокрашивания были обнаружены рецепторы к ино-зитолтрифосфату (IP3) [3].

В капацитации регуляторную роль играет фос-форилирование белков протеинкиназой А (цАМФ-зависимая протеинкиназа)[4]. Протеинкиназа С в основном активна во время акросомной реакции. Во время капацитации она активна только на начальной стадии процесса, затем фермент подвергается деградации и дефосфорилированию [5]. Активность фосфатаз при капацитации снижается, так как они могут дефосфорилировать и, таким образом, инак-тивировать белки, необходимые для нормального течения этого процесса [6]. Известно, что ингибиторы протеинкиназ А и С изменяют содержание внутриклеточного кальция в сперматозоидах млекопитающих [7].

Цель работы - с использованием ингибитороного анализа и хлортетрациклинового теста изучить особенности внутриклеточных механизмов капацитации сперматозоидов быков в зависимости от их функционального состояния для моделирования условий, повышающих фертильность мужских гамет.

Условия, материалы и методы. Исследования проводили в 2019 г. Эякулят получали перед работой от трех быков черно-пестрой и айрширской породы. Семенную плазму удаляли центрифугированием при 300g в течение 10 мин в среде Зр-TALP. Среда Бр-TALP содержала 100 мМ NaCl, 3,1 мМ KCl, 25 мМ NaHCO3, 0,3 мМ NaH2PO4, 21,6 мМ Lactate (sodium salt), 0,4 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата и 0,1 % поливинилалкоголя с молекулярной массой 30000...70000 Да [8].

Длительность капацитации сперматозоидов составляла 4 ч при температуре 38,5 0С, влажности 95 %

Таблица 1. Влияние ингибиторов протеинкиназы

и уровне СО2 5 %. Для капацитации использовали среду Sp-TALP, в которую добавляли 6 мг/мл БСА и 0,5 мМ CaCl2 [8].

В экспериментах во время капацитации оценивали влияние на сперматозоиды дибутирил циклического аденозинмонофосфата (дбцАМФ) и гуанозинтри-фосфата (ГТФ) в концентрации 100 и 10 мкМ соответственно. Воздействие этих соединений изучали в присутствии прогестерона в концентрации 1 мкг/мл. Исследовали влияние дбцАМФ и ГТФ, добавленных отдельно и совместно, на изменение концентрации внутриклеточного Ca2+ и количество клеток с различным функциональным статусом в присутствии ингибиторов протеинкиназ А и С. В качестве ингибитора протеинкиназы С использовали соединение Ro 31-8220 в количестве 10 нг/мл, протеинкиназы А - соединение Н-89 в количестве 10 мкМ.

После окончания капацитации из каждого образца брали по 20 мкл суспензии сперматозоидов, добавляли 20 мкл раствора хлортетрациклина, смешивали и инкубировали при 38,5 °С в течение 10 мин. Раствор хлортетрациклина (750 мкМ) готовили в буфере, который содержал 130 мМ NaCl, 5 мМ L-цистеина и 20 мМ Трис. После инкубации для фиксации в смесь добавляли 10 мкл 25 % глутаральдегида в 1мМ Трис до конечной концентрации 0,1 % [9]. После этого сперматозоиды в капле объемом 10 мкл размещали на предметном стекле и смешивали с 10 мкл 0,22 М 1,4-диазобицикло[2.2.2]-октана. Образцы накрывали покровным стеклом и хранили в темноте при 4 °С.

Сперматозоиды в количестве 200 шт. на стекло наблюдали с использованием микроскопа Zeiss с фазовым контрастом и эпифлуоресцентной оптикой (возбуждение при 400.440 нм, излучение при 470 нм). Клетки оценивали на соответствие типу флуоресценции хлортетрациклина [10]: равномерная флуоресценция всей головки - некапацитирован-ные клетки, образец F; отсутствие флуоресценции в постакросомальном районе - капацитированные клетки, образец В; слабая флуоресценция во всей головке, тонкая яркая полоса флуоресценции в экваториальном сегменте - акросома-реактивные клетки, образец AR.

Для измерения концентрации Ca2+ во внутриклеточных депо использовали флуоресцентный зонд хлортетрациклин. Измерение проводили в среде Sp-TALP, вместо поливинилалкоголя добавляли БСА

А и С на капацитацию сперматозоидов быков

Действующее вещество1 Функциональный статус сперматозоидов2 Доля клеток при воздействии ингибиторов3, %

без ингибиторов протеинкиназы А (Н-89, 10 мкМ) протеинкиназы С (Ro 31-8220, 10 нг/мл)

Контроль F 12,2 ± 1,3a 15,4 ± 2,1m 15,5 ± 2,1у

B 27,3 ± 2,9b 21,1 ± 1,5n 24,2 ± 1,4z

AR 60,5 ± 2,6c 63,5 ± 2,0o 60,3 ± 2,9a1

ГТФ, 10 мкМ F 18,1 ± 1,7d 14,7 ± 2,2Р 15,8 ± 2,5b1

B 29,3 ± 2,3e 24,3 ± 1,1q 23,0 ± 1,3c1

AR 52,6 ± 3,5f 61,0 ± 2,5r 61,2 ± 1,8d1

дбцАМФ, F 18,0 ± 1,4g 15,4 ± 2,1s 17,7 ± 2,0e1

100 мкМ B 27,1 ± 2,1h 23,0 ± 0,8» 23,3 ± 0,9f1

AR 54,9 ± 2,5i 61,6 ± 1,6й 59,0 ± 1,7g1

дбцАМФ, F 10,6 ± 1,9 13,6 ± 2,0v 10,0 ± 2,2h1

100 мкМ + ГТФ, 10 B 47,3 ± 2,4k 23,1 ± 1,8w 42,5 ± 1,6й

мкМ AR 42,1 ± 2,1' 63,3 ± 3,7х 47,5 ± 2,8j1

'все клетки в экспериментах обработаны прогестероном, 1 мкг/мл; Г - некапацитированные, В - капацитированные, ЛЯ -акросома-реактивные сперматозоиды быков; 3различия между Ь:к;г:''; с:1; в':}; с'11; б''.}; д^; е:к; Г:к; 1:1; к"мдостоверны при р < 0,001, е1:Ь1; М - при р < 0,05.

в концентрации 1 мг/мл. Хлортетрациклин в сперматозоиды нагружали в течение 30 мин. Концентрация зонда составляла 100 мкМ. Окрашенные зондом клетки отмывали три раза с помощью центрифугирования при 300g в течение 10 мин. Измерение интенсивности флуоресценции кальция внутриклеточных депо проводили на спектрофлуориметре Hitachi. Длины волн возбуждения и излучения для хлортерациклина составляли 380 и 530 нм соответственно. Концентрация сперматозоидов при измерении была равна 1,5 х 106 кл/мл [11].

Эксперименты проводили в 4...5 кратной повтор-ности. Достоверность различия средних значений независимых экспериментов оценивали с помощью f-критерия Стьюдента в пакете программ Sigma Stat.

Результаты и обсуждение. В контроле без ингибиторов протеинкиназ А и С инкубация с ГТФ или дбцАМФ не влияла на соотношение числа некапаци-тированных (F), капацитированных(B) и акросома-реактивных сперматозоидов (AR). Инкубация с ГТФ + дбцАМФ стимулировала в интактных сперматозоидах увеличение числа капацитированных и уменьшение количества акросома-реактивных клеток, по сравнению с их добавлением по отдельности (табл. 1).

Соотношение некапацитированных, капацитированных и акросома-реактивных сперматозоидов в присутствии ингибитора протеинкиназы С или А было сходным во всех изученных случаях.

При инкубации сперматозоидов с ГТФ + дбцАМФ в присутствии ингибитора протеинкиназы С статистически значимо увеличилось число капацитированных сперматозоидов, уменьшилось количество некапацитированных и акросома-реактивных клеток, по сравнению с действием отдельно ГТФ или дбцАМФ. Количество капацитированных сперматозоидов в присутствии дбцАМФ + ГТФ в вариантах без ингибитора и с ингибитором протеинкиназы С не имело значимых отличий.

После обработки ингибитором протеинкиназы А соотношение числа клеток с разным функциональным статусом при воздействии ГТФ или дбцАМФ, по сравнению с их совместным использованием, не изменялось. Количество капацитированных сперматозоидов в присутствии дбцАМФ + ГТФ было значимо больше в варианте без ингибитора, чем с ингибитором протеинкиназы А.

В контроле без ингибиторов использование ГТФ или дбцАМФ освобождало Са2+ из внутриклеточных депо; совместное действие ГТФ и дбцАМФ усиливало этот процесс (табл. 2).

Добавление ГТФ или дбцАМФ в присутствии ингибитора протеинкиназы С статистически значимо стимулировало освобождение Са2+ из внутрикле-

точных депо сперматозоидов быков, по сравнению с вариантом без их использования. Совместное воздействие ГТФ и дбцАМФ способствовало дальнейшему существенному усилению этого процесса, по сравнению с добавлением ГТФ или дбцАМФ по отдельности. Интенсивность флуоресценции хлорте-трациклина в присутствии дбцАМФ + ГТФ в вариантах без ингибитора и с ингибитором протеинкиназы С не имела значимых отличий.

В присутствии ингибитора протеинкиназы А добавленные отдельно ГТФ или дбцАМФ статистически значимо активировали выход Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов, по сравнению с контролем. Совместное действие ГТФ и дбцАМФ в обработанных ингибитором протеинкиназы А клетках не приводило к дополнительному освобождению Са2+ из депо, по сравнению с их добавлением по отдельности. Интенсивность флуоресценции хлортетрациклина в присутствии дбцАМФ + ГТФ была значимо выше в варианте с ингибитором протеинкиназы А, чем без ингибитора.

Ранее на интактных сперматозоидах быков было показано, что протеинкиназа С способствует переходу Са2+ из 1Р3-нечувствительных в 1Р3-чувствительные депо, протеинкиназа А - в обратном направлении [12].

В интактных сперматозоидах быков Са2+ переходил из 1Р3-нечувствительных в 1Р3-чувствительные депо при совместном действии пролактина и ГТФ: про-лактин активировал выход Са2+ из 1Р3-чувствительных, а ГТФ — из 1Р3-нечувствительных депо. В обратном направлении Са2+ переходил при совместном действии дбцАМФ и ГДФ: дбцАМФ освобождал Са2+ из 1Р3-нечувствительных, а ГДФ — из 1Р3-чувствительных внутриклеточных депо [12].

Дополнительное освобождение Са2+ из депо -показатель того, что он перемещается между депо. В присутствии прогестерона дополнительное освобождение Са2+ и, следовательно, переход между депо происходит при совместном действии дбцАМФ и ГТФ, которые активируют его освобождение из внутриклеточных депо одного типа — 1Р3-нечувствительных. Можно предположить, что прогестерон препятствует образованию связи между 1Р3-чувствительными и 1Р3-нечувствительными внутриклеточными депо, а дополнительное освобождение происходит вследствие образования связи между внутриклеточными депо одного типа, в этом случае - 1Р3-нечувствительными.

Протеинкиназа А в присутствии прогестерона также предположительно работает по-другому. Вместо образования связи между различными внутриклеточными депо — 1Р3-чувствительными и 1Р3-нечувствительными, этот фермент объеди-

Таблица 2. Влияние ингибиторов протеинкиназ С и А на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков

Действующее вещество1 Интенсивность флуоресценции хлортетрациклина в сперматозоидах при воздействии ингибиторов2, %

без ингибиторов протеинкиназы А (Н-89, 10 мкМ) протеинкиназы С (Ro 31-8220, 10 нг/мл)

Контроль ГТФ,10 мкМ дбцАМФ, 100 мкМ ГТФ, 10 мкМ + дбцАМФ, 100 мкМ 98,1 ± 2,3a 87,4 ± 1,3b 85,1 ± 1,9е 72,3 ± 1,6d 98,4 ± 2,4е 87,1 ± 1,3f 85,3 ± 1,2g 85,0 ± 1,7h 98,0 ± 3,2' 80,3 ± 3,2j 82,3 ± 1,3k 70,0 ± 1,9'

1все клетки в экспериментах обработаны прогестероном, 1 мкг/мл; 2различия между a:b; a:c; b:d; c:d; e:f; e:g; f:g; i:j; i:k; k:l; d:h достоверны при p < 0,001, j:1 - при p < 0,05.

няет внутриклеточные депо одного типа — IP3- действием дбцАМФ и ГТФ. Интенсивность флуорес-

нечувствительные. ценции хлортетрациклина в присутствии дбцАМФ +

Выводы. Ингибирование протеинкиназы С не ГТФ была значимо выше в варианте с ингибитором

влияло на количество капацитированных сперма- протеинкиназы А, чем без ингибитора - 85,0 ± 1,7 и

тозоидов и дополнительную мобилизацию Са2+ из 72,3 ± 1,6 % соответственно (p < 0,001). внутриклеточных депо, стимулированную совмест- Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо спо-

ным действием ГТФ и дбцАМФ. Интенсивность собствует капацитации. Количество капацитирован-

флуоресценции хлортетрациклина (показатель ных сперматозоидов в присутствии дбцАМФ + ГТФ

освобождения Са2+ из внутриклеточных депо) в при- было значимо больше в варианте без ингибитора,

сутствии дбцАМФ + ГТФ в вариантах без ингибитора чем с ингибитором протеинкиназы А - 47,3 ± 2,4 и

и с ингибитором протеинкиназы С не имела значимых 23,1 ± 1,8 % соответственно (p < 0,001). Следова-

отличий - 72,3 ± 1,6 и 70,0 ± 1,9 % соответственно. тельно, использование протеинкиназы А способ-

Количество капацитированных сперматозоидов в ствует увеличению количества капацитированных

присутствии дбцАМФ + ГТФ в вариантах без инги- сперматозоидов быков при совместном действии

битора и с ингибитором протеинкиназы С не имело дбцАМФ и ГТФ.

значимых отличий - 47,3 ± 2,4 и 42,5 ± 1,6 % соот- Полученные результаты можно применять в тех-

ветственно. нологии экстракорпорального оплодотворения круп-

Ингибитор протеинкиназы А отменял дополни- ного рогатого скота для получения эмбрионов in vitro:

тельное освобождение Са2+ из внутриклеточных вводить в среды для капацитации дбцАМФ и ГТФ с

депо сперматозоидов, активированное совместным целью повышения фертильности мужских гамет.

Литература.

1. Gangwar D. K., Atreja S. K. Signalling events and associated pathways related to the mammalian sperm capacitation // Reprod. Domest. Anim. 2015. Vol. 50. No. 5. Pp. 705-711.

2. Engel K. M., Springsguth C. H., Grunewald S. What happens to the unsuccessful spermatozoa //Androl. 2018. Vol. 6. No. 2. Pp. 1-10.

3. Tomes C. N. The proteins of exocytosis: lessons from the sperm model // Biochem. J. 2015. Vol. 465. No. 3. Pp. 359370.

4. Functional human sperm capacitation requires both bicarbonate-dependent PKA activation and down-regulation of Ser/ Thr phosphatases by Src family kinases / M. A. Battistone, V. G. Da Ros, A. M. Salicioni, et al. // Mol. Hum. Reprod. 2013. Vol. 19. No. 9. Pp. 570-580.

5. Ickowicz D., Finkelstein M., Breitbart H. Mechanism of sperm capacitation and the acrosome reaction: role of protein kinases //Asian J. Androl. 2012. Vol. 14. No. 6. Pp. 816-821.

6. Protein phosphatases decrease their activity during capacitation: a new requirement for this event / J. R. Signorelli, E. S. Diaz, K. Fara, et al. // PLoS ONE. 2013. Vol. 8. No. 12. Pp. e81286.

7. Participation of protein kinases and phosphatases in the progesterone-induced acrosome reaction and calcium influx in human spermatozoa / L. Baron, K. Fara, H. Zapata-Carmona, et al.//Androl. 2016. Vol. 4. No. 6. Pp. 1073-1083.

8. Papaverine-sensitive phosphodiesterase activity is measured in bovine spermatozoa/A. Bergeron, A. Hebert, C. Guillemette, et al.//Androl. 2017. Vol. 5. No. 1. Pp. 169-179.

9. Rodriquez P. C., Satorre M. M., Beconi M. T. Effect of two intracellular calcium modulators on sperm motility and heparin-induced capacitation in cryopreserved bovine spermatozoa//Anim. Reprod. 2012. Vol. 131. No. 3-4. Pp. 135-142.

10. Alm-Kristiansen A. H. In vitro studies of Norwegian Red bovine semen immobilized and cryopreserved in alginate solid gel network// Reprod. Domest. Anim. 2018. Vol. 53. No. 2. Pp. 365-370.

11. Intracellular signaling cascades induced by relaxin in the stimulation of capacitation and acrosome reaction in fresh and frozen-thaved bovine spermatozoa /A.G. Miah, U. Salma, P.B. Holker, et al. //Anim. Reprod. Sci. 2011. Vol. 125. No. 1-4. Pp. 30-41.

12. Денисенко В. Ю., Бойцева Е. Н., Кузьмина Т. И. Освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов Bos taurus в зависимости от их функционального состояния // Цитология. 2015. Т. 57. № 3. С. 233-239.

References

1. Gangwar DK, Atreja SK. Signalling events and associated pathways related to the mammalian sperm capacitation. Reprod. Domest. Anim. 2015;50(5):705-11.

2. Engel KM, Springsguth CH, Grunewald S. What happens to the unsuccessful spermatozoa. Androl. 2018;6(2):1-10.

3. Tomes CN. The proteins of exocytosis: lessons from the sperm model. Biochem. J. 2015;465(3):359-70.

4. Battistone MA, Da Ros VG, Salicioni AM, et al. Functional human sperm capacitation requires both bicarbonate-dependent PKA activation and down-regulation of Ser/Thr phosphatases by Src family kinases. Mol. Hum. Reprod. 2013;19(9):570-80.

5. Ickowicz D, Finkelstein M, Breitbart H. Mechanism of sperm capacitation and the acrosome reaction: role of protein kinases. Asian J. Androl. 2012;14(6):816-21.

6. Signorelli JR, Diaz ES, Fara K, et al. Protein phosphatases decrease their activity during capacitation: a new requirement for this event. PLoS ONE. 2013;8(12):e81286.

7. Baron L, Fara K, Zapata-Carmona H, et al. Participation of protein kinases and phosphatases in the progesterone-induced acrosome reaction and calcium influx in human spermatozoa. Androl. 2016;4(6):1073-83.

8. Bergeron A, Hebert A, Guillemette C, et al. Papaverine-sensitive phosphodiesterase activity is measured in bovine spermatozoa. Androl. 2017;5(1):169-79.

9. Rodriquez PC, Satorre MM, Beconi MT. Effect of two intracellular calcium modulators on sperm motility and heparin-induced capacitation in cryopreserved bovine spermatozoa. Anim. Reprod. 2012;131(3-4):135-42.

10. Alm-Kristiansen AH. In vitro studies of Norwegian Red bovine semen immobilized and cryopreserved in alginate solid gel network. Reprod. Domest. Anim. 2018;53(2):365-70.

11. Miah AG, Salma U, Holker PB, et al. Intracellular signaling cascades induced by relaxin in the stimulation of capacitation and acrosome reaction in fresh and frozen-thaved bovine spermatozoa. Anim. Reprod. Sci. 2011;125(1-4):30-41.

12. Denisenko VYu, Boitseva EN, Kuzmina TI. [The release of Ca2 + from the intracellular depot of Bos Taurus spermatozoa depending on their functional state]. Tsitologiya. 2015;57(3):233-9. Russian.