CC BY
32
УДК 636.2:612.621
Ключевые слова: микротрубочки, микрофиламенты, кальций, сперматозоиды быков
Key words: microtubules, microfilaments, calcium, bull spermatozoa
Денисенко В. Ю., Кузьмина Т. И.
биоиндикация целостности структурных элементов
ЦИТОСКЕЛЕТА СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ
BIOINDICATION OF INTEGRITY OF THE STRUCTURAL ELEMENTS OF BULL SPERMATOZOA CYTOSKELETON
ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства-ВИЖ им. академика Л. К. Эрнста» (ВНИИГРЖ), Адрес: 196600, г. Пушкин, Московское ш., д. 55-а
Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding - branch of Federal Science Center
of Animal Breeding named after L. K. Ernst Address: 196600, Pushkin, Moskovskoe highway, 55-а
Денисенко Виталий Юрьевич, д. б. н., вед. науч. сотрудник. Тел. 8-904-519-36-85. E-mail: [email protected]
Denisenko Vitaliy Y., Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher. Tel. +7 904 519-36-85. E-mail: [email protected] Кузьмина Татьяна Ивановна, д. б. н., проф., зав. лабораторией. Тел. 8-921-392-19-47. E-mail: [email protected]
Kuzmina Tatyana I., Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of Laboratory. Tel. +7 921 392-19-47. E-mail: [email protected]
Аннотация. В статье с использованием ингибиторного анализа и флуоресцентного зонда (хлортетрациклин) идентифицированы особенности флуктуации содержания кальция (Са2+) (выход кальция из внутриклеточных депо) в сперматозоидах быков в зависимости от функционального статуса структурных элементов цитоскелета (интактные или поврежденные). Выявлено, что совместное действие теофиллина и ГДФ стимулировало дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов при наличии интактных микрофиламентов. Инкубация сперматозоидов в присутствии ингибитора полимеризации микротрубочек нокодазола отменяла дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо, стимулированное совместным действием пролактина и ГТФ. Ингибитор полимеризации микрофиламентов цитохалазин Д оказывал негативное воздействие на дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов, стимулированное совместным действием теофиллина и ГДФ. Предложен метод биотестирования структурных элементов цитоскелета, базирующийся на выявленных особенностях кальциевого гомеостаза в сперматозоидах быков после воздействия различных ингибиторов полимеризации элементов цитоскелета.
Summary. The features of fluctuation of calcium content (exit calcium from intracellular stores) in bulls spermatozoa depending on the functional status of structural elements of a cytoskeleton(intact or damaged) were identified in this article with using of the inhibitory analysis and the fluorescent probe (chlortetracycline). It was revealed that joint action of theophylline and GDP stimulated additional release of Са2+ from intracellular stores of spermatozoa in presence of intact microfilaments. The incubation ofspermatozoa in presence of inhibitor ofpolymerization of microtubules nokodazol cancelled an additional exit of Са2+from intracellular stores, stimulated by joint effect ofprolactin and GTP. Inhibitor of polymerization of microfilaments cytochalasin D made negative impact at additional release of Са2+from intracellular stores of spermatozoa stimulated by joint action of theophylline and GDP. Method of biotesting of structural elements of cytoskeleton which is based on the revealed features of calcium homeostasis in bull's spermatozoa after influence of various inhibitors ofpolymerization of elements of cytoskeleton is offered.
Введение
Качество мужских гамет обычно оценивается по следующим показателям: концентрация, подвижность и морфология. Зачастую оплодотворяющая способность нативных и, тем более, замороженных бычьих сперматозоидов, высоко оцененных
по вышеуказанным параметрам, находится на низком уровне [9]. Идентификация механизмов, детерминирующих функционирование клеточных компартментов сперматозоидов, позволит разработать эффективные тесты функционального состояния мужских гамет, в том числе и целост-
ности интрацитоплазматических структур. Известно, что в акросомной части сперматозоидов присутствуют компоненты фос-фоинозитидной сигнальной системы, так, в передней части головки сперматозоидов обнаружена фосфолипаза С, стимулирующая образование инозитолтрифосфата [10]. Эндоплазматический ретикулум является основным внутриклеточным депо кальция. Цитоскелет играет важную роль в регуляции входа внеклеточного кальция, индуцируемого при опустошении внутриклеточных хранилищ путем изменения взаимодействия между их основными молекулярными компонентами. В сперматозоидах актин, являющийся компонентом микро-филаментов, находится в акросоме, экваториальном и постакросомальном районах и в хвосте [6]. При воздействии ингибитора полимеризации микрофиламентов цитоха-лазина Д снижается уровень взаимодействия между эндоплазматическим ретику-лумом и Са2+-проницаемыми каналами [5]. В сперматозоидах быков полимеризация микрофиламентов происходит в процессе капацитации [3]. Ингибирование полимеризации актина при действии цитохала-зина Д снижает способность животных к оплодотворению, что было продемонстрировано на сперматозоидах хряков [4]. В связи с вышеизложенным, цель настоящего исследования - идентификация особенностей флуктуации содержания кальция (выход кальция из внутриклеточных депо) в сперматозоидах быков в зависимости от функционального статуса структурных элементов цитоскелета (интактные или поврежденные).
Материалы и методы
В экспериментах использовали эякулят спермы быков голштинской породы, полученный непосредственно перед работой. От семенной плазмы сперму освобождали центрифугированием при 300 g в течение 10-ти мин в среде ТАЬР. Для отмывания спермы к среде ТАЬР добавляли поливинилалкоголь (молекулярной массой 30000-70000 Да) в концентрации 0,1 %. Процедуру отмывания клеток повторяли два раза.
Измерение Ca2+ во внутриклеточных депо проводили с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклин. При проведении экспериментов этот зонд также обеспечивал вход ГТФ и ГДФ в клетки [1]. Измерение Ca2+ проводили в среде TALP, в которую вместо поливинилалкоголя добавляли бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл. Хлортетрациклин в сперматозоиды нагружали в течение 30-ти мин при температуре 38,5 оС, используемая концентрация зонда составляла 200 мкМ. После окрашивания клетки отмывали с помощью центрифугирования при 300-х g в течение 10-ти мин. Процедуру повторяли трижды. Измерение интенсивности флуоресценции кальция внутриклеточных депо проводили на спектрофлуориметре «Hitachi». Величина длин волн возбуждения и излучения для хлортетрациклина составила 380 и 530 нм, соответственно. Содержание кальция во внутриклеточных депо в сперматозоидах измеряли в условных единицах (усл. ед.) интенсивности флуоресценции комплекса Са2+-хлортетрациклин. Концентрация клеток при измерении составляла 1,5х106 кл/мл.
В работе использовали следующие вещества: инкубационную среду TALP, поливинилалкоголь, хлортетрациклин, бычий сывороточный альбумин, пролактин, теофиллин, ГТФ, ГДФ, ингибитор полимеризации микротрубочек нокодазол, ингибитор полимеризации микрофиламентов цитохалазин Д. Все использованные реагенты - продукты компании Sigma (Sigma-Aldrich, США).
Достоверность различия сравниваемых средних значений для 4-5 независимых экспериментов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований
На рисунке 1 представлены результаты экспериментов по воздействию ингибитора полимеризации микротрубочек на стимулированное пролактином и ГТФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков. Используемая концентрация нокодазола составляла 10 мкМ.
12 3 4 5 6
Рис. 1. Влияние ингибитора полимеризации микротрубочек нокодазола на стимулированное пролактином и ГТФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков. По горизонтали:1 - контрольные клетки; 2 - действие пролактина в концентрации 10 нг/мл; 3-10 мкМ ГТФ; 4 - совместное действие пролактина и ГТФ; 5 - действие нокодазола в концентрации 10 мкМ; 6 - обработка нокодазолом и последующее совместное действие пролактина и ГТФ. По вертикали - интенсивность флуоресценции ХТЦ, усл. ед. Различия достоверны при: Р<0.001 (1 и 2; 1 и 3), Р<0.01 (4 и 6), Р<0.05 (2 и 4; 3 и 4).
Добавление пролактина в концентрации 10 нг/мл или ГТФ в концентрации 10 мкМ стимулировало освобождение Са2+ из внутриклеточных депо. При совместном воздействии пролактина и ГТФ в сперматозоидах отмечали дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо. Инкубация клеток в присутствии нокодазола и последующее совместное действие пролактина и ГТФ приводили к отмене дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточных депо после совместного действия этих двух соединений.
Влияние ингибитора полимеризации ми-крофиламентов цитохалазина Д на стимулированное теофиллином и ГДФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков показано на рисунке 2. Концентрация цитохалазина Д в экспериментах составляла 10 мкМ. Внесение в среду инкубации теофиллина в концентрации 1 мМ или ГДФ в концентрации 50 мкМ активировало освобождение Са2+ из внутриклеточных депо гамет. Совместное действие теофиллина и ГДФ вызывало дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов. Обработка сперматозоидов цитохалазином Д и последующее совместное воздействие те-
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 2. Влияние ингибитора полимеризации микрофиламентов цитохалазина Д на стимулированное теофиллином и ГДФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков. По горизонтали: 1 - контрольные клетки; 2 - действие теофиллина в концентрации 1 мМ; 3-50 мкМ ГДФ; 4 - совместное действие теофил-лина и ГДФ; 5 - действие цитохалазина Д в концентрации 10 мкМ; 6 - обработка цитохалазином Д и последующее совместное действие теофилли-на и ГДФ. По вертикали - интенсивность флуоресценции ХТЦ, усл. ед. Различия достоверны при: Р <0.05 (1 и 2; 1 и 3; 2 и 4; 3 и 4).
офиллина и ГДФ вызывали ингибирование дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточных депо.
Обсуждение результатов
Изучение освобождения Са2+ из внутриклеточных депо в клетках после разрушения цитоскелета показало, что в этих клетках не нарушается связь между активацией агонистом рецептора и стимуляцией фосфолипазы С. На №Н 3Т3 клетках было показано, что деполимеризация микрофиламентов или микротрубочек не оказывает влияние на стимулированное агонистом увеличение уровня инозитол-трифосфата [8]. Предполагается, что после разрушения цитоскелета изменяется пространственная связь между инозитол-трифосфатом и его рецепторами, нарушая таким образом фосфолипаза С-зависимую сигнализацию [7]. Таким образом, разрушение цитоскелета приводит к изменению процесса освобождения Са2+ из внутриклеточных депо клеток. В наших исследованиях дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков при совместном действии пролак-тина и ГТФ отмечалось в присутствии ин-
тактных микротрубочек и отсутствовало при разрушении микротрубочек нокода-золом. Соответственно, дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо при совместном действии теофиллина и ГДФ наблюдали при интактных микрофила-ментах, в случае разрушения микрофила-ментов цитохалазином Д вышеуказанного эффекта не отмечали. Таким образом, при наличии интактных элементов цитоскеле-та (микротрубочек и микрофиламентов) в сперматозоидах наблюдали дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо; при разрушенном цитоскеле-те дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо при совместном действии пролактина и ГТФ, а также теофиллина и ГДФ отсутствовало. Представленный способ биотестирования целостности структурных элементов цитоскелета в сперматозоидах быков, в основе которого -наличие или отсутствию дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточных депо, имеет ряд преимуществ перед другими методами оценки целостности цитоске-лета клетки. Во-первых, способ является прижизненным - оцененные сперматозоиды могут быть использованы в дальнейшем, в частности, при экстракорпоральном оплодотворении в технологии получения эмбрионов коров in vitro, т.к. используемые для биотестирования реагенты адекватны физиологичным для клеток, а воздействие хлортетрациклина, как показали наши ранние исследования, не влияет на жизнеспособность женских гамет [2]. Следует отметить также, что продолжительность процедуры биотестирования достаточно короткая (2 часа). Метод является также перспективным для проверки цитотоксич-ности различных биологически активных веществ, в т.ч. и криопротекторов при замораживании сперматозоидов.
Заключение
При биотестировании целостности элементов цитоскелета в сперматозоидах быков с использованием ингибиторного анализа выявлены следующие особенности кальциевого гомеостазиса:
- при наличии интактных микротрубочек совместное действие пролактина и ГТФ стимулирует дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо сперматозоидов быков, при разрушенных микротрубочках дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо при совместном действии этих соединений отсутствовал;
- при наличии интактных микрофила-ментов фиксировали дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо, стимулированное совместным действием теофиллина и ГДФ, после разрушения микротрубочек дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо при совместном действии теофиллина и ГДФ не наблюдали.
Полученные результаты позволяют предложить прижизненный метод биотестирования структурных элементов цитоскелета, базирующийся на выявленных особенностях кальциевого гомеостаза в сперматозоидах быков после воздействия различных ингибиторов полимеризации элементов ци-тоскелета.
Список литературы
1. Денисенко, В. Ю., Кузьмина, Т. И. Комплекс для доставки веществ в клетки. Патент на изобретение RUS 2421226 32.12.2009.
2. Кузьмина, Т. И., Малышев, А. Ю. Гипераккумуляция мембрансвязанного Са2+ в ооцитах коров во время экспансии и разрушения ооцит-кумулюсного комплекса [Текст] / Т. И. Кузьмина, А. Ю. Малышев // Материалы научн. конф. - СПб, 1991. - С. 3-7.
3. Brener, E., Rubinstein, S., Cohen. G.. Remodeling of the actin cytoskeleton during mammalian sperm capacitation and acrosome reaction [Текст] / E. Brener, S. Rubinstein, G. Cohen [et al.] // Biol. Reprod. - 2003. -V. 68. - P. 837-845.
4. Castellani Ceresa, L., Mattiol, M., Radaelli, G. Actin polymerization in boar spermatozoa: fertilization is reduced with use of cytochalasin D [Текст] / L.Castellani Ceresa, M.Mattiol, G. Radaelli [et al.] // Mol. Reprod. Dev. - 1993. - V. 36. - P. 203-211.
5. Galan, C., Dionisio, N., Smani, T., The cytoskeleton plays a modulatory role in the association between STIM1 and the Са2+ channel subunits Orai1 and TRPC1 [Текст] / C. Galan, N. Dionisio, T. Smani [et al.] // Biochem. Pharmacol. - 2011. - V. 82. -P. 400-410.
6. Howes, E. A., Hurst, S. M., Jones, R. Actin and actin binding proteins in bovine spermatozoa: potential role in membrane remodeling and intracellular signaling during epididymal maturation and the
acrosome reaction [Текст] / E. A. Howes, S. M. Hurst, R. Jones // J. Androl. - 2001. - V. 22. - P. 62-72.
7. Kraus-Friedmann, N. Signal transduction and calcium: a suggested role for the cytoskeleton in inositol 1,4,5-trisphosphate action [Текст] / N. KrausFriedmann // Cell Motil Cytoskeleton. - 1994. V. 28(4). -P. 279-284.
8. Ribeiro, C. M., Reece, J., Putney, J. W. Jr. Role of the cytoskeleton in calcium signaling in NIH 3T3 cells. An intact cytoskeleton is required for agonist-induced Са2+ in signaling, but not for capacitative calcium entry
[Текст] / C. M. Ribeiro, J. Reece, J. W. Puthey Jr. // J. Biol. Chem. - l997. - V. 272. - P. 26 555-26 56l.
9. Thundathil, J. C., Dance, A. L., Kastelic, J. P. Fertility management of bulls to improve beef catle productivity [Текст] / J. C. Thundathil, A. L. Dance, J. P. Kastelic // Theriogen. - 20l6. -V 86(l). - Р. 397-405.
10. Walensky, L. D., Snyder, S. H. Inositol l,4,5-trisphosphate receptors selectively localized to the acrosome of mammalian sperm [Текст] / L. D. Walensky, S. H. Snyder // J. Cell Biol. - l995. -V. l30. - P. 857-869.
АППАРАТ ДЛЯ ИМПУЛЬСНОЙ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОЙ ТЕРАПИИ «УМИ-05»
На протяжении многих лет клиника БНПЦ ЧИН и Институт Ветеринарной Биологии (Санкт-Петербург) используют в своей практике уникальный прибор — генератор низкочастотного магнитного импульсного излучения большой мощности «УМИ-05» (ранее «УИМТ-2», «УИМТ-3»). Данный прибор применяется для моно-или комплексной терапии целого ряда заболеваний, которые ранее считались неизлечимыми или очень тяжело поддавались лечению.
Основные направления применения «УМИ-05»
• Заболевания мочевой системы: мочекаменная болезнь, пиелонефрит, поликистоз, цистит.
• Желчекаменная болезнь.
• Заболевания опорно-двигательного аппарата: остеохондроз позвоночника, дископатия, артрозо-артриты, бурсит, растяжение связок, ушибы, контрактуры суставов, миозит.
• Купирование эпилептических приступов и эпилептического статуса.
• Гипертензия.
• Отит гнойный.
• Отит аллергический.
Стандартный курс лечения
• 10 сеансов по 30—50 импульсов на одну патологическую область. Мощность 50—80 %. Курс можно повторить с перерывом в 10 дней.
• Профилактический курс для животных группы риска (остеохондроз, МКБ и пр.) — 7—10 сеансов с интервалом 6 месяцев.
• Применение прибора не вступает в противоречие с использованием фармакологических и хирургических методов лечения.
• Магнитотерапию не следует проводить на области тела, содержащей металлоконструкции (например, штифты или пластины для остеосинтеза).
Экономика
• Быстрая окупаемость прибора.
• Минимальная затрата рабочего времени: длительность одного сеанса на одну патологическую зону — 2—3 минуты.
• Высокая эффективность лечения, полное излечение или введение животного в стойкую ремиссию по всем перечисленным заболеваниям гарантируют значительное увеличение рейтинга клиники в целом и приток новых клиентов.
Стоимость прибора 27000 рублей Заказать УМИ - 05 можно по телефаксу: (812) 927-55-92 доб 208; (812) 612-13-34 доб. 208 или по e-mail: [email protected]. подробности на сайте: www.invetbio.spb.ru
