CC BY
49
© Т. А. Рижкова
УДК 579. 264: 579. 871. 1:579. 861. 2:579. 864. 1 Т. А. Рижкова
ОСОБЛИВОСТІ МІЖМІКРОБНИХ ВЗАЄМОВІДНОСИН ЗАЛЕЖНО ВІД ГАЗОВОГО СКЛАДУ АТМОСФЕРИ ІНКУБАЦІЇ
ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І. І. Мечникова НАМН України» (м. Харків)
Робота є фрагментом планової науково-дослідної роботи ДУ «ІМІ ім. І. І. Мечникова НАМН України» «Застосування електромагнітних полів (ЕМП) для посилення утворення окремих метаболітів та підвищення стабільності біологічних властивостей їх продуцентів», № держ. реєстрації 010711001639.
Вступ. Мікробні ценози при захворюваннях верхніх дихальних шляхів, зокрема при дифтерії, в переважній більшості характеризуються багатоком-понентністю та видовим різноманіттям. Цілком очевидно, що між представниками мікробних спільнот утворюються не індиферентні взаємовідносини. Однією з форм відносин в асоціаціях є мікробний антагонізм - часткове чи повне пригнічення росту одного представника біоценозу іншим.
Саме антагоністичні взаємовідносини мікроорганізмів є підґрунтям для створення та застосування пробіотичних препаратів. Майже всі відомі комерційні пробіотичні продукти створені для корекції порушень мікрофлори шлунково-кишкового тракту. Найбільш нові категорії пробіотичних продуктів націлені на застосування у різноманітних нішах макроорганізму, таких як ротова порожнина, вагінальна слизова оболонка, шкіра. Перспективність використання таких препаратів у комплексній терапії дифтерії та для санації носіїв коринебактерій пов’язана з тим, що пробіотичні штами бактерій здатні підтримувати баланс мікрофлори верхніх дихальних шляхів, насамперед, за рахунок антагоністичної дії на патогенні мікроорганізми [3, 10].
Відомо, що збудники дифтерії здатні персистува-ти не тільки на поверхні слизових оболонок ротової порожнини та мигдаликів, вони успішно заселяють і більш глибокі прошарки тканин, де тривалий час знаходяться в мікроаерофільних умовах. Експериментально доведено, що шляхом створення визначених умов культивування, можна різко змінювати процес утворення антибіотикоподібних речовин: від значного збільшення виходу вищезазначених сполук до повного припинення їх утворення при цілком нормальному розвитку мікроорганізму [5, 8].
Проблема вивчення асоціативних взаємовідносин коринебактерій з іншими представниками біоценозів верхніх дихальних шляхів за умови перебування в атмосфері мікроаерації привертає увагу тим, що в патогенезі бактеріоносійства Corynebacterium
diphtheriae мікробіоценози, що формуються всередині мигдаликів, можуть відігравати важливу роль як у пригніченні, так і в посиленні процесів персистенції патогенних коринебактерій.
Метою дослідження стало вивчення міжмікроб-них взаємовідносин окремих представників мікро-біоценозів верхніх дихальних шляхів із патогенними коринебактеріями за аеробних та мікроаерофільних умов культивування мікробних асоціантів.
Об’єкт і методи дослідження. Об’єктами дослідження були 26 штамів коринебактерій (Coryne-bacterium diphtheriae gravis токсигенний - 17 штамів, Corynebacterium diphtheriae gravis нетоксигенний -3 штами, Corynebacterium diphtheriae mitis нетоксигенний - 5 штамів, Corynebacterium diphtheriae intermedius нетоксигенний - 1 штам); 22 штами золотавих стафілококів (референс-штам Staphylococcus aureus ATCC 25923 та клінічні ізоляти S. aureus, вилучені від хворих на хронічний тонзиліт); 9 штамів лактобактерій (пробіотичні штами Lactobacillus acidophilus та Lactobacillus plantarum й 7 клінічних ізолятів, вилучених від хворих на хронічний тонзиліт).
Особливості міжмікробних взаємовідносин вивчали за проявом антагоністичних властивостей штамів коринебактерій по відношенню до золотавих стафілококів і лактобактерій та навпаки за аеробних та мікроаерофільних умов.
Мікроаерофільні умови культивування створювали у мікроанаеростатах за допомогою газогенерую-чих пакетів Generator GENbox microaer (bioMerieux, Франція) або газової суміші, що була виготовлена у заводських умовах і складалась з 5 % О2, 10 % СО2 та 85 % N2.
Приготування суспензій мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних клітин проводили за допомогою електронного приладу Densi-La-Meter (PLIVA-Lachema а. s., Чехія) за шкалою McFarland згідно з інструкцією до приладу [9].
Синхронізація культур перед проведенням дослідів досягалась одноразовим впливом низької температури (4 0С) впродовж 30 хвилин [1].
Дослідження антагоністичної активності мікроорганізмів проводили методом відстрочених посівів (перпендикулярних штрихів) [5]. Для досягнення поставленої мети усі досліди проводили в чотирьох варіантах: 1) вирощування мікроба-антагоніста та
тест-культур після підсіву за аеробних умов; 2) вирощування мікроба-антагоніста за аеробних умов, а тест-культур після підсіву - за мікроаерофільних; 3) вирощування мікроба-антагоніста та тест-культур після підсіву за мікроаерофільних умов; 4) вирощування мікроба-антагоніста за мікроаерофільних, а тест-культур після підсіву - за аеробних умов.
Контролями росту тест-культур були їх паралельні посіви на чашки з тими ж середовищами, але без досліджуємих культур-антагоністів. Облік результатів проводили шляхом виміру відстані, на якій був відсутній ріст тест-штамів. Тест-штами вважались нечутливими до дії антагоністу при зоні затримки росту 0 - 4 мм, малочутливими - зона 5 - 10 мм та високочутливими при зоні більшій ніж 10 мм [2, 3, б].
Досліди проводили принаймні у трьох повторюваннях. Статистична обробка даних здійснювалась у відповідності з правилами рядової і альтернативної варіаційної статистики, як викладено у посібниках [4, 7]. Результати обробляли за допомогою персонального комп’ютера із застосуванням комп’ютерних програм Statistika-7, Microsoft Office Excel 2003.
Результати досліджень та їх обговорення. При вивченні міжмікробних взаємовідносин установлено, що представники роду Corynebacterium в умовах культивування, різних за концентрацією кисню, зовсім не подавляли життєдіяльність золотавих стафілококів і лактобактерій.
Показано, що антагоністичну активність стосовно коринебактерій проявляли (95,5±4,3) % досліджених культур S. aureus. При цьому найбільш вираженим конкурентом C. diphtheriae виявився референс-штам S. aureus ATCC №25923, до якого високочутливими були 91,3 % тест-штамів (зони затримки росту >10 мм). Антагоністичні властивості клінічних ізолятів золотавих стафілококів були виражені меншою мірою.
Лактобактерії подавляли розмноження патогенних коринебактерій у (бб,б±15,7) % випадках. Частота виявлення вказаної активності залежала від походження штамів-антагоністів. Так, циркулюючі штами проявляли конкурентні властивості в (85,7±13,2) % випадків, а складові пробіотичних препаратів (Lactobacillus plantarum та Lactobacillus acidophilus) зовсім не впливали на ріст тест-культур.
При вивченні впливу малонасиченої киснем атмосфери інкубації на прояв антагоністичних властивостей конкурентів коринебактерій, встановлено, що за мікроаерофільних умов постановки дослідів зони затримки росту тест-культур C. diphtheriae достовірно збільшувались в 1,8 разів при співкультивуванні зі штамами S. aureus та в 2,2 рази при сумісному вирощуванні з культурами лактобактерій (табл. 1).
При цьому, за мікроаерофільних умов культивування питома вага штамів C. diphtheriae, нечутливих щодо лактобактерій, достовірно зменшилась від б5,4 % до 9,б %, а до стафілококів - від 4б,7 % до 10 %, у той час як питома вага високочутливих тест-культур збудника дифтерії стосовно антагоністичної дії лактобактерій збільшилась від 0,б % до 48,7 %, стосовно дії S. aureus - від 20,3 % до 54,9 % (р<0,01).
Таблиця 1
Антагоністична активність стафілококів та лактобактерій стосовно коринебактерій у різних за газовим складом умовах культивування
Штами- антаго- ністи Умови культивування антагоністів та тест-штамів Розподіл тест-культур коринебактерій за чутливістю до антагоністів, % ^±m) Зони затримки росту тест-культур, мм ^±m)
нечутливі мало- чутливі високо- чутливі
S. aureus аеробні 4б,7±2,4 33±2,2 20,3±1,9 б,б±0,2
мікроаеро- фільні 10±1,4* 35,1±2,3 54,9±2,4* 11,8±0,3*
Lacto- bacillus spp. аеробні б5,4±3,8 34±3,8 0,б±0,б 4,5±0,1
мікроаеро- фільні 9,б±2,4* 41,7±3,9 48,7±4,0* 9,8±0,3*
Примітка: * - достовірна різниця між зазначеними показниками за аеробних та мікроаерофільних умов постановки дослідів (р<0,01).
Відомо, що кінцевий результат конкурентної боротьби між мікроорганізмами визначається як здатністю штаму-антагоністу в різній мірі продукувати інгібуючі сполуки, так і ступенем зворотної чутливості до них інших представників мікробіоценозів. З метою визначення векторної направленості мікробних взаємовідносин, були проведені досліди, в яких штами-антагоністи вирощували за аеробних умов, а тест-культури після підсіву - за мікроаерофільних і навпаки. Результати вказаних досліджень наведені у табл. 2.
Таблиця 2
Міжмікробні взаємовідносини за різних умов культивування штамів-антагоністів та тест-культур
Штами-антагоністи Умови культи- вування Питома вага тест-культур коринебактерій з різною чутливістю до антагоністів, % (М±т) Зони за-
анта-гоністів тест-культур нечутливі мало- чутливі високо- чутливі тримки росту тест-культур, мм (M±m)
А А 49,2±2,5 34,4±2,3 1б,4±1,8 б,2±0,2
S. А М 49,0±2,5 34,б±2,3 1б,4±1,8 б,2±0,2
aureus М М 10,б±1,5* 35,8±2,4 53,б±2,4* 11,б±0,3*
М А 10,б±1,5* 3б,0±2,4 53,4±2,4* 11,б±0,3*
А А б5,4±3,8 34±3,8 0,б±0,б 4,5±0,1
Lacto- bacillus spp. А М б9,9±3,7 30,1±3,7 0 4,4±0,1
М М 9,б±2,4* 41,7±3,9 48,7±4,0* 9,8±0,3*
М А 8,3±2,2* 55,8±4,0 35,9±3,8* 9,1±0,3*
Примітка: * - достовірна різниця між зазначеними показниками та відповідними показниками за аеробних умов культивування штамів-антагоністів і тест-культур коринебактерій (р< 0,01); А - аеробні умови культивування; М - мікроаерофільні умови культивування.
При цьому збільшення зон затримки росту спостерігали саме за мікроаерофільних умов культивування штамів-антагоністів, різні умови вирощування тест-культур C. diphtheriae за однакових умов росту штамів-конкурентів (S. aureus та Lactobacillus spp.) не спричиняли достовірної зміни зазначених показників. Базуючись на отриманих даних, можна припустити, що причиною достовірного збільшення зон затримки росту патогенних коринебактерій за мікроаерофільних умов є саме стимуляція конкурентних властивостей штамів-антагоністів (можливо, за рахунок підвищення продукції антибіотикоподібних сполук та літичних ферментів, які безпосередньо інгібують коринебактерії, подавляючи їх ріст та білковий синтез), а не посилення чутливості тест-штамів під впливом вищезазначеного фактору.
Висновки. Усі досліджені представники роду Corynebacterium не проявляють конкурентних
властивостей стосовно золотавих стафілококів та лактобактерій.
Встановлено, що антагоністами коринебактерій є (95,5±4,3) % досліджених культур S. aureus та (66,6±15,7) % штамів лактобактерій.
Мікроаерофільне газове середовище сприяє посиленню антагоністичної активності мікро-бів-конкурентів і не впливає на ступінь чутливості тест-культур.
Перспективи подальших досліджень. Більш детальні дослідження механізмів впливу мікроаерофільних умов на антагоністичну активність різних видів мікроорганізмів за умов мікроаерації дозволять створити наукове підґрунтя для підвищення клінічної ефективності застосування пробіотичних препаратів у системі комплексної відновлювальної терапії при хворобах верхніх дихальних шляхів, або дисбіотичних станів та санації бактеріоносіїв.
Список літератури
1. Баснакьян И. А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами I И. А. Баснакьян. - М.: Медицина, 1992. - С. 29-59.
2. Борщ С. К. Вивчення на прикладі E. coli шт. М-17, введеної в препарат біфікол, закономірностей прояву антагоністичних властивостей мікроорганізмів, що належать до різних таксономічних одиниць, є збудниками дисбактеріозу кишечника, гнійно-запальних процесів та пробіотичними штамами I С. К. Борщ, Н. М Середюк, Р. В Куцик II Галиц. лікар. вісник. - 2004. - Т. 11, № 4. - С. 9-11.
3. Вивчення антагоністичної активності лактобацил, введених у пробіотичний препарат лактобактерин, щодо етіологічних чинників дисбактеріозу кишечника, гнійно-запальних процесів та пробіотичних штамів мікроорганізмів I С. К. Борщ, Н. М. Середюк, Р. В. Куцик [та ін.] II Галиц. лікар. вісник. - 2004. - Т. 11, № 3. - С. 1б -19.
4. Гельман В. Я. Медицинская информатика: практикум I В. Я. Гельман. - [2-е изд. ]. - СПб.: Питер, 2002. - 480 с.
5. Егоров Н. С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности I Н. С. Егоров. - М.: Высшая школа, 19б5. - 211 с.
6. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл I Е. И. Ермоленко, В. А. Исаков, С. X. Ждан-Пушкина, В. В. Тец II Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 2004. - № 5. - С. 94-98.
7. Лапач С. Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exel I С. Н. Лапач, А. В. Чубенко, П. Н. Бабич. - К.: Морион, 2000. - 188 с.
8. Скпяр Н. І. Особливості міжмікробних взаємовідносин в біоценозах гастродуоденального тракту I Н. І. Скляр II Вісник Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна. Серія: Медицина. - 2005. - № б58, вип. 10. - С. 33-39.
9. Стандартизація приготування мікробних суспензій: Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров’я № 1б3-200б К.: (Укрмедпатентінформ), 200б. - 10 с. - (Нормативний документ. МОЗ України; Український центр наукової медичної інформації та патентно-ліцензійної роботи. Інформаційний лист).
10. In Vitro Antibacterial Activity of Lactobacillus Casei Against Enteropathogens [Electronic recourse] I Amdekar S., Singh V., Roy P. [et al.] II WebmedCentral Microbiology. - 2010. - V. 1(9):WMC00698 http:IIwww. webmedcentral. com|article_view|698
УДК 579. 2б4: 579. 871. 1:579. 8б1. 2:579. 8б4. 1
ОСОБЛИВОСТІ МІЖ МІКРОБНИХ ВЗАЄМОВІДНОСИН ЗАЛЕЖНО ВІД ГАЗОВОГО СКЛАДУ АТМОСФЕРИ ІНКУБАЦІЇ
Рижкова Т. А.
Резюме. Вивчено асоціативні взаємовідносини патогенних коринебактерій із окремими представниками біоценозів верхніх дихальних шляхів. Показано, що усі досліджені представники роду Corynebacterium не впливають на життєдіяльність золотавих стафілококів та лактобактерій. Антагоністичну активність по відношенню до патогенних коринебактерій проявляли (95,5±4,3) % досліджених штамів S. aureus та (бб,б±15,7) % штамів лактобактерій. Мікроаерофільні умови культивування сприяють посиленню конкурентних властивостей стафілококів та лактобактерій по відношенню до коринебактерій.
Ключові слова: міжмікробні взаємовідносини, коринебактерії, стафілококи, лактобактерії.
УДК 579. 2б4: 579. 871. 1:579. 8б1. 2:579. 8б4. 1
ОСОБЕННОСТИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГАЗОВОГО СОСТАВА АТМОСФЕРЫ ИНКУБАЦИИ
Рыжкова Т. А.
Резюме. Изучены ассоциативные взаимоотношения патогенных коринебактерий с отдельными представителями биоценозов верхних дыхательных путей. Показано, что все исследованные представители рода Corynebacterium не оказывали влияния на жизнедеятельность золотистых стафилококков и лактобактерий. Антагонистическую активность по отношению к патогенным коринебактериям проявляли (95,5±4,3) % исследованных штаммов S. aureus и (бб,б±15,7) % штаммов лактобактерий. Микроаэрофильные условия культивирования способствуют повышению конкурентных свойств стафилококков и лактобактерий по отношению к коринебактериям
Ключевые слова: межмикробные взаимоотношения, коринебактерии, стафилококки, лактобактерии.
UDC 579. 2б4: 579. 871. 1:579. 8б1. 2:579. 8б4. 1
The Peculiarities Of Bacterial Relationships Depending On The Gas Composition Of Incubation Atmosphere
Ryzhkova T. A.
Summary. The associative relationships between Corynebacteria and some representatives of the upper respiratory tract were studied. It was shown, that examined Corynebacteria had no influence on S. aureus and Lactobacillus vital activity. It was established, that (95,5±4,3) % of S. aureus strains and (бб,б±15,7) % Lactobacillus strains manifested antagonistic activity against pathogenic Corynebacteria. Microaerophilic growth conditions resulted in increasing of S. aureus and Lactobacillus antagonistic activity against pathogenic Corynebacteria.
Key words: bacterial relationship, Corynebacteria, Staphylococcus, Lactobacillus.
Стаття надійшла 2З.08.2012 р.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
