Особенности метаболизма трегалозы у пивных дрожжей низового брожения Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Особенности метаболизма трегалозыу пивных дрожжей низового брожения

Т.В. Меледина, С.А. Черепанов

Государственный университет низкотемпературных и пищевых технологий (С-Петербург)

В настоящее время в связи с развитием малого бизнеса в России, в частности мини-пивоварен, представляется актуальным использование активных сухих пивных дрожжей различных штаммов. Между тем следует иметь в виду, что обезвоживание клеток наряду с другими экстремальными ситуациями, такими, как высокое осмотическое давление или резкие изменения температуры и величины рН во время культивирования дрожжей, отрицательно влияют на жизнеспособность сахаромицетов. Установлено, что устойчивость клеток к стрессам повышает резервный углевод — трегалоза [Sales, 2000].

Резервные углеводы в клетках дрожжей представлены тремя фракциями: трегалозой и двумя фракциями гликогена, растворимыми в уксусной и хлорной кислоте. Трегалоза — резервный дисахарид, состоящий из двух глико-зидных остатков. Трегалоза находится в цитоплазме дрожжевой клетки; часть трегалозы связана с клеточной стенкой и защищает ее от внешнего воздействия. В отличие от гликогена трегало-за наряду с ее энергетической функцией участвует в поддержании структуры цитозоля [5], а также может служить осмотическим барьером [1].

Содержание трегалозы в клетке варьирует в зависимости от степени аэробиоза: в бродящих дрожжах ее может накопиться до 6 %, в дышащих— до 18 %.

Синтез трегалозы начинается с образования уридиндифосфат глюкозы (УДФГл), при этом трегалозо-фосфат синтезируется как из УДФГл, так и Гл-6-Ф при участии а.а-трегалозофосфатсинтазы (УДФ-образующей, ЕС 2.4.1.15). Трегалоза образуется под действием трегалозофосфа-тазы (ЕС 3.1.3.12) по схеме

Глюкоза

Ф

Глюкозо-6-фосфат ^ Трегалозо-6-фосфат

ФФ Ф

Глюкозо-1-фосфат ^ УРДГл.

Панек [7] предполагает, что направление потока Гл-6-Ф на синтез того или

другого углевода регулируется его концентрацией внутри клетки. При высокой концентрации образуется гликоген, при низкой — трегалоза.

Роль гликогена и трегалозы в метаболизме дрожжей неодинакова. Первичным резервным веществом дрожжевой клетки служит гликоген, так как во время хранения именно он используется в качестве эндогенного источника углеводного питания [4]. Освободившаяся энергия используется клеткой для поддержания собственных структур, при этом предотвращается распад структурных полисахаридов и ферментных белков, т.е. лизис дрожжей. В период лаг-фазы метаболизм гликогена дает энергию и, вероятно, субстрат для синтеза стеролов, необходимых в процессе роста дрожжей [8]. Следовательно, продолжительное хранение дрожжей может привести к истощению запаса гликогена без сопутствующего образования стеролов. В результате может снижаться скорость роста дрожжей и выхода биомассы.

В отличие от гликогена роль трега-лозы, как резервного вещества, подвергается сомнению, так как в отсутствие углерода и азота она не метабо-лизируется. Однако неоспорима ее роль в лаг-фазе роста дрожжей. При наличии в среде необходимых для размножения субстратов трегалоза потребляется за 45 мин, после чего начинает утилизироваться глюкоза.

Синтез гликогена и трегалозы активизируется при переходе культуры из логарифмической скорости роста в фазу замедления роста, т.е. во время снижения удельной скорости роста дрожжей.

Скорость роста можно регулировать:

путем лимитации размножения культуры дрожжей различными компонентами питательной среды (С, Ы,Р, Б и т.п.). Чаще всего эта цель достигается либо снижением дозировки, либо азотного, либо углеводного питания, либо того и другого одновременно. При одной и той же скорости роста клетки, выращенные в условиях лимита глюкозы, содержат больше резервных угле-

водов, чем при лимитации азотом [6,2];

путем регулирования энергетического обмена дрожжей. Так, для преимущественного накопления трегало-зы необходима высокая степень аэроб-ности культуры [6], а главное — исключение катаболитной репрессии [2];

путем создания определенных физико-химических условий культивирования (температуры, рН, осмотического давления). Увеличению содержания трегалозы в растущей культуре способствует повышение температуры до 35 °С и выше [3]. Можно также дифференцированно управлять синтезом гликогена и трегалозы в покоящихся дрожжах с помощью температуры. Оптимум температуры для накопления гликогена 30 °С, для трегалозы — 45 °С. При такой температуре трегало-зы накапливается до 20 % от массы дрожжей.

Исследования, проведенные в процессе изучения репродуктивной активности обезвоженной чистой культуры хлебопекарных (А.с. 767195,1980), винных (А.с. 1437391,1988) и пивных дрожжей (Патент 2066350,1996), показали, что в первую очередь для синтеза трегалозы необходимо: исключить катаболитную репрессию при выращивании посевного материала; регулировать обмен дрожжей в направлении синтеза белка и резервных углеводов таким образом, чтобы отношение белок: углеводы приближалось к 1.

Современные технологии получения чистой культуры пивных дрожжей хотя и предусматривают аэрирование культуральной жидкости во время выращивания, однако не исключают ка-таболитной репрессии, проявляющейся в ингибировании процессов дыхания в клетках дрожжей 5. свгву1$1ав. В результате ввиду высокой концентрации сбраживаемых сахаров в питательной среде выход биомассы в расчете на сахар не превышает 40 %, в то время как максимальная величина экономического коэффициента приближается к значению 216 %.

Анализ дрожжей, выращенных в солодовом сусле по принятой на пивоваренных заводах технологии, показал, что полученные таким образом клетки содержат много азотсодержащих компонентов (до 56 % сырого протеина или 9,0 % от СВ), мало углеводов (до 33 %), в том числе трегалозы (до 5 %). Такие дрожжи при обезвоживании в течение 1,5 ч при температуре 35°С имеют низкую выживаемость (до 70 %). Кроме того, из-за интенсивно проходящих при обезвоживании реакций меланоидинообразования дегидратированные дрожжи чистой культуры, полученные по обычной технологии,

.....""".........

'4•2004

имеют темно-коричневыи цвет и карамельный запах. Эти дрожжи быстро теряют свою жизнеспособность и через 12 дней совершенно непригодны для использования, так как содержат до 75 % мертвых клеток.

Таким образом, для выращивания чистой культуры пивных дрожжей, предназначенных для дегидратации, необходимо применить совершенно другой способ культивирования, а именно воздушно-приточный, который в настоящее время не используется в пивоварении.

Первоначальные исследования, проведенные с дрожжами низового брожения (штамм 776), показали, что в идентичных условиях выращивания в культуре с притоком питательной среды и аэрацией метаболизм пивных и хлебопекарных дрожжей значительно отличается (рис. 1). Выход биомассы и интенсивность размножения пивных дрожжей значительно ниже, чем хлебопекарных, что подтверждает точку зрения о том, что пивные дрожжи можно характеризовать как дыхательно недостаточные штаммы. В то же время в этих условиях наблюдается более интенсивный синтез трегалозы (9,7 % от СВ клеток), чем обычно это имеет место в чистой культуре пивных дрожжей (2,0-2,5 % от СВ). Как было отмечено, трегалоза способствует сохранению жизнеспособности дрожжей после перенесенного стресса, который может быть вызван как обезвоживанием, так и высоким осмотическим давлением при внесении дрожжей в сусло с высокой массовой долей сухих веществ.

Таблица 1

Содержание трегалозы, % от СВ Количество мертвых клеток, %

после обезвоживания после хранения в течение 2 мес

2,0 28 56

4,8 10 23

11,8 8 12

2 V

20

со

о

5 15 °Я 10

о

и 5 а> ср

0

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Величина отношения сахар/дрожжи, г/г

1 — 776; 2 — ЛВ-7

Рис. 2. Влияние величины отношения

сахар/дрожжи на синтез трегалозы

Интересно отметить, что по мере увеличения катаболитной репрессии (или при проявлении эффекта Кребт-ри), вызванной высокой концентрацией сахара (в нашем случае увеличенной нагрузкой сахара на единицу биомассы в начале каждого часа культивирования), метаболизм трегалозы у хлебопекарных дрожжей приближается к процессам синтеза трегалозы у пивных дрожжей (рис. 2).

В связи с тем что для хлебопекарных дрожжей доказана роль трегалозы как осмотического регулятора в процессе обезвоживания и особенно в репаратив-ных процессах, протекающих во время реактивации, исследовали роль этого ди-сахарида во время хранения пивных дрожжей. С этой целью для обезвоживания были взяты образцы чистой культуры с различным содержанием трегало-зы в клетках (табл. 1).

Как видно из приведенных данных, существует прямая зависимость между уровнем трегалозы в клетках и ксе-рорезистентностью пивных дрожжей.

Исследование метаболизма углеводов в культуре с притоком питательных компонентов при культивировании различных штаммов пивных дрожжей. Известно, что интенсивность размножения и синтез тре-галозы зависят от штаммовых особенностей дрожжей, поэтому провели сравнение по этим показателям трех штаммов пивных дрожжей низового брожения 11, 776, 8АМ (табл. 2) из коллекции лаборатории микробиологии, биохимии и технологии дрожжей ГЦ «Хлеб». Интенсивность размножения и экономический коэффициент потребления сбраживаемых углеводов исследовали в условиях простой периодической

культуры с аэрацией (1-й режим) и в периодической культуре с притоком питательных компонентов (2-й режим). Для выращивания дрожжей в первом случае использовали солодовое сусло с содержанием 5,8 % сбраживаемых сахаров. Для накопления биомассы на второй стадии в качестве источника углеводов применяли мелассу. Длительность культивирования составляла 13 ч при температуре 28±2 °С. Для накопления трегалозы, как это было установлено нами ранее (А.с. 767195,1980), приток углеводного питания был рассчитан таким образом, чтобы нагрузка сахара на единицу биомассы постепенно падала с 0,14 до 0,05 г/г. Для сравнения приведены данные, полученные для хлебопекарных дрожжей (штамм ЛВ-7), у которых метаболизм трегалозы изучен достаточно полно.

Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что в среде с высокой концентрацией сахара (1-й режим) экономический коэффициент потребления сахаров не зависит от штамма дрожжей. Не наблюдалось существенных отличий и в синтезе трегало-зы. Также практически нет различий в интенсивности размножения дрожжей первые 5 ч культивирования,однако далее, начиная с пятого часа, скорость роста штаммов пивных дрожжей в 2-2,5 раза ниже по сравнению с хлебопекарными. Основная причина этого кроется в явлении флокуляции, свойственной именно пивным дрожжам. Поэтому для достижения конечной степени сбраживания сахаров в первом случае требуется 13 ч, в то время как для хлебопекарных дрожжей — 10 ч.

Применение способа культивирования с притоком питательных компонентов (2-й режим) способствовало повышению выхода биомассы, но тем не менее у пивных дрожжей экономический коэффициент потребления субстрата У был почти в 2 раза ниже, чем у пекарских дрожжей. Однако уровень трегалозы во всех образцах был практически одинаковым (табл. 3).

Изучение ксерорезистентности, репродуктивной и бродильной активности активных сухих пивных дрожжей (АСПД). Исследовали репродуктивную активность ЧК активных сухих пивных дрожжей 776 штам-

Таблица 2

Показатель Штамм дрожжей

БАМ 11 776 ЛВ-7

У, % от сахара 49,7 47,6 47,6 47,8

р, ч-1 (с 0 по 5 ч) 0,352 0,383 0,376 0,367

р, ч-1 (с 5 по 13 ч) 0,078 0,056 0,060 0,173*

Содержание трегалозы, % от СВ клеток 2,8 3,1 2,3 3,2

ц — удельная скорость роста, ч-1

4•2004 1

..................

Показатель Штамм дрожжей

8АМ 11 776 ЛВ-7

У, % от сахара 124,8 116,8 124,3 195,6

р, ч-1 0,073 0,072 0,072 0,175

Трегалоза, % от СВ 10,2 10,6 10,7 11,2

Показатель Рекомендуемые Образец ЧК Генерация семенных дрожжей, №

значения 1 2 3 4 5 6

Почкование, % 5-0 АСПД Прессованные 7,0 7,0 2,9 29,5 15,2 32,9 17.1 34.2 19,5 32,3 13,1 20,4

Мертвые клетки, % Менее 5 АСПД Прессованные 7,5 8,0 7,2 7,5 7,8 5,3 7,3 10,2 3,8 4,0 6,2 10,2

Количество клеток, Более 75 АСПД 6,8 75,9 74,3 63,7 98,2 96,9

окрашенных Люголем, % Прессованные 6,5 83,5 62,2 55,9 95,0 96,9

ма двух партий, полученных путем высушивания прессованных дрожжей в щадящем режиме обезвоживания.

Исследование репродуктивной активности 1-й партии сухих дрожжей проводили в течение шести генераций, 2-й партии — в течение восьми генераций. Контролем служили семенные прессованные дрожжи. Дрожжи первой партии содержали трегалозы 4,8 % от СВ, второй — 11,8 %.

Ксерорезистентность дрожжей определяли по числу жизнеспособных клеток в течение 6 мес хранения (рис. 3). Показано, что образец дрожжей, содержащий 4,8 % трегалозы до обезвоживания, можно использовать для получения пива в течение 3 мес хранения, в то время как образец с высоким содержанием трегалозы (11,8 %) — 6 мес.

Прессованные дрожжи, содержащие 4,8 % трегалозы и полученные из них обезвоженные дрожжи, реактивировали в солодовом сусле с массовой долей сухих веществ 12 % в течение

Таблица 3

Таблица 4

12 ч и далее использовали в качестве семенных дрожжей при производстве пива. На рис. 4. приведены данные по бродильной активности этих партий дрожжей в течение шести генераций, начиная со второй. Процесс брожения осуществляли при 8 °С. В качестве контроля использовали семенные дрожжи, полученные традиционным способом.

Дрожжи генерации № 1 получали в нестандартных условиях, так как величина засева была в 10-15 раз меньше, чем при сбраживании пива. Анализ результатов опытов показывает, что семенные дрожжи генерации № 2 и № 3, полученные из сухой ЧК, имеют меньшую бродильную активности, чем в контроле. Поэтому длительность главного брожения вместо 7 сут в опытных вариантах составляла 8-9 сут. Для предотвращения этого следует вести процесс не при 8 °С, а при более высокой температуре (10...12 °С). Начиная с генерации № 4, различий в бродильной активности между опытными и

контрольными дрожжами нет. Морфологическая характеристика семенных дрожжей дана в табл. 4.

Содержание мертвых клеток во всех генерациях дрожжей было практически одинаковым и не зависело от того, из каких образцов ЧК были получены эти генерации. Количество клеток, содержащих гликоген, выявляемый окрашиванием Люголем, в первой генерации было значительно ниже как в опытных образцах, так и в контроле. Это можно объяснить более интенсивным размножением дрожжей при величине расхода инокулята 0,05 %, а не 0,5 %, как это имело место в последующих циклах брожения. Видно, что, начиная со 2-й генерации, упитанность контрольных и опытных образцов семенных дрожжей находилась в норме, что обеспечивало нормальный ход протекания главного брожения и получение практически одинаковых результатов по степени сбраживания сусла. Также из приведенных данных следует, что нет зависимости между количеством клеток, содержащих гликоген, и степенью сбраживания пива. Однако это справедливо только в том случае, когда семенные дрожжи сразу же после снятия с пива применяют для следующего цикла брожения.

В следующей серии опытов для получения пива использовали прессованные пивные дрожжи с массовой долей трега-лозы 11,8 % от СВ и полученные из них сухие дрожжи, в которых количество жизнеспособных клеток составляло 92 %, количество клеток с повышенной проницаемостью — 48 %. Оба образца дрожжей применяли для получения пива с массовой долей сухих веществ 11 %.

Первый цикл брожения проходил при расходе посевного материала в количестве 0,04 % в расчете на Д25, что в 10 раз меньше, чем принято в класси-

100 -|

Длительность хранения, мес

■ 1-й образец ЧК — 4,8 % трегалозы;

■ 2-й образец ЧК — 11,8 % трегалозы

Рис. 3. Зависимость жизнеспособности клеток от длительности хранения и содержания трегалозы в АСПД

.....ИПИ"".......

'4•2004

Номер генерации

■ АСПД образец;

■ ЧК бродильного типа

Рис. 4. Степень сбраживания сусла при использовании АСПД (1-й вариант — содержание трегалозы в клетках до обезвоживания 4,8 %)

ческой технологии брожения. Пиво сбраживали при температуре 9...12 °С, поэтому в отличие от данных, полученных выше (см. рис. 4), длительность процесса получения зеленого пива приближалась к контролю. Следует отметить, что в вариантах с низкой величиной засева (0,04 %) коэффициент прироста дрожжей составил для прессованных 61, а для АСПД — 68. Эти дрожжи далее были взяты для последующих циклов брожения, величина засева составляла 0,4 %. Как видно из рис. 5, бродильная активность, о которой судили по количеству образовавшегося ди-

оксида углерода за 3 ч брожения пива, начиная со второй генерации, достигает значений, полученных в контроле. Затем, начиная с 4-й генерации, бродильная активность дрожжей несколько выше в опытных партиях брожения.

Следует также отметить, что наибольшей бродильной активностью обладают дрожжи генерации №2-5, затем она снижается.

Таким образом, пивные дрожжи, выращенные в условиях притока питательных компонентов и аэрации, могут содержать высокий уровень трегалозы. Эти дрожжи после обезвоживания в

течение длительного периода времени сохраняют репродуктивную активность и могут быть успешно использованы для получения пива.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бекер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. — Рига: Зинатне, 1981.

2. Дамберг В.Э. Роль трегалозы в росте и восстановлении дрожжей 8.сегеу181ае//Изв. АН Латв. ССР. 1982.№ 8. 421.93-98.

33. Черныш В.Г., Бочарова Н.Н. Влияние температуры и активной кислотности среды на метаболизм резервных углеводов и выживаемость пекарских дрожжей//Прикл. био-хим. и микробиол. 1981. Т.17, XQ. С. 389

4. Grba S.,Oura E., Suomalainen H. On the formation of glycogen and trehalose in baker's yeast//Eur.J. Appl. Microbiol.1976. 2. 29-37.

5. Keller F., Schelenberg M., Wimken A. Localisation of trehalase in vacuoles and trehalose in cytosol of yeast (S.cerevisiae)// Arch. Microbiol. 1982. 131. 298-301.

6. Kutnzi M.F., Fiechter A. Regulation of S.cerevisiae under growth limitation//Arch. Microbiol. 1972. 16,6-9.

7. Panek A.D. Trehalose metabolism in yeast cell: Proc. 4-th Int. Symp. on yeasts. — Wiena, 1974. Part 1, p.p. 63-64.

8. Qualin D,Thurston P, Tubb R. The structurel and storage carbohydrates of S.cerevisiae. Changes during fermentation of wort and role the glycogen catabolism in lipid biosynthesis// J. Inst. Brew. 1981. 87. 108-111.

9. Sales K., Brandt W. et al. Biochem et Biophysiea Acta//Biomemdranes. 2000. 1463. Р. 267.

90 ЛЕТ НА МИРОВОМ РЫНКЕ

ВСЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПИВА И НАПИТКОВ

LCASCOT

НАДЕЖНОСТЬ, КАЧЕСТВО, СЕРВИС

✓ Фильтровальн]

✓ Фильтровальн

✓ Кизельгур

✓ Моющие и дез

✓ Пивоваренный

✓ Клей для этике

✓ Стабилизаторы

✓ Ферментные п

✓ АктивированнЫ

ьтрационные линии си PVPP-cтабилизации

✓ Карбонизаторы сокоплотного смешивания

✓ Теплообменники, насосы ерительные приборы, датчики ✓ Лабораторное оборудование ое оборудование для виноделия озлива в КЕГи, бутылки, банки ✓ Оборудование б/у

✓ Запасные части

Приглашаем посетить стенды: «Фильтрокс» — зал 6/105 «Сопура» — зал 4/219 на выставке Бгаи-2004 в Нюрнберге с 10 по 12.11.04

ООО «ВУЛКАСКОТ» г. Москва

Тел.: (095) 785 21 92, 242 96 86.

Факс (095) 785 21 92. E-mail: vulcascot@aha.ru

SOPURA©

4•2004

ПИВО " "ЛПИТКИ