CC BY
26
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ У ДЕТЕЙ
Глазова Т. Г.1*, кандидат медицинских наук,
Рывкин А. И.2, доктор медицинских наук,
Решетова Т. Г.2, доктор медицинских наук,
Воронина J1. Б.3, кандидат медицинских наук,
Кузнецова О. В.1, кандидат медицинских наук
1 Кафедра поликлинической педиатрии ФДППО ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 153012, г. Иваново, просп. Ф. Энгельса, д. 8.
2 Кафедра педиатрии ФДППО ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
3 МУЗ «1-я городская клиническая больница», 153003, г. Иваново, ул. Парижской Коммуны, д. 5.
РЕЗЮМЕ У детей, страдающих бронхиальной астмой, в различные фазы патологического процесса изучены метаболические свойства лейкоцитов. Выявлено повышение активности дегидрогеназ, уровня гликогена, жесткости лейкоцитарных мембран и снижение активности пероксидазы. Данные изменения, сопряженные с обструктивными респираторными нарушениями и высоким уровнем оксида азота (маркера активности аллергического воспаления), имеют патогенетическую значимость в персистировании хронического иммунного воспаления в бронхолегочной системе, что обосновывает разработку мер для их коррекции.
Ключевые слова: бронхиальная астма, дети, лейкоциты, мембраны, активность дегидрогеназ.
* Ответственный за переписку (corresponding author): e-mail: an230599@rambler.ru
Бронхиальная астма (БА) относится к числу наиболее распространенных хронических заболеваний детского возраста [2, 8, 12].
Исследования последнихдесятилетий свидетельствуют о том, что в патогенезе БА, несомненно, важную роль играют изменения функциональной активности различных клеток, структуры и функции их мембран [1, 10, 12]. Однако при наличии многочисленных работ, касающихся различных сторон этой проблемы, в современной научной литературе, на наш взгляд, отсутствует комплексное и многоуровневое изучение структурно-метаболических параметров лейкоцитов при БА у детей.
Можно полагать, что предпринятое комплексное решение поставленных вопросов позволит не только раскрыть один из возможных патогенетических механизмов персистирования БА у детей,
но и научно обосновать подходы к терапевтической коррекции выявленных отклонений.
Цель исследования - установить особенности метаболизма лейкоцитов и их мембран у детей с БА, их сопряженность с показателями респираторной активности легких и уровнем оксида азота, чтобы верифицировать их роль в формировании и персистировании аллергического воспаления в бронхолегочной системе.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 116 детей с БА в возрасте 8-14 лет. Контрольную группу составили 15 здоровых детей того же возраста.
Клеточный метаболизм лейкоцитов изучен с помощью цитохимических методов с последующей компьютерной морфометрией цитологических параметров [4].
Glazova T. G., Ryvkin A. I., Reshetova T. G., Voronina L. B., Kuznetsova O. V.
THE PECULIARITIES OF LEUCOCYTES METABOLIC CHARACTERISTICS IN BRONCHIAL ASTHMA IN CHILDREN
ABSTRACT Leucocytes metabolic characteristics in various phases of pathological process were studied in children with bronchial asthma. Increased dehydrogenase activity, heightened glycogen level, increased leucocytes membranes rigidity were revealed side by side with decreased peroxidase activity. These alterations attended by obstructive respiratory disorders and NO high level (allergic inflammation activity marker) had pathogenetic significance in chronic immune inflammation persistence in bronchopulmonary system. It substantiated the development of measures to correct them.
Kev words: bronchial asthma, children, leucocytes, membranes, dehydrogenase activity.
Активность пероксидазы определяли бензиди-новым методом по Sato (1928) в модификации Quaglino (1958).
Определение активности а-глицерофосфатде-гидрогеназы (а-ГФДГ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) осуществляли по методу Р. П. Нарциссова (1969).
Наличие гликогена в клетке устанавливали с помощью PAS-реакции по Мак-Манусу (1946). С помощью компьютерного анализа измеряли среднюю оптическую плотность, отражающую содержание в клетках исследуемых веществ.
Концентрацию адениловых кислот в сыворотке: аденозинтрифосфатов (АТФ), аденозиндифос-фатов (АДФ), аденозинмонофосфатов (АМФ) -определяли по методике Л. А. Гущиной и соавт. (1984) [5].
Величину энергетического заряда (ЭЗ) вычисляли по формуле [6]:
_ [АТФ] + 1/2[АМФ]
“[АТФ] + [ДЦФ] + [АМФ]'
Липидный состав мембран клеток (нейтрофилы, мононуклеары, лимфоциты) устанавливали методом тонкослойной хроматографии общих липидов [7]. Рассчитывали коэффициент ХС/ФЛ, равный отношению уровня холестерина к уровню фосфолипидов биомембран и дающий представление об их микровязкости и пластичности.
Интенсивность перекисного окисления липидов в лейкоцитарных клетках определялась по содержанию малонового диальдегида (МДА) [13].
Оценка функции внешнего дыхания проводилась методом компьютерной спирометрии по кривой «поток-объем форсированного выдоха» на приборе «Spirosift-ЗООО»
Статистическая обработка данных осуществлялась методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В изучаемой группе преобладали мальчики (64%). Большинство детей имело среднетяжелую БА (75,2%); легкая БА диагностирована у 14,8%, тяжелая - у 10%. В период обострения обследовано 59% больных, во время ремиссии - 41%. Сенсибилизацию наиболее часто вызывали бытовые (у 40%) и эпидермальные аллергены (у 46%).
Установлены разнонаправленные изменения метаболических свойств лейкоцитов в зависимости от фазы патологического процесса. В период обострения отмечается достоверное повышение активности дегидрогеназ (а-ГФДГ - 0,194 ± 0,004
уел. ед.; СДГ - 0,165 ± 0,004 уел. ед.) и снижение активности пероксидазы (0,187 ±0,008 уел. ед.) в сравнении с контролем (а-ГФДГ - 0,12 ±0,008 уел. ед.; СДГ - 0,104 ± 0,006 уел. ед.; пероксида-за - 0,369 ± 0,022 уел. ед.).
Увеличение функциональной активности лейкоцитарных дегидрогеназ свидетельствует о напряженном функционировании митохондриальной дыхательной цепи, сопряженном с усилением процессов биологического окисления и с интенсивным потреблением энергии, что требует возрастания скорости общего внутриклеточного катаболизма, приводящего к интенсивному расходованию АТФ и высокому риску снижения энергетического потенциала клеток. В свою очередь, высокая скорость расходования АТФ ведет к повышению эффективности дыхания и фосфорили-рования в митохондриях (дыхательный контроль), о чем свидетельствует высокий энергетический заряд клеток (0,82 ± 0,03 ед.) в периоде обострения, несмотря на тенденцию к снижению концентрации АТФ (0,89 ±0,03 ммоль/л) и повышению уровня АМФ (0,087 ± 0,02 ммоль/л) в сравнении с контролем (АТФ - 0,97 ± 0,02 ммоль/л, АМФ -0,063 ± 0,01 ммоль/л).
Следует заметить, что в нейтрофилах уровень гликогена (0,218 ±0,007 уел. ед.) достоверно не отличался от такового в контроле (0,252 ±0,017 уел. ед.), в то время как в лимфоцитах происходило его достоверное (р < 0,05) снижение (0,109 ±0,004 уел. ед.), обусловленное высокой функциональной активностью этого пула клеток.
В острой фазе заболевания наряду с повышением метаболической активности клетокрегистрируется изменение мембранной микровязкости, о чем свидетельствует увеличение коэффициента ХС/ФЛ мембран нейтрофилов, мононуклеаров, лимфоцитов (2,38 ±0,14; 2,003 ± 0,166 и 2,002 ± 0,13 у. е. соответственно), отражающее снижение мембранной пластичности. Нарушение соотношения мембранных липидов, по-видимому, имеет патогенетическое значение, определяя модификацию функциональной активности мембранныхетруктур лейкоцитов, в частности рецепторной их составляющей, что закономерно приводит к изменению внутриклеточного метаболизма и межклеточных лейкоцитарных взаимодействий. Кроме того, дисбаланс соотношения холестерин/фосфолипиды в мембранах лейкоцитов может трансформировать обмен мембранных фосфолипидов в сторону увеличения образования липидных медиаторов воспаления, поддерживающих воспалительный процесс в респираторном тракте [11]. Изменение мембранной микровязкости изучаемых клеток, по всей видимости, нарушает функционирование их ферментных систем, изменяет активность поверх-
ностных рецепторов и реализует один из механизмов бронхиальной обструкции [3].
Период обострения характеризовался увеличением концентрации МДА в лейкоцитах (5,214 ± 0,163 нмоль/мл), что свидетельствует об активации пе-рекисного окисления липидов и дестабилизации цитомембранных метаболических процессов, являясь, по всей вероятности, одним из механизмов нарушения ультраструктурной организации мембран лейкоцитов. Активация перекисного окисления липидов усугубляет ригидность мембранных фосфолипидов, снижает их текучесть, способствует поддержанию воспаления и гиперреактивности бронхов.
Исследование содержания нитрит-анионов при обострении заболевания, выявило увеличение их концентрации в КВВ (0,067 ± 0,003 ммоль/л) и лейкоцитах: в нейтрофилах- 0,035 ± 0,001 ммоль/л, в мононуклеарах - 0,028 ± 0,002 ммоль/л в сравнении с контролем (0,050 ± 0,004; 0,016 ± 0,001 и 0,014 ± 0,001 ммоль/л соответственно).
Необходимо отметить, что выраженность и направленность изменений изучаемых показателей находилась в прямой зависимости от тяжести БА.
Так, наибольшая степень активации внутриклеточных ферментов зарегистрирована при тяжелом варианте заболевания (а-ГФДГ - 0,202 ± 0,009 уел. ед., СДГ - 0,189 ±0,007 уел. ед.) и среднетяжелом (а-ГФДГ - 0,196 ±0,007 уел. ед., СДГ -0,164 ±0,007 уел. ед.) в сравнении с легким (а-ГФДГ-0,191 ± 0,009усл.ед.,СДГ-0,149 ± 0,004 уел. ед.); наиболее выражены изменения уровня СДГ. Поскольку СДГ, локализуясь исключительно в митохондриях клетки, отражает интенсивность работы внутримитохондриальной дыхательной цепи, то ее активация свидетельствует о высокой функциональной активности ферментативных реакций всего митохондриального кластера [4]. Указанные сдвиги свидетельствовали о высокой скорости внутриклеточного метаболизма в лейкоцитарной системе и значительном риске перенапряжения и истощения энергообеспечивающих систем клетки в условиях нарастающей гипоксии.
Несмотря на высокую активность дегидрогеназ-ного комплекса, при тяжелой БА интенсивная работа дыхательной цепи не компенсирует высокое потребление энергии, что приводит к увеличению концентрации АМФ (0,1 ±0,02 ммоль/л) и уменьшению энергетического заряда клетки (0,71 ±0,003 ед.), характеризуя выраженное напряжение реакций внутриклеточного обмена. Зарегистрированная диссоциация энергетических и катаболических процессов при тяжелой БА отражает, по-видимому, срыв компенсаторного напряжения цитохимических процессов и способствову-
ет персистированию воспалительного процесса в бронхолегочной системе. При тяжелой БА регистрируется и наибольшая концентрация продуктов оксида азота, как внутриклеточно, так и эндо-бронхиально (1\Ю2- нейтр. - 0,042 ± 0,004 ммоль/л; ЫО2' мононукл. - 0,044 ± 0,759 у. е., 1Ч02' лимф. -
2.443 ±0,679 у. е., ИО2' КВВ - 0,079 ± 0,006 ммоль/л).
Активность пероксидазы, напротив, при тяжелой БА была в 2 раза ниже (0,156 ±0,012 уел. ед.), чем у здоровых детей (0,369 ± 0,022 уел. ед.).
Обращает на себя внимание кинетика содержания гликогена в нейтрофилах, незначительное снижение которого отмечается лишь при тяжелой форме заболевания, что, по-видимому, отражает отчетливый компенсаторный характер поддержания на высоком уровне баланса энергетических ресурсов клетки в условиях ее выраженной функциональной активации.
Вероятно, подобные изменения структурно-фун-кциональной организации клеток позволяют поддерживать их жизнеспособность в условиях пер-систирующей аллергенной агрессии и сохранять необходимый диапазон функциональной активности клеточных популяций.
Жесткость мембран лейкоцитарных клеток при тяжелой БА также достигает максимальных значений (ХС/ФЛ нейтр. - 2,922 ± 0,704 у. е., ХС/ФЛ мононукл. - 2,93 ± 0,342 у. е., ХС/ФЛ лимф. -
2.443 ±0,679 у. е.).
В период клинической ремиссии хронический воспалительный процесс проявлялся изменениями показателей, характеризующих метаболические свойства лейкоцитов, уровень оксида азота и респираторную активность легких.
На фоне уменьшения обструктивных нарушений (ОФВ1 - 87,3 ±1,30%, ПСВ - 86,9 ±1,2%) происходит снижение активности дегидрогеназ (а-ГФДГ-0,152 ± 0,006уел. ед.;СДГ-0,158 ± 0,006 уел. ед.) и повышение активности пероксидазы (0,206 ± 0,007 уел. ед.), однако значения этих показателей не достигали контрольных значений (пероксидаза - 0,369 ± 0,022 уел. ед., а-ГФДГ -0,12 ± 0,008 уел. ед.; СДГ - 0,104 ± 0,006 уел. ед.).
Нормализация жесткости мембран также не наблюдается (ХС/ФЛ нейтр. - 1,59 ±0,12 у. е., ХС/ФЛ мононукл. -1,44 ± 0,11 у. е., ХС/ФЛ лимф. -1,38 ±0,11 у. е.).
По мере снижения активности воспалительного процесса происходит смещение метаболических реакций в сторону накопления высокоэнергетических субстанций (АТФ - 0,91 ±0,005 ммоль/л) и повышения энергетического заряда клетки (0,95 ± 0,02 ед.).
Уровень гликогена в лейкоцитарных клетках (нейтр. - 0,248 ± 0,007 уел. ед.; лимф. -
0,166 ± 0,006 уел. ед.) не отличается от контрольных значений (нейтр. - 0,252 ±0,017 уел. ед.; лимф. - 0,161 ± 0,012 уел. ед.).
В период ремиссии динамика изменений метаболических параметров лейкоцитов зависит от степени тяжести заболевания.
При легкой БА на фоне низкой активности пе-роксидазы (0,208 ±0,017 уел. ед.) сохраняется активация дегидрогеназ (а-ГФДГ - 0,152 ±0,007 уел. ед.; СДГ - 0,164 ± 0,011 уел. ед.).
При среднетяжелой БА отмечена тенденция к повышению, в сравнении с острым периодом (0,187 ±0,016 уел. ед.), активности пероксидазы до 0,251 ±0,012 уел. ед., однако полного ее выравнивания не происходит. Восстановления функции дегидрогеназ при среднетяжелой астме также не зарегистрировано (а-ГФДГ - 0,154 ±0,009 уел. ед.; СДГ - 0,170 ± 0,011 уел. ед.).
Тяжелая БА сопровождается наиболее выраженным дисбалансом внутриклеточного мета-
ЛИТЕРАТУРА
1. Болевич С. Б. Бронхиальная астма и свободнорадикальные процессы (патогенетические, клинические и терапевтические аспекты). - М. : Медицина, 2006.
2. Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика : нац. программа. - М.: Русский врач, 2006.
3. Вельтищев Ю. Е., Капустян А. М. Проблемы патологии детского возраста в аспекте нарушения структуры и функции биологических мембран. - М., 1982.
4. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии / С. В. Петричук [и др.]. - М., 2005.
5. Количественное определение компонентов аденило-вой системы в тромбоцитах / Л. А. Гущина [и др.] // Лаб. дело. - 1984. - № 4. - С. 223-225.
6. Николаев А. Я. Биологическая химия : учебник для мед. спец. вузов. - М. : Высшая школа, 1989.
7. Ростовцев В. Н., Резник Г. Е. Количественное определение липидных фракций плазмы крови // Лаб. дело. - 1982. - № 4. - С. 26 (218) - 29 (221).
болизма. Активность дегидрогеназ удерживается на достаточно высоком уровне (а-ГФДГ -0,163 ± 0,023уел. ед.;СДГ-0,168 ± 0,006уел.ед.). Сохраняется выраженное угнетение активности пероксидазы (0,183 ±0,021 уел. ед.). Уровень 1\Ю2- остается повышенным как в выдыхаемом воздухе (0,068 ± 0,005 ммоль/л), так и в нейтро-филах (0,025 ± 0,001 ммоль/л).
ВЫВОДЫ
Персистенция хронического аллергического воспаления при БА у детей сопровождается комплексом нарушений метаболических свойств лейкоцитов, важнейшими из которых являются повышение активности дегидрогеназ, уровня гликогена, жесткости мембран лейкоцитарных клеток и снижение активности пероксидазы. Данные изменения сопряжены с обструктивными респираторными нарушениями и уровнем оксидом азота, что свидетельствует о патогенетической значимости выявленных отклонений в персисти-ровании хронического иммунного воспаления в бронхолегочной системе.
8. Руководство по диагностике, лечению и профилакти-
ке бронхиальной астмы / под ред. А. Г. Чучалина. -М., 2005.
9. Скуп Д., Уэст Д. Основы аналитической химии : пер. с англ. - М. : Мир, 1979.
10. Смоленов И. В., Смирнов Н. А. Подходы кдиагнос-тике заболеваний, сопровождающихся свистящими хрипами // Consilium Medicum. - 2001. - Приложение. - С. 21-24.
11. Терещенко С. Ю. Особенности структуры плазматических мембран при атопических заболеваниях у детей, роль в патоненезе//Бюл. СО РАМН. -2003. -№2(108).-С. 36-40.
12. Федосеев Г. Б. Механизмы обструкции бронхов. -СПб. : Мед. информ. аг-во, 1995.
13. Yagi R., Omhawa Н., Chishi N. //Analyt. Biochem. -1979. - Vol. 95. - P. 351-358.
