CC BY
190
экологический мониторинг. Барнаул, 1996. С. 265-267.
8. О состоянии и охране окружающей среды Российской Федерации в 2013 году. Государственный доклад Федерального центра геоэкологических систем по заказу Министерства природных ресурсов и экологии Российской Федерации. С. 363 [http://www.ecogosdoklad.ru/2013/Default.aspx] (Архивировано из первоисточника 10.01.2015).
9. Определитель лишайников СССР. Л., 1971. Вып.1. 411с. 1974. Вып.2. 283с. 1973. Вып.3. 275с. 1977. Вып. 4. 343с. 1978. Вып.5. 304с.
10. Определитель лишайников России. СПб. 1996. Вып.6. 202с. 1998. Вып.7. 165с. 2003. Вып.8. 275с. 2004. Вып.9. 338с. 2008. Вып. 10. 515с.
11. Naesborg R.R. Taxonomic revision of the Lecania cyrtella group based on molecular and morphological evidence / Naes-borg R.R. // Mycologia. 2008. Vol. 100. № 3. P. 397-416.
12. Mycobank [www.mycobank.org (дата обращения 25.12.2014).
13. Index Fungorum [www.indexfungorum.org] (дата обращения 25.12.2014).
14. Седельникова Н.В. Лишайники Алтая и Кузнецкого нагорья. / Седельникова Н.В. Новосибирск: Наука, 1990. 174с.
15. Davydov E.A. The first checklist of lichens, lichenicolous, and allied fungi of Altaisky krai (Siberia, Russia). / Davydov E.A. // Mycotaxon. 2014. Vol. 127. p. 231. [http://dx.doi.org/10.5248/127.231 с дополнениями http://ssbg.asu.ru/lichens/docs] (дата обращения 25.12.2014).
Об авторе
Романова Е.В. - кандидат биологических наук, научный сотрудник Центрального сибирского ботанического сада СО РАН, [email protected]
УДК 634.711
ОСОБЕННОСТИ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ЕЖЕВИКИ И МАЛИНО-ЕЖЕВИЧНЫХ ГИБРИДОВ
Д.Н. Сковородников, Н.В. Милехина, Ю.Н. Орлова
В работе продемонстрирован положительный эффект регулятора роста цитокининовой природы ряда дифенилмочевины - CPPU на введение в культуру in vitro ежевики и малино-ежевичных гибридов. На этапе пролиферации большинство исследуемых сортов успешно размножались на питательной среде МС в присутствии 6-БАП в концентрации 1 мг/л. Ключевые слова: ягоды, малина, тканевые культуры, тональное микроразмножение, питательная среда
Введение
В последние годы среди населения увеличился интерес к таким нетрадиционным культурам как ежевика и малино-ежевичные гибриды, обладающие большой урожайностью, высокими вкусовыми качествами; и которые в отличие от распространенной у нас малины в меньшей степени подвержены заболеваниям [4].
Традиционно эти растения размножают верхушечными отводками, корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, делением куста. Перечисленные способы имеют низкий коэффициент размножения и не дают возможности освобождения растений от вирусной инфекции.
Метод культуры тканей - современный биотехнологический способом размножения, позволяющий многократно увеличивать коэффициент размножения и получать оздоровленный посадочный материал.
Цель исследования: оптимизировать условия клонального микроразмножения ежевики и малино-ежевичных гибридов.
Объекты и методы исследования
Работа проводилась в научно-образовательном центре биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии.
Объекты исследования Объектами исследования являлись 2 сорта ежевики (Торнфри и Торнлесс Эвергрин) и 4 ма-лино-ежевичных сорта (Бойсенберри, Тэйберри, Логанберри и Санберри).
Подготовка растительного материала для введения в культуру in vitro: нарезку черенков ежевики и малино-ежевичных гибридов осуществляли осенью за несколько дней до изолирования эксплантов (сентябрь). Заготовленный материал хранили в полиэтиленовых пакетах для предотвращения его подсыхания в бытовом холодильнике при температуре 4°С.
Перед изолированием черенки нарезались на сегменты с одной почкой длинной 2-4 см. Для удобства работы черенок расщепляли вдоль по центру, что предотвращало его проворачивание на предметном столике бинокуляра.
Стерилизация материала: нарезанные черенки стерилизовали в 0.1% растворе мертиолята (орто-этилртутьтиосали-цилат натрия, C9HgHgNaO2S — органическое соединение ртути ароматического ряда) и 0,3% SDS (додецилсульфат натрия) в качестве поверхностно-активного вещества в течение 3 минут на шейкере, с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.
После стерилизации черенки обсушивали на стерильных кружках фильтровальной бумаги в ламинарном шкафу.
Изолирование эксплантов: Изолирование проводили в условиях ламинарного шкафа ЛШ-2. Для вычленения эксплантов использовали бинокулярный микроскоп МБС-9. В качестве источников эксплантов испытывали целые почки (5-8 мм) без нескольких кроющих чешуй, которые отсекались от черенка с помощью глазного скальпеля.
Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге-Скуга (1962) [6] в пробирках Флорин-ского с добавлением в качестве источника цитокинина 0.2 мг/л CPPU: Ж-(2-хлор-4-пиридил)-Ж-фенилмочевина.
На этапе пролиферации МS с увеличенной в 3 раза концентрацией хелата железа и добавлением 1мг/л 6-БАП. Препарат «Компливит» (ОАО «Фармстандарт - УфаВИТА») в измельченном состоянии вводили в питательную среду в количестве 2г/л на этапе размножения.
418
Вестник Брянского госуниверситета. 2015(3)
Результаты и обсуждения
В качестве источника цитокинина на этапе введения в культуру in vitro ежевики применяют 6-БАП [3,2]. В наших исследованиях мы использовали для этих целей производное дифенилмочевины - CPPU, которое успешно применяется в нашей лаборатории для размножения ремонтантных форм малины [1].
Для всех 6 сортов был получен положительный результат на этапе культивирования первичных эксплантов. Частота контаминации при стерилизации мертиолятом варьировала от 11% до 50%. По количеству регенерировавших побегов на среде МС с добавлением CPPU в концентрации 0,2 мг/л испытанные сорта существенно не отличались и в среднем этот показатель составил 1,4 дополнительных побега. Самые крупные побеги формировались у сорта Торнлесс Эвергрин (9,9мм), а самые мелкие у гибрида Логанберри (5,3мм) (табл. 1).
Таблица 1 - Результаты введения в культуру in vitro ежевики и малино-ежевичных гибридов
№ п.п. Сорт Дата изолирования Количество изолированных эксплантов, шт. Частота контаминации, % Количество почек на эксплант, шт. Высота растений, мм
Ежевика
1 Торнфри 25.09 45 11,1 1,4±0,15 7,7±0,30
2 Торнлесс Эвергрин 24.09 40 50 1,3±0,12 9,9±0,53
Малино-ежевичные гибриды
3 Бойсенберри 24.09 50 38,0 1,6±0,13 8,2±0,48
4 Тайберри 25.09 47 12,8 1,5±0,09 6,5±0,27
5 Санберри 24.09 47 19,1 1,7±0,11 7,7±0,39
6 Логанберри 21.09 43 44,2 1,1±0,06 5,3±0,28
Уже на первом этапе культивирования, сорта проявили морфологические отличия. Изолированные почки Торнлесс
Рис. 1 Первичные экспланты ежевики сорта Торнлесс Эвергрин
Экспланты сорта Торнфри образовывали крупные, темно-зеленые листья с характерной зубчатой пластинкой (Рис. 2). Остальные сорта имели на первом этапе культивирования схожие признаки.
Рис. 2 Первичные экспланты сорта Торнфри
Для размножения ежевики и малино-ежевичных гибридов использовали питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга с добавлением 6-бензиламинопурина (цитокинин) в концентрации 1 мг/л. Коэффициент размножения варьировал от 2,3 у гибрида Логанберри и 8,7 у гибрида Санберри (в среднем 5-6). На этом этапе еще более четко проявились морфологические особенности каждого генотипа.
Таблица 2 - Коэффициент размножения и высота растений в культуре in vitro
№ п.п. Сорт Коэффициент размножения Высота растений, мм
Ежевика
1 Торнфри 4,8 ± 0,68 20,9 ± 1,21
2 Торнлесс Эвергрин 3,4 ± 0,64 12,9 ± 1,33
Малино-ежевичные гибриды
3 Бойсенберри 7,5 ± 0,63 17,6 ± 1,39
4 Тайберри 5,3 ± 0,45 11,7 ± 0,89
5 Санберри 8,7 ± 0,83 18,8 ± 1,27
6 Логанберри 2,3 ± 0,31 18,2 ± 1,33
При оценке 256 сортов рода Rubus в репозитарии Барборой Рид было установлено, что лучшей способностью к пролиферации побегов обладают сорта ежевики чем малины красной [5].
Для ежевики сорта Торнлесс Эвергрин был заложен эксперимент по изучению влияния высоких концентрации 6-БАП (2,5 мг/л) на пролиферацию побегов. Увеличение количества 6-БАП в питательной среде привело к более интенсивному ветвлению растений и образованию более крупных побегов чем в варианте с 6-БАП - 1 мг/л. Однако следует отметить, что повышенные концентрации регулятора роста при продолжительном культивировании растений приводили к появлению признаков гипероводненности (витрификации). По-видимому, кратковременное культивирование побегов ежевики при высоких концентрациях с последующей сменой на более низкие позволит уменьшить отрицательное влияние цитокинина на клетки растений.
Выводы:
1. Оптимальным источником цитокинина для введения ежевики в культуру in vitro является CPPU в концентрации 0,2 мг/л;
2. В зависимости от сорта растения имели сортоспецифическую реакцию на вводимые в состав питательной среды гормоны, что проявлялось в разной способности к регенерации побегов, силе их роста и качестве материала.
In study the positive effect of a regulator of growth cytokinin of diphenylurea range - CPPU on introduction in culture in vitro a blackberry and raspberry-blackberry hybrids is shown. The majority of investigated grades on nutrient medium МС at presence 6-BAP in concentration of 1 mg/l successfully bred.
Keywords: small fruits, raspberry, tissue culture, micropropagation, nutrient media.
Список литературы
1. Сковородников Д.Н. Особенности клонального микроразмножения ремонтантных форм малины / Д.Н. Сковородников, И.В. Казаков // Садоводство и виноградарство. М. 2012. - №3 - С. 39-42.
2. Соловых Н.В. Использование биотехнологических методов для повышения адаптивного потенциала представителей рода Rubus / Н.В. Соловых, В.М. Тюленев // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства / Всерос. науч.-исслед. ин-т виноградарства и виноделия. - Новочеркасск, 2005. - С. 121-126.
3. Упадышев, М.Т. Клональное микроразмножение ежевики и малины черной / М.Т. Упадышев, В.А. Высоцкий // Новое в ягодоводстве Нечерноземья. - М., 1990. - С. 56-65.
4. Якимов, В.В. Ежевика в России / В. В. Якимов - Челябинск: Сад и огород Челябинский Дом печати, 2010. - 311.
5. Reed, B.M. Improved survival of in vitro-stored Rubus germplasm B.M. Reed, // J. Am. Soc. Hortic. Sc, 1993; Vol.118, N 6. - P. 890-895.
6. Murashige Т. & Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum.- 1962.- V.15, N. 13.- P. 473-497.
Об авторах
Сковородников Д.Н. - кандидат сельскохозяйственных наук старший научный сотрудник Брянского государственного аграрного университета
Милехина Н.В. - кандидат сельскохозяйственных наук, доцент Брянского государственного аграрного университета
Орлова Ю.Н. - студентка 4-го курса Брянского государственного аграрного университета
