CC BY
44
УДК 616.127-008.853
ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ КИСЛОРОД-НЕЗАВИСИМОЙ БИОЦИДНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ У КРЫС В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕТАБОЛИЧЕСКОГО ИНФАРКТА МИОКАРДА
Л.В.ВОХМИНЦЕВА, Н.Н.МАЯНСКАЯ, С.Д. МАЯНСКАЯ,
А.А. ПОПОВА, Л.Д. ХИДИРОВА, В.И.ШАРАПОВ*
Ключевые слова: кислород-независимая биоцидность
Известно, что особенности клинического течения инфаркта миокарда, а также развитие его осложнений в большой степени определяются структурно-функциональным состоянием лизосо-мального аппарата клеток сердечной мышцы и полиморфноядерных лейкоцитов [3]. Последние в свою очередь находятся под контролем эндокринной системы организма.
В настоящее время не подлежит сомнению вовлечение глю-кокортикоидных гормонов в начальной стадии развития острого инфаркта миокарда [1]. Гормональные эффекты становятся особенно важными в свете того, что они сопровождаются системными нарушениями биоцидности нейтрофилов [12], включая ее кислород-независимый компонент, важной частью которого является их лизосомальный аппарат. Лизосомы при сбое гормональной регуляции могут освобождать активные кислые гидрола-зы в цитозоль и далее во внеклеточное пространство и циркулирующую кровь и тем самым инициировать процессы клеточного повреждения. При этом возникают такие частые и грозные осложнения, как метаболический инфаркт миокарда (МИМ). Однако роль лизосомальных ферментов в патогенезе некоронарогенных повреждений миокарда до сих пор неясна.
Цель исследования — изучение особенностей изменений активности лизосом миокарда и нейтрофилов крови в эксперименте при моделировании МИМ у крыс.
Материал и методы. В исследованиях использовали 60 крыс-самцов Вистар, полученных из вивария НГМУ, массой 180220 г. МИМ воспроизводили у животных подкожным введением однократно или в течение недели ежедневно раствора адреналина (0,2 мл 0,1% раствора) интактным крысам или крысам с аллокса-новым диабетом (100-120 мг аллоксана на крысу п/к). Инфаркт миокарда подтверждали с помощью анализа данных ЭКГ, а также с помощью гистологического контроля. Животных под эфирным наркозом декапитировали на 1, 3 и 14 сутки эксперимента - по 10-12 крыс на каждый срок. От опытных животных брали для исследования цельную кровь, сыворотку крови и ткани сердца.
Для приготовления гомогената ткань сердца предварительно измельчалась ножницами, растиралась в ступке с истолченным стеклом и суспендировалась в 9 объемах 0,25 М раствора сахарозы с 0,001М ЭДТА, рН 7,4. Стекло и оставшиеся не разрушенными со-единительно-тканные элементы удаляли центрифугированием при охлаждении на центрифуге ЦЛР-31 (2000 об/мин*5 мин). В супернатанте определяли свободную неседиментируемую (после повторного центрифугирования при 105000 д.) и удельную (в присутствии 0,1% раствора тритона Х-100) активность лизосомальных ферментов.
Определение уровня белка в гомогенате сердца вели по методу O. Lowry с соавт. [11], после предварительной инкубации в
0,1% растворе NaOH в течение 1 ч при комнатной температуре.
Для оценки активности воспалительного процесса, сопровождающего МИМ проводили определение содержания цитоки-нов интерлейкина 1р (ИЛ-1р), интерлейкина 6 (ИЛ-6) и тумор некротизирующего фактора (ТНФ-а) в сыворотке крови иммуно-ферментным методом с использованием реагентов ProCon («Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия). Все измерения проводили с помощью автоматического фотометра вертикального сканирования («Star-30», Ken, USA) при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом. Количественное содержание ИЛ-1р, ИЛ-6 и ТНФ-а в сыворотке крови выражали в пкг/мл. (Норма - 50 пкг/мл).
В сыворотке крови и в гомогенате ткани сердца контрольных и опытных крыс на 1, 3 и 14 сутки после воспроизведения МИМ изучали активность лизосомальных ферментов (ЛзФ): кислой фосфатазы [9] и катепсина D, методом A.J Barrett [8].
Статистическая обработка данных осуществлялась по общепринятым методикам пакетом прикладных программ Statistica 6.0, Microsoft Excel 7.0 на ПК PC Pentium (III)-650 МГц MMX.
* Новосибирский ГМУ, 630091, г. Новосибирск, ул. Красный пр-т, д. 52.
Результаты. Электрокардиографический контроль выявил следующие изменения у экспериментальных животных. Через 24 часа после введения адреналина на ЭКГ наблюдалось усиление тахикардии до 240 уд/мин, изменений сегментов не выявлялось. Через неделю после ежедневного введения адреналина или адреналина на фоне аллоксана на ЭКГ отмечалась депрессия сегмента 8Т и определялся непостоянный, отрицательный зубец Т, что, по-видимому, свидетельствовало о наличии диффузного или мелкоочагового характера поражения миокарда.
Гистологический контроль срезов из сердечной мышцы крыс с МИМ показал, что морфологические изменения через сутки после введения адреналина выражались набуханием кардиомиоцитов, появлением венозной гиперемии, усилением агрегации тромбоцитов в коронарных сосудах. Через неделю после начала введения адреналина наблюдались расстройства гемодинамики за счет образования агрегатов форменных элементов крови в артериолах. Процесс носил диффузный характер. Кроме того, было выявлено поражение кардио-миоцитов, которое носило островковый характер, отмечалась частичная потеря поперечно-полосатой исчерченности. Полиморфно-клеточная инфильтрация с преобладанием лейкоцитов концентрировалась вдоль границ островков измененных кардиомиоцитов. Можно сделать вывод, что с помощью гормональных перестроек, имитирующих стрессорные изменения, воспроизводятся изменения, характерные для МИМ.
Лейкоциты и макрофаги, накапливающиеся в миокарде при его повреждении, являются основным источником таких воспалительных цитокинов, как ИЛ-1, ИЛ-6 и ТНФ-а [7]. Интерлейкины и ТНФ-а вызывают резкие сосудистые расстройства в зоне воспаления [10]. Это связано с тем, что нейтрофилы и макрофаги не только образуют, но и сами же подвергаются их действию, а именно активируются и начинают вести себя еще более агрессивно по отношению к эндотелию сосудов.
Концентрация провоспалительных цитокинов в крови отражает тяжесть течения ИМ. К тому же гипоксия, сопровождающая ИМ, усиливает базальную и липополисахарид-индуцированную экспрессию (ЛПС) ТНФ-рецепторов в лейкоцитах. Отсюда целесообразно определение концентрации этих цитокинов в динамике течения МИМ у опытных животных.
Содержание ИЛ-1р постепенно нарастало параллельно с увеличением деструктивных нарушений в миокарде у крыс с МИМ. На третьи сутки концентрация ИЛ-1р было выше, чем в контроле почти на 40% (р<0,01), на 14 сутки - на 85% (р<0,01) (табл. 1). Концентрация ТНФ-а в крови у этих животных также нарастала в соответствии с динамикой биоцидности нейтрофилов по мере развития изменений в миокарде. В 1 сутки МИМ содержание цитокина возрастало на 33%, на третьи сутки - почти вдвое. На 14 сутки уровень ТНФ-а был уже в 2,3 раза выше, чем в контроле. Выработка ИЛ-6 начинает возрастать гораздо позже -на третьи сутки МИМ. На этом сроке содержание ИЛ-6 превышало контрольный уровень ~ в три раза, на 14 день - в 5,5 раз. Эти данные говорят о том, что у крыс с МИМ воспалительные изменения сохраняются до конца эксперимента.
Таблица 1
Изменения содержания интерлейкина-1р в сыворотке крови у крыс в динамике развития МИМ
В пкг/мл Контроль МИМ 1 сутки МИМ 3 сутки МИМ 14 сутки
Ил-1в 6,0+0,18 7,4+0,67 8,3+0,64* 11,1+0,78*
Ил-6 2,0+0,08 2,8+0,08 5,8+0,13* 11,0+0,38*
ТНФа 5,5+0,03 7,3+1,09* 10,7+1,11* 12,6+1,23*
* - обозначены величины, достоверно отличающиеся от контроля, р<0,01; число экспериментальных животных в каждом опыте - 10
Азурофильные гранулы нейтрофилов содержат большое количество кислых гидролаз, имея полный набор ферментов, характерный для лизосом. Таким образом, лизосомы и лизосомальные ферменты являются важной частью кислород-независимой биоцидности клеток - эффекторов воспаления - нейтрофилов и макрофагов. Однако их роли в развитии повреждения миокарда до настоящего времени уделяется мало внимания, хотя в настоящее время уже хорошо известно, что выявление повышенного содержания лизосомальных ферментов в крови является ранним и весьма чувствительным тестом, свидетельствующим о патологических изменениях в тканях, а конкретно - об их деструктивном компо-
ненте [6]. Лизосомальные ферменты, попавшие в кровь, сами, включаясь в цепной цитолитический процесс, могут вызвать неблагоприятные патологические изменения в организме и вследствие этого являются важным патогенетическим звеном многих заболеваний. С этой точки зрения гиперферментемия при инфаркте миокарда может рассматриваться как диагностический и прогностический признак, характеризующий как наличие самой патологии, так и тяжесть ее клинического течения. Учитывая эти обстоятельства, на следующем этапе работы исследовали изменения активности лизосомальных ферментов в гомогенате сердечной мышцы и в сыворотке крови в динамике развития МИМ.
В условиях наиболее щадящей гомогенизации в среде изотонического раствора сахарозы определялась так называемая свободная активность; после центрифугирования гомогената при 105000g получалась надосадочная фракция, в которой можно было определить неосаждаемую активность лизосомальных ферментов; наконец, в присутствии тритона Х-100 определялась общая (или удельная) активность лизосомальных гидролаз.
В эксперименте одной группе крыс вводили небольшую дозу аллоксана (100-120 мг/1кг массы животного) который снижает синтез инсулина, однако не вызывает явно проявляющегося диабета. Второй группе вводили однократно адреналин, третьей - через 5-7 дней после аллоксана вводили адреналин в течение 6 дней. Именно в этом случае аллоксан оказался предрасполагающим фактором к развитию эндокринно-метаболических изменений, характерных для МИМ. Наиболее точную информацию можно получить при анализе отношения свободной активности к общей. Оказалось, что все виды указанных воздействий на организм крыс значительно увеличивали отношение свободной активности кислой фосфатазы к общей, по сравнению с контролем: в 1,4 раза - аллоксан, в 1,6 раза - однократное введение адреналина, в 1,8 раза под влиянием адреналина, введенного в течение 6 дней на фоне аллоксана, что указывает на возрастающую степень лабили-зации лизосомальных мембран (P<0.05) (табл. 2).
Таблица 2
Изменения активности кислой фосфатазы в сердечной мышце и сыворотке крови крыс под влиянием адреналина и аллоксана
Условия опытов Белок Свободн. Общая Своб/общ Сыворотка
Контроль 30) 10,5+0,5 3,9+0,4 11,1+0,6 0,38+0,03 27,6+1,62
Адренал.(18) 10,8+0,6 5,3+0,3* 8,1+0,2* 0,53+0,03* 37,4+2,46*
Аллоксан(19) 9,9+0,5 4,1+0,2 6,9+0,5* 0,62+0,06* 37,2+2,31*
Ал+Адр (14) 11,1+0,7 6,5+0,5* 9,7+0,8 0,67+0,05*# 45,9+2,41*#
Примечание: в скобках - число животных; * - достоверные отличия от интактных животных (Р<0,05); # - достоверные отличия от показателей, крыс после введения аллоксана или однократного введения адреналина интактным животным, (Р<0.05)
В сыворотке крови также значительно возрастает активность кислой фосфатазы: в среднем на 35% под влиянием аллоксана или адреналина. Но длительное введение адреналина на фоне предварительной инъекции аллоксана увеличивало активность кислой фосфатазы в сыворотке крови по сравнению с контролем на 66%. Эта величина достоверно отличалась и от контроля, и от показателей, полученных после введения аллоксана или адреналина интактным животным (Р<0,05) (табл. 2).
Результаты определения активности катепсина D в аналогичных условиях показали следующее. При введении адреналина интактным крысам или на фоне аллоксана, так же как и при введении аллоксана, свободная активность катепсина Э, практически не отличалась от контрольных значений. Однако величина удельной активности катепсина Э в гомогенате из ткани сердечной мышцы значительно уменьшалась под влиянием как однократного адреналина, так и, особенно, под влиянием длительного введения адреналина на фоне аллоксана (Р<0,05).
В этих условиях величина удельной активности катепсина Э снижалась в 1,5 раза, по сравнению с контролем (табл 3). Соответственно, на 25-50% повышалась величина отношения свободной активности катепсина Э к удельной активности под влиянием адреналина и адреналина с аллоксаном. Определение активности катепсина Э в сыворотке крови показало, что однократное введение адреналина интактным животным не влекло за собой увеличения сывороточной активности фермента. В отличие от этого аллоксан увеличивал выход катепсина Э в кровь, но в меньшем размере, чем под влиянием адреналина, введенного в течение 6 дней
после аллоксана. В этих условиях активность фермента повышалась в 2,7 раза, по сравнению с одним аллоксаном (Р<0,05).
Таблица 3
Изменения активности катепсина О в сердечной мышце и сыворотке крови крыс под влиянием адреналина и аллоксана
Условия опытов Свободная Общая Своб/общ Сыворотка
Контроль (30) 0.38+0.03 1.79+0.14 0.249+0.02 Нет
Адреналин (18) 0.34+0.04 1.36+0.09* 0.310+0.05* Нет
Аллоксан(19) 0.40+0.02 1.77+0.19 0.247+0.03 1.26+0.66
Ал+Адр (14) 0.44+0.02 1.17+0.06* 0.382+0.01*# 3.38+0.56#
Примечание: в скобках - число животных; * - достоверные отличия от интактных животных (P<0,05); # - достоверное отличие показателей, полученных при введении адреналина в течение 6 дней на фоне аллоксана
от показателей, полученных при введении аллоксана, (P<0,05)
Второй очень важный вопрос: каковы источники ЛзФ, появляющихся в крови при поражениях миокарда? Одним из источников может быть сам поврежденный миокард. Но значительным источником ЛзФ в крови при повреждениях миокарда любого генеза являются нейтрофилы крови, а также лейкоциты, мигрировавшие в очаг повреждения. Усиление сывороточной активности лизосомальных ферментов говорит о том, что при этом усиливается секреция лизосомальных белков из нейтрофилов крови. Это подтверждают и данные предварительного цитохимического исследования изменений биоцидной активности нейтрофилов у крыс, у которых перестройку эндокриннометаболических взаимоотношений вызывали снижением продукции инсулина с помощью аллоксана и длительным введением адреналина. Основная роль лизосомальных ферментов при гормональном МИМ состояла не в быстром высвобождении из клеточных структур и прямом повреждающем влиянии на ткани, как это бывает при окклюзионном инфаркте миокарда [2], а в более медленной, постепенной активации лизосом через потенцирование альтерации эндотелия сосудов и кардиомиоцитов агрегированными лейкоцитами, тромбоцитами и продуктами их деятельности (гистамином, серотонином, бета-тромбглобулином, тромбоксаном А2 и др. [4,5]).
Литература
1. Благосклонная Я.В. и др. // РМЖ. 2001. Т.9. № 2. С.67-81.
2. Маянская С.Д. Воспалительные реакции при ишемической болезни сердца и подходы к их коррекции: Автореф. дис. д. м.н. Новосибирск. 1999.
3. Маянская Н.Н. и др. // Тер. архив. 1994. №4. С. 36-39.
4. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. Нижний Новгород, Изд-во НГМА. 2003. 271 с.
5. Маянский Д.Н. Лекции по клинической патологии // М.: ГЭОТАР-Медиа. 2008. 463с.
6. Панин Л.Е., Маянская Н.Н. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении. Новосибирск; Наука. 1987. 198 с.
7. Фрейдлин И.С., Назаров П.Г. // Вест. РАМН. 1999. № 5. С.28-33.
8. Barret A.J. Lysosomal enzymes / In «Lysosomes a Laboratory Handbook», Dingl J.T. (Ed), Ameterdam-London Publ. Co. 1972. P.46-120.
9. De Duve C., Wattiaux R. // Ann. Rev. Physiol. 1966. Vol.28. P435-492.
10. Dinarello C. // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1997. Vol.11. №3. P.91-103.
11. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R. // J.Biol. Chem. 1951. Vol.193. №1. P.265-275.
12. Webster J.I. // J.I. Webster L. Tonelli, E.M. Sternberg //Ann Rev Immunol. 2002. Vol. 20. P.125-163.
УДК 612.018
ВЗАИМОСВЯЗЬ УРОВНЯ ПОЛОВЫХ СТЕРОИДОВ В МОЗГЕ С ПОВЕДЕНИЕМ И ТРЕВОЖНОСТЬЮ У САМОК КРЫС С РАЗНЫМ
ГОРМОНАЛЬНЫМ СТАТУСОМ
В.А. САШКОВ*
Изучен уровень половых стероидов не только в крови, но и в лимбических структурах мозга у самок крыс с разным гормональным статусом в связи с организацией тревожности и поведения в «открытом поле». Выявлена избирательная взаимосвязь двигательной и исследовательской ак-
*
Институт возрастной физиологии РАО, 119121, г. Москва, ул. Погодинская, д. 8
