CC BY
48
Б >
а
So L 2
о і
Я--
Щ а
х с mt:
о
а
I-
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ К
ГЕНОТИПАХ HCV-ИНФЕКЦИИ *
v
и
Пьянников В. В.1, Ахмедов В. А.2, Горчаков В. В.2, Васькина Т. В.3 т
1 Городская поликлиника № 3, Омск X
2 Омская государственная медицинская академия ^
3 Клинический диагностический центр, Омск
Ахмедов Вадим Адильевич 644042, Омск, просп. Маркса, д. 37, кв. 126 Тел.:8 (3812) 31-96-97 E-mail: [email protected]
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Оценить особенности иммунного ответа пациентов с различными генотипами HCV, проживающих на Юге западной Сибири — в Омской области. Материалы. Под наблюдением находилось 130 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС). Из них мужчин — 95, женщин — 35. Результаты. На территории Юга Западной Сибири — Омска и Омской области генотипы 1 и 3 HCV встречаются с одинаковой частотой и являются наиболее распространенными у больных ХВГС более молодого возраста, при этом у пациентов с генотипом 1 HCV доминирует подтип вируса 1b. У пациентов, инфицированных генотипами 1 и 3 HCV, отмечается более выраженный системный воспалительный ответ, приводящий к массивным воспалительно-некротическим изменениям в паренхиме печени, с последующим повреждением гепатоцитов за счет межклеточных взаимодействий клеток иммунной системы и цитокинов, и, соответственно, ведущий к развитию цирроза печени в более раннем возрасте.
SUMMARY
The aim of the study was to investigate the features of immune response in patients with HCV infection on the South of Western Siberia. Materials. The 130 patients with different genotips of HCV infection were investigated (95 men and 35 women). Results. On the territory of the South of Western Siberia the 1 and 3 genotips of HCV infection were present especially in young men and women and 1b subtype was dominated. In patients with 1 and 3 genotips of HCV infection was occurred the massive inflammatory response with intensive necrotic proinflammatory cytokins damages of the liver tissue and high cirrotic occurring in young age.
В Российской Федерации (РФ) наиболее распространенным является генотип 1Ь, далее с убывающей частотой — 3а, 1а и 2а вируса гепатита С (HCV) [1; 3]. Однако большинство работ, представленных для изучения распространения HCV на территории РФ, затрагивали ее европейскую часть, более того, при исследовании в разных регионах данные у различных исследователей отличались между собой. Поэтому в связи с недостаточной изученностью распространенности различных генотипов HCV в Западной Сибири, а также в связи с противоречивостью данных в зависимости от местности изучение генотипов HCV, циркулирующих на юге Западной Сибири — в Омской области, позволило бы расширить представление о клинических
проявлениях и эпидемиологическом прогнозе в плане формирования тяжелых форм поражения печени.
Цель исследования — оценить особенности иммунного ответа пациентов с различными генотипами ЖУ проживающих на юге Западной Сибири — в Омской области.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под наблюдением находилось 130 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС). Из них мужчин — 95, женщин — 35. Средний возраст составил 32,58 ± 0,86 года (от 15 до 70 лет). Среди больных в анамнезе употребление наркотиков было у 18 (14,46%), операции, гемотрансфузии и прочие
m
m
№05/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
и эзофагогастродуоденоскопию (ФГДС) (для исключения выраженной патологии желудка и двенадцатиперстной кишки).
Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на наличии клинико-инструментальных признаков гепатомегалии и спленомегалии (верифицировались по данным УЗИ) и наличии по данным УЗИ диффузных изменений в паренхиме печени. Также всем больным проводилось для верификации диагноза исследование маркеров вирусной инфекции: HCV (aHCV, aHCVIgM, aHCVcoreNS) и HBV (HBsAg, aHBcor, aHBcorIgM, HBeAg, aHBe). У всех больных была исключена сопутствующая инфекция вирусом гепатита В. Кроме того, всем больным проводилось ПЦР с генотипированием и из них 68 пациентам — с определением вирусной нагрузки. Для определения генотипа и вирусной нагрузки использовались коммерческие тест-системы «АмплиСенс — HCV-генотип» и «АмплиСенс — HCV-Монитор» соответственно производства фирмы ООО «ИнтерЛабСервис», Россия, Москва.
Нами также были изучено содержание CD3, CD4, CD8 (ЦТЛ), CD16, CD95 (использовались коммерческие тест-системы производства фирмы ООО «Сорбент», Россия, Москва), TNF-a, интерлейкина-4 (IL-4) (использовались коммерческие тест-системы производства фирмы ЗАО «ВекторБест», Россия,
Таблица 1
ОБЩЕКЛИНИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ БОЛЬНЫХ
Показатели Генотип 1 Генотип 2 Генотип 3 Норма
Общий билирубин (мкмоль/л) 15,01 ± 3,2 7,87 ± 1,44 16,15 ± 2,2 8,5 - 20,5
АлАТ (ед/л) 57,03 ± 11,43 62,62 ± 11,6 124,72 ± 11,72 8 - 54
АсАТ (ед/л) 34,03 ± 5,75 35,3 ± 4,23 54,18 ± 4,84 16 - 40
ЩФ (ед/л) 190,3 ± 29,42 193,74 ± 24,77 187,95 ± 20,35 0 - 315
ГГТП (ед/л) 49,7 ± 20,11 33,17 ± 10,95 40,07 ± 12,46 0 - 45
Глюкоза (ммоль/л) 4,29 ± 0,1 5,2 ± 0,64 4,44 ± 0,13 3,3 - 5,5
Общий белок (г/л) 78,34 ± 2,85 76,8 ± 0,82 77,07 ± 1,86 65 - 85
Тимоловая проба (ед) 4,86 ± 1,43 7,18 ± 1,65 3,17 ± 0,47 1 - 4
Холестерин (ммоль/л) 4,38 ± 0,19 4,64 ± 0,21 4,52 ± 0,32 3,7 - 7,0
Нагрузка (млн копий/мл) 1,66 ± 0,35 2,69 ± 0,33 1,78 ± 0,41 —
Больные с ЦП (человек) 2 — 2
вмешательства — у 17 (13,08%), наличие факторов риска не установлено у 95 человек (73,08%). Генотип 1 был выявлен у 59 пациентов (45,38%), генотип 2 — у 9 пациентов (6,92%), генотип 3 обнаруживался у 62 пациентов (47,69%). Сочетание генотипов 1 и 3 было представлено в 5 случаях (3,85%). Среди пациентов с генотипом 1 подтип 1а встречался в 12 случаях (9,23%), подтип 1Ь — в 47 случаях (36,15%). Средний возраст больных ХГС с поражением генотипом 1 вируса составил 33,04 ± 1,4 года, с генотипом
2 - 45,11 ± 5,64 года, с генотипом 3 - 30,48 ± 0,75 года. Среди больных ХВГС с генотипами 1 и 3 было по 2 человека в каждой группе с впервые выявленным циррозом печени.
До момента исследования больные не получали стандартных схем этиотропной противовирусной терапии. У всех пациентов изучали в динамике клиническое течение заболевания, изменения общих анализов крови и мочи, проводили биохимические исследования крови: определяли уровень общего белка, активность аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП), общего холестерина, концентрацию общего, прямого и непрямого билирубина, тимоловую пробу. Инструментальные методы диагностики включали в себя ультразвуковое исследование органов брюшной полости (УЗИ)
Новосибирск), а также содержание ИФН-а и ИФН-у, как спонтанного, так и стимулированного (использовались коммерческие тест-системы производства фирмы ЗАО «ВекторБест», Россия, Новосибирск).
Достоверность различий средних значений оценивали по критерию t Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05. Все расчеты выполнены на персональном компьютере с использованием программы SPSS v. 11.5.0 for Windows.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По результатам общеклинических методов исследования были получены следующие данные (табл. 1). При генотипе 2 HCV содержание билирубина у пациентов было достоверно ниже в сравнении с генотипами 1 и 3 (р < 0,05), между которыми в отношении этого показателя достоверных различий получено не было.
При отсутствии достоверных различий между генотипами 1 и 2 HCV цитолиз при генотипе 3 вируса был достоверно выше, чем в двух других группах (р < 0,01 для показателей АлАТ и р < 0,05 для показателей АсАТ). Содержание глюкозы и общего белка у больных всех групп не показало достоверных различий, что указывало на компенсированную функцию печени у большинства исследуемых пациентов.
Совершенно неожиданными оказались результаты показателей тимоловой пробы, которые были достоверно более высокими у больных с генотипом
2 НСУ в сравнении с больными с генотипом
3 НСУ (р < 0,05). Хотя достоверные различия были получены только между группами пациентов с двумя данными генотипами, следует отметить, что сравнение показателя не выявило достоверных различий у больных ХВГС с генотипами 1 и 3. В отношении сравнения показателей данной флоккуляционной пробы у больных ХВГС, инфицированных 1 и 2 генотипами НСУ, была выявлена явная тенденция к более высоким показателям тимоловой пробы у больных ХВГ С с генотипом
2 НСУ. Данный феномен может свидетельствовать, на наш взгляд, только о нарушении белково-синтетической функции печени, ставя под сомнение наличие «более благоприятного клинического течения» при некоторых генотипах вируса [11].
При исследовании других молекулярнобиологических особенностей вируса НСУ было установлено, что у больных с генотипом
1 НСУ вирусная нагрузка была достоверно ниже в сравнении с пациентами, инфицированными генотипом 2 НСУ (р < 0,05). Причем вирусная нагрузка у пациентов с генотипом 2 НСУ была самой высокой среди всех групп сравнения. Но если различия с группой больных, пораженных генотипом 1 НСУ и генотипом 2, были достоверными, то между группами с генотипами 2 и 3 они не являлись достоверными (р > 0,05). Различий в выраженности вирусной нагрузки между генотипами
Б >
а
So L 2
О £ £
Щ а h £ X с mt: о а
I-
U
га
i_
Б
га
й
<и
т
S
X
S
<
Таблица 2
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ БОЛЬНЫХ
Показатели Генотип 1 Генотип 2 Генотип 3 Норма
CD3 74,34 ±1,37 70,12 ± 1,87 76,4 ±1,03 65 - 85%
CD4 61,25 ± 1,73 61,94 ± 4,79 62,46 ± 2,08 36 - 64%
CD8 47,73 ± 1,5 42,5 ± 1,67 56,29 ± 1,98 15 - 40%
CD16 8,43 ±0,51 8,55 ± 0,49 9,00 ± 0,66 6 - 18%
CD95 22,5 ± 1,94 22,67 ± 4,18 20 ± 3,94 17 - 30%
Интерферон-альфа (сыворотка крови) 5,53 ± 0,76 18,93 ± 3,95 9,51 ± 2,28 0 - 45 пг/мл
Интерферон-гамма (спонтанный) 28,51 ± 2,66 23,6 ± 2,51 44,91 ± 3,37 0 - 50 пг/мл
Интерферон-гамма (стимулированный) 868,43 ± 174,16 1123,63 ± 273,03 1408,76 ± 235,68 250 - 3000 пг/мл
ТОТ-а 4,25 ± 0,56 2,7 ± 0,58 2,36 ± 0,69 0,00 - 2,50 пг/мл
^-4 5,64 ± 0,22 6,47 ± 0,24 5,84 ± 0,27 0,00 - 13,0 пг/мл
1-Л
m
№05/2010 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ
•О
m
1 и 3 HCV практически не наблюдалось, как, впрочем, и различий в частоте цирроза печени на фоне детерминированного ими ХВГС.
Изучение иммунологических показателей выявило целый ряд особенностей, по-видимому, отражающих патогенетические различия, ассоциированные с различными генотипами HCV (табл. 2).
Во-первых, при генотипе 2 HCV в крови больных обнаруживалось достоверно меньшее количество CD3-клеток, нежели при генотипе 3 (р < 0,05). При анализе различий в количестве CD3-клеток опять проявился феномен своеобразной «исключительности» генотипа 2 Ж1У. Количество CD3-клеток при достоверности различий в содержании у больных генотипами 2 и 3 таковой достоверности различий между генотипами 1 и 2 не продемонстрировало. Различия между пациентами, инфицированными генотипами 1 и 3 HCV, были крайне незначительными.
Достоверных различий в содержании CD4-клеток между всеми группами сравнения обнаружено не было (р > 0,05). На наш взгляд, этот факт имеет следующее объяснение. По современным представлениям, сильный CD4+ Т-клеточный пролиферативный ответ на антигены HCV характерен для больных острым вирусным гепатитом С с самоограничением инфекционного процесса, а не для ХВГС [5; 7]. У больных ХВГС иммунная система не способна организовать ответ, ограничивающий инфекционный процесс. Следовательно, каких-либо достоверных отличий быть не может в связи с тем, что практически все они инфицированы ХВГС.
Вторым интересным фактом, обнаруженным при изучении иммунологических показателей у пациентов с различными генотипами HCV, было достоверно различное количество CD8+-клеток во всех группах сравнения. Причем содержание CD8+-клеток при генотипе 3 HCV было достоверно выше, чем при генотипе 1 (р < 0,01) и при генотипе
2 (р < 0,01). Различия между содержанием данных субпопуляций лимфоцитов были также достоверными при сравнении групп пациентов с генотипами 1 и 2 HCV (р < 0,05). В группе больных ХВГС, инфицированных генотипом 1 вируса, содержание CD8+-клеток было достоверно выше. Таким образом, вышеприведенные данные еще раз подтверждают более неблагоприятное течение ХВГС, вызванного генотипами 1 и 3 HCV [13].
Изучение содержания CD16 и CD95 не выявило достоверных различий между группами сравнения. Данный факт, вероятно, отражает неспособность иммунной системы обеспечить протективный иммунный ответ при ХВГС [9].
Изучение содержания цитокинов у больных ХВГС с различными генотипами HCV позволило получить следующие результаты. Содержание ТОТ-а у пациентов, инфицированных генотипом 1 HCV, было достоверно выше в сравнении с инфицированными генотипом 3 HCV (р < 0,05) и выше, чем у лиц,
пораженных генотипом 2 HCV. Хотя в последнем случае различия не были достоверными (р = 0,0543). Таким образом, при генотипе 1 HCV сывороточный уровень TNF-а у пациентов с ХВГС значительно более высокий.
Подобные результаты были также получены при изучении содержания ИФН-у в сыворотке больных ХВГС, пораженных различными генотипами HCV. Содержание ИФН-у у пациентов с генотипами 1 и 3 HCV было выше в сравнении с пациентами с генотипом 2 HCV, в особенности в сравнении с группой пациентов с генотипом 3 HCV (р < 0,05).
В то же время содержание в сыворотке крови ИФН-а и IL-4 у группы пациентов, инфицированных генотипом 2 HCV, было достоверно выше в сравнении с группами пациентов, инфицированных генотипами 1 и 3 HCV, что может косвенно свидетельствовать о более адекватной регуляции Т-клеточного ответа при данном генотипе вируса [15] и иметь значение в оценке эффективности противовирусной терапии, определяя лучший ответ на проводимое лечение [18].
По современным представлениям, наиболее существенным механизмом гибели инфицированных HCV гепатоцитов является апоптоз вследствие клеточного иммунного ответа, в особенности опосредованного цитотоксическими Т-клетками (ЦТЛ). Ряд исследований подтверждает ведущую роль последних не только в клиренсе вируса, но и в патогенезе повреждения печени при вирусных гепатитах [10; 17]. ЦТЛ вызывают апоптоз инфицированных клеток с помощью перфорин-гранзимового комплекса и через систему Fas/FasL в результате взаимодействия растворимого или экспрессированного на поверхности активированных лимфоцитов FasL с Fas-рецептором клеток-мишеней, а также нарушают репликацию вируса и экспрессию вирусных белков в инфицированной клетке благодаря секреции ряда цитокинов, в частности ИФН-у и TNF-a [4]. Более высокие уровни ИФН-у и TNF-a у больных ХВГС определяют ведущую роль этих цитокинов в патогенезе системного воспалительного ответа при данном заболевании [14].
О важной роли ЦТЛ в повреждении гепатоци-тов при ХВГС свидетельствуют следующие факты. Гистологически при гепатите в портальных трактах и внутри печеночных долек отмечается лимфоги-стиоцитарный инфильтрат, обогащенный CD8+ Т-клетками [6]. Помимо вышеуказанного в печени пациентов с ХВГС в зонах активного воспаления часто обнаруживаются активированные лимфоциты, экспрессирующие FasL [8; 12], а гепатоциты проявляют повышенную экспрессию Fas [16].
Таким образом, повышенное содержание ИФН-у, TNF-a и CD8+ Т-клеток у пациентов с ХВГС, вызванным генотипами 1 и 3 HCV, и значительно более выраженный цитолиз у пациентов с генотипом 3 HCV позволяют утверждать, что при данных генотипах вируса имеют место более выраженные воспалительно-некротические воспаления
в паренхиме печени, детерминированные системным воспалительным ответом, направленным на элиминацию возбудителя. Более выраженные воспалительно-некротические изменения у пациентов, инфицированных генотипами 1 и 3 вируса HCV, приводят к развитию цирроза чаще, несмотря на более молодой возраст больных, пораженных данными генотипами.
ВЫВОДЫ
1. На территории юга Западной Сибири — Омска и Омской области генотипы 1 и 3 HCV встречаются с одинаковой частотой и являются наиболее рас-
пространенными у больных ХВГС более молодого возраста.
2. У пациентов с генотипом 1 ЖГУ доминирует подтип вируса 1Ь.
3. У лиц, инфицированных генотипами 1 и 3 HCV, отмечается более выраженный системный воспалительный ответ, приводящий к массивным воспалительно-некротическим изменениям в паренхиме печени с последующим повреждением гепатоцитов за счет межклеточных взаимодействий клеток иммунной системы и цитокинов, ведущих к развитию цирроза печени в более раннем возрасте.
Б >
а
So L 2 <£ о £ £
Щ а h £ X £ m -с
о
a
I-
и
га
L
Б
га
V
и
ш
т
S
X
S
<
ЛИТЕРАТУРА
1. Жданов К. В. Латентные формы вирусных гепатитов В и C у лиц молодого возраста: автореф. дис.... докт. мед. наук. — СПб., 2000. —
37 с.
2. Майер К. П. Гепатит и последствия гепатита: практ. руководство: пер. с нем. — 2-е изд., перераб и доп. — М.: ГЭОТАР-Мед, 2004. — 720 с.
3. Ястребова О. Н. Гепатит С. Информационно-методическое пособие. — Кольцово, 2000.
4. Berke G. Killing mechanisms of cytotoxic lymphocytes // Curr. Opin. Hematol. — 1997. — Vol. 4. — P. 32 - 40.
5. Cramp M. E., Carucci P., Rossol S. et al. Hepatitis C virus (HCV) specific immune response in anti-HCV positive patients without hepatitis C viraemia // Gut. — 1999. — Vol. 44. — P. 424 - 429.
6. Crawford J. M. The liver and the biliary tract // Robbins Pathologic Basis of Disease, 6th ed. // Cortran. — 1999. — P. 857 - 868.
7. Gerlach J. T., DiepolderH. M., JungM. K. et al. Recurrence of hepatitis C virus after loss of virus-specific CD4+ T cell response in acute hepatitis C // Gastroenerology. — 1999. — Vol. 117. — P. 933 - 941.
8. Hayashi N., Mita E. Fas system and apoptosis in viral hepatitis // J. Gastroenterol. Hepatol. — 1997. — Vol. 12. — P. 223 - 226.
9. Kirman I., VainerB., Nielsen O. H. Interleukin-15 and its role in chronic inflammatory diseases // Inflamm. Res. — 1998. — Vol. 47. — P. 285 - 289.
10. Koziel M. J. The role of immune responses in the pathogenesis of hepatitis C virus infection // J. Viral. Hepat. — 1997. — Vol. 4, Suppl. 2. — P. 31 - 41.
11. Martinot-Peignoux M., Marcellin P., Pouteauet M. et al. Pretreatment serum hepatitis C virus RNA levels and hepatitis C virus genotype are the main and independent prognostic factors of sustained response to interferon-alfa therapy in chronic hepatitis C // Hepatology. — 1995. — Vol. 22. — P. 1050 - 1056.
12. Mita E., Hayashi N., Lio S. et al. Role of Fas ligand in apoptosis induced by hepatitis C infection // Biochim. Biophis. Res. Commun. — 1994. — Vol. 204. — P. 468 - 474.
13. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement, Management of hepatitis C/Hepatology. — 2002. — Vol.
36. — P. 3 - 20.
14. Nelson D. R., Lau J. Y. Host immune response in hepatitis C virus infection // Viral. Hepat. — 1996. — Vol. 2. — P. 37 - 48.
15. Nelson D. R., Lim H. L., Marousis C. G. et al. Activation of tumor necrosis factor-alpha system in chronic hepatitis C virus infection // Dig. Dis. Sci. — 1997. — Vol. 42. — P. 2487 - 2494.
16. Ohishi M., Sakisaka S., Koji T. et al. The localization of HCV and the expression of Fas antigen in the liver of HCV-related chronic liver disease // Acta Histochem. Cytochem. — 1995. — Vol. 28. — P. 341 - 348.
17. Rehermann B., Lau D., Hoofangle J. H. et al. Cytotoxic T lymphocyte responsivness after resolution of chronic hepatitis B virus infection // J. Clin. Invest. — 1996. — Vol. 97. — P. 1655 - 1665.
18. Zeuzem S., Hultcrantz R., Bourliere M. et al. Peg-interferon alfa-2b 1.5g/kg plus ribavirin 800 - 1400 mg/day for 24 weeks in patients with HCV 2 or 3 // Hepatology. — 2003. — Vol. 38. — P. 347.
m
