CC BY
149
УДК 579.2 / 57.063.8 / 57.083.18
ОСОБЕННОСТИ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ КОМПЛЕКСА BURKHOLDERIA CEPACIA И РОДА PSEUDOMONAS С ПОМОЩЬЮ БИОХИМИЧЕСКОГО АВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА VITEK 2
А. В. Незнамова1, Я. А. Лопастейская12, Е. В. Молчанова12, Н. П. Агеева1, Д. В. Викторов12
1Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, 2Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра молекулярной биологии и генетики
С помощью автоматического биохимического анализатора VITEK 2 8 из 9 штаммов комплекса Burkholderia cepacia были идентифицированы как виды: B. Cepacia /Burkholderia vietnamiensis /Burkholderia multivorans / Burkholderia stabilis. Один штамм Burkholderia cenocepacia был неправильно определен как вид Acinetobacter lwoffii. Пять штаммов рода Pseudomonas, с неустановленной видовой принадлежностью, были идентифицированы как вид Pseudomonas aeruginosa со степенью вероятности 98—99 %.
Ключевые слова: идентификация, Burkholderia, B. cepacia, VITEK 2, Pseudomonas aeruginosa.
IDENTIFICATION OF BURKHOLDERIA CEPACIA AND BURKHOLDERIA PSEUDOMONAS COMPLEX BACTERIA USING VITEK 2, AN AUTOMATED
BIOCHEMICAL ANALYZER
A. V. Neznamova1, Y. A. Lopasteyskaya12, E. V. Molchanova12, N. P. Ageeva1, D. V. Viktorov12
1 Volgograd Research Plague Control Institute, 2 Volgograd State Medical University, Department of molecular biology and genetics
8 out of 9 strains of Burkholderia cepacia complex have been identified as B. cepacia/ Burkholderia vietnamiensis/ Burkholderia multivorans/ Burkholderia stabilis species using VITEK 2, an automated biochemical analyzer. Burkholderia cenocepacia strain was falsely identified as Acinetobacter lwoffii. Five unidentified strains of the Pseudomonas genus have been identified as Pseudomonas aeruginosa with probability of 98—99 %.
Key words: identification, Burkholderia, B.cepacia, VITEK 2, Pseudomonas aeruginosa.
B. cepacia относится к роду буркхольдерий, грамот-рицательных неферментирующих бактерий, выделенных в 1992 г в самостоятельный таксон из рода Pseudomonas [8]. Вид B. cepacia является типовым видом рода и относится к IV группе патогенности в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III—IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Изоляты «B. cepacia» различного происхождения характеризуются значительной гетерогенностью, что обусловило разделение cepacia-комплекса на геномовары, в дальнейшем получивших статус видов. До 2009 г их насчитывалось 9, к 2011 г — уже 17, в настоящее время комплекс представлен 18 отдельными бактериальными видами [2, 6, 7].
Ряд представителей комплекса B. cepacia в настоящее время признаны в качестве основных оппортунистических патогенов респираторного тракта больных муковис-цидозом, хроническим гранулематозом и некоторыми им-мунодефицитными состояниями [4, 5]. Описаны случаи развития некротизирующих пневмоний, абсцессов легких, послеоперационных раневых инфекций и септицемий, инфекций мочевого тракта, возникающих при использовании контаминированных микроорганизмами дезинфектантов, растворов и систем для внутривенного введения лекарств. Приблизительно у 20 % больных, инфицированных B. cepacia, возникает так называемый cepacia-оиндром, который характеризуется некротизирующей пневмонией с ли-
хорадкой, бактериемией и может быстро привести к летальному исходу. Как правило, внутрибольничные вспышки инфекции B. cepacia связаны с недостаточной дезинфекцией изделий медицинского назначения многоразового использования. Данные бактерии могут передаваться от человека к человеку в медицинских и немедицинских учреждениях при прямом и косвенном контактах, а также воздушно-капельным путем [6].
Идентификация микроорганизмов комплекса B. cepacia с использованием методов бактериологического анализа сложна в силу выраженного полиморфизма фенотипических признаков.
Для идентификации бактерий в большинстве клинических диагностических лабораторий в настоящее время используются автоматические системы бактериологического анализа, такие как BD Phоenix (Becton Dickinson, США), VITEK и VITEK 2 (bioMerieux, Франция), WalkAway (Dade Behring, США), основанные на сопоставлении биохимических свойств исследуемых штаммов с имеющейся базой данных, содержащей информацию о типичных биохимических профилях всех входящих в нее видов микроорганизмов.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Исследование особенностей идентификации коллекционных штаммов комплекса B. cepacia и установление видовой принадлежности представителей рода Pseudomonas с использованием системы VITEK 2.
©äSmpfä ©©CöFflM]^
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе были использованы штаммы из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора: 9 штаммов комплекса B. cepacia, геномовары которых были определены ранее [1], и 5 штаммов рода Pseudomonas с неустановленной видовой принадлежностью (табл. 1).
Определение видовой принадлежности проводили на биохимическом автоматическом анализаторе VITEK 2 (BioMerieux, Франция), с использованием NG-карт, предназначенных для идентификации клинически значимых ферментирующих и неферментирующих гра-мотрицательных палочек и включающих 47 индивидуальных биохимических тестов.
Штаммы микроорганизмов выращивали на L-ага-ре (Difco, США) при температуре 32 °С. Для заполнения соответствующих карт прибора из 18 ч культур готовили суспензию 0,5—0,63 плотности по МакФарланду согласно инструкции производителя bioMerieux (Франция).
Время получения результата — 5—10 часов. На каждую исследуемую культуру был получен протокол идентификации микроорганизма с подробной инфор-
мацией о его биохимической активности. Рассчитывался количественный показатель—относительная вероятность, отражающая степень соответствия полученных результатов типичному профилю биохимической активности каждого вида из базы данных анализатора. Система делала единственный выбор при относительной вероятности 85—99 %. В случае несоответствия биохимического профиля ни одному из имеющихся в базе данных система выдавала сообщение о невозможности идентификации или список вероятных микроорганизмов. В последнем случае лабораторный отчет содержал перечень дополнительных тестов, необходимых для окончательной идентификации.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного анализа с помощью автоматической системы VITEK 2 восемь штаммов комплекса B. cepacia (АТСС 25416, 323, АВ 1934, 8235, 8236, 8238, 3181, 3189) были отнесены к группе B. cepacia (B. Cepacia / B. Vietnamiensis / B. Multivorans / B. stabilis) (табл. 2).
Таблица 1
Штаммы, используемые в работе
№ п/п Штамм Номер геномовара Вид согласно геномовару
1 B. cepacia ATCC 25416 I B. cepacia
2 B. cepacia AB 1934 II B. multivorans
3 B. cepacia 323 III B. cenocepacia
4 B. cepacia 8235 IV B. stabilis
5 B. cepacia 8236 III B. cenocepacia
6 B. cepacia 8238 III B. cenocepacia
7 B. cepacia 8240 III B. cenocepacia
8 B. cepacia 3181 I B. cepacia
9 B. cepacia 3189 I B. cepacia
10 Pseudomonas sp. 5809 — —
11 Pseudomonas sp. 5810 — —
12 Pseudomonas sp. 5811 — —
13 Pseudomonas sp. 5812 — —
14 Pseudomonas sp. 5813 — —
Таблица 2
Результаты идентификации микроорганизмов комплекса B. cepacia с использованием VITEK 2 system
№ п/п Название штаммов коллекции Результаты идентификации
1 B. cepacia ATCC 25416 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B.stabilis
2 B. multivorans AB 1934 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
3 B. cenocepacia 323 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
4 B. stabilis 8235 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
5 B. cenocepacia 8236 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
6 B. cenocepacia 8238 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
7 B. cenocepacia 8240 A. lwoffii
8 B. cepacia 3189 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
9 B. cepacia 3181 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis
10 Pseudomonas sp. 5809 P. aeruginosa / P. putida
11 Pseudomonas sp. 5810 P. aeruginosa
12 Pseudomonas sp. 5811 P. aeruginosa
13 Pseudomonas sp. 5812 P. aeruginosa
14 Pseudomonas sp. 5813 P. aeruginosa
I^mpfö ©©СаГГГМЩ
Лабораторный отчет по этим штаммам содержал информацию по дополнительным тестам (утилизация сахарозы, наличие бета-галактозидазы, желатиназы и желтого пигмента), с помощью которых можно было определить эти штаммы до вида.
В ряде работ при идентификации штаммов комплекса B. cepacia авторы отмечали ложную идентификацию как на уровне геномовара, так и на уровне вида и рода при использовании анализатора VITEK 2 [3]. В данной работе три штамма B. cenocepacia 323, 8236, 8238 были идентифицированы как другие виды комплекса B. cepacia (B. cepacia / B. Vietnamiensis / B. Multivorans / B. stabilis), что возможно связано с их нестабильным биохимическим профилем.
Штамм B. cenocepacia 8240 был неправильно определен прибором как вид A.lwoffii с вероятностью 91 %. В статье Brisse S., et al. было указано, что при идентификации культур комплекса B. cepacia с помощью VITEK 2 в 4 %% случаев анализируемый изолят был отнесен к разным видам неферментирующих грам-негатив-ных бактерий (в том числе и к Acinetobacter spp.) [3]. Ложная идентификация культуры может определяться нехарактерными для типового штамма биохимическими свойствами. Так, B. cenocepacia 8240 отличался от других штаммов этого вида набором таких показателей, как отсутствие ß-N-ацетилглюкозоминидазной и наличие L-пролинариламидазной и тирозинариламидазной активностей, неспособность к утилизации сахарозы и др. Стоит отметить, что в проведенных нами исследованиях по автоматической бактериологической идентификации филогенетически родственных микроорганизмов Burkholderia pseudomallei (возбудителя особо опасного заболевания — мелиоидоза) и Burkholderia mallei (возбудителя особо опасного заболевания — сапа) у части штаммов были выявлены биохимические особенности, заключающиеся в нетипичном результате перечисленных выше тестов. В результате, данные штаммы B. pseudomallei и B. mallei были неправильно идентифицированы как виды B. cepacia и Sphingomonas paucimobilis соответственно.
Штаммы рода Pseudomonas sp. были идентифицированы бактериологическим анализатором как P. aeruginosa с вероятностью 98—99 %% (5810, 5811, 5812, 5813). Pseudomonas sp. 5809 был отнесен к двум видам P. Aeruginosa/P. putida, а лабораторный отчет системы содержал рекомендации по проведению дополнительных тестов для дальнейшей дифференциации (рост при 42 °С, наличие пигмента пиоцианина). Способность к росту при данной температуре, а также наличие сине-зеленого диффундирующего пигмента свидетельствовали о его видовой принадлежности к P. aeruginosa.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С использованием автоматического биохимического анализатора VITEK 2 установлено, что большинство исследуемых штаммов различных геномоваров
B. cepacia (8 из 9) были идентифицированы как виды комплекса B. cepacia.
Более половины (5 из 9) штаммов определены как принадлежащие одному из четырех видов комплекса: B. cepacia /B. Vietnamiensis /B. Multivorans /B. stabilis. Из 47 тестов, заложенных в NG карте прибора, не было отмечено ни одного нетипичного результата, что говорит о типичном биохимическом профиле данных штаммов, характерном для микроорганизмов этого комплекса. Оставшиеся 4 штамма, относящиеся к виду B. cenocepacia анализатором VITEK 2, были ложно идентифицированы как штаммы других видов cepac/a-комплекса, при этом один штамм был определен как вид A. Iwoffii.
Таким образом, при применении VITEK 2 в лабораторной практике для ускоренной идентификации микроорганизмов комплекса B. cepacia следует иметь в виду возможность ошибочного определения их видовой принадлежности. В случаях диагностики заболевания с характерным анамнезом для
B. cepacia-инфекции и нетипичными результатами при идентификации выделенной культуры микроорганизмов с помощью автоматической системы VITEK 2 необходимы дополнительные исследования с использованием как традиционных фенотипических (бактериологических, биохимических), так и молекулярно-генетических методов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонов В. А. Илюхин В. И., Сенина Т. В., Лобой-ко А. Д., Ткаченко Г. А., Зинченко О. В., Мазурова И. Ю. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia // Журн. микро-биол. — 2008. — № 4. — С. 78—82.
2. Носенко В. М., Лаврухин Ю. Н., Макиенко В. В. Редкий случай ожогового сепсиса, вызванного Burkholderia cepacia // Мед.-соц. пробл. семьи. — 2013. — № 2 (18). — Р 168—172.
3. Brisse S., Stefani S., Verhoef J, Belkum A., Vandamme P., Goessens W. Comparative evaluation of the BD Phoenix and VITEK 2 automated instruments for identification of isolates of the Burkholderia cepacia complex // J. Clin. Microbiol. — 2002. — Vol. 40 (5). — Р 1743. DOI: 10.1128/ JCM.40.5.1743-1748.2002.
4. Mahenthiralingam E., Bischof J., Byrne S., Radomski
C., Davies J., Av-Gay Y., Vandamme P. DNA-Based diagnostic approaches for identification of Burkholderia cepacia complex, Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia multivorans, Burkholderia stabilis, and Burkholderia cepacia genomovars I and III // J Clin Microbiol. — 2000. — Vol. 38 (9). — P. 3165—3173.
5. Plesa M., Kholti A., Vermis K., Vandamme P., Panagea S., Winstanley C., Cornelis P. Conservation of the opcL gene encoding the peptidoglycan-associated outer-membrane lipoprotein among representatives of the Burkholderia cepacia complex // J. of Med. Microbiology. — 2004. — Vol. 53. — P. 389—398.
6. Saiman L., Siegel J., LiPuma J., Brown R., Bryson E., Chambers M., Downer V., Fliege J., Hazle L., Jain M., Marshall B., O'Malley C., Pattee S., Potter-Bynoe G., Reid S., Robinson K., Sabadosa K., Schmidt H., Tullis E.,
©äSmpfä ©©CöFflM]^
Webber J., Weber D. Infection prevention and control guideline for cystic fibrosis: 2013 update. 2014 Aug; 35 (Supp l 1): S1-S67.
7. Sousa S., Ramos C., Leitao J. Burkholderia cepacia complex: emerging multihost pathogens equipped with a wide range of virulence factors and determinants // International Journal of Microbiology. — vol. 2011, Article ID 607575, 9 pages, 2011. doi:10.1155/2011/607575.
8. Yabuuchi E., Kosako Y., Oyaizu H. Proposal of Burkholderia gen. nov.and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group 2 to the New Genus, with the Type Species Burkholderiacepacia (Palleroni and
Holmes 1981) comb. nov. // Microbiol-Immunol. — 1992. — Vol. 36 (12). — P. 1251—1275.
Контактная информация
Молчанова Елена Владимировна—к. б. н., с. н. с.
лаборатории коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, ассистент кафедры молекулярной биологии и генетики Волгоградского государственного медицинского университета,e-mail: elenakalinki@yandex.ru
