CC BY
0
Покровский Н.С., Водякова М.А., Меркулов В.А., Мельникова Е.В.
Особенности и ключевые параметры валидации методик фенотипирования клеточных линий, входящих в состав препаратов клеточной терапии
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Подлинность (идентичность) клеточных линий (клеток) является одним из важнейших показателей качества препаратов на основе жизнеспособных клеток человека. Иммуно-фенотипическая характеристика клеток человека имеет основополагающее значение для идентификации препаратов клеточной терапии перед клиническим применением. Проточная цитометрия - метод, наиболее широко используемый для фенотипирования клеточных линий. Исследование посвящено анализу особенностей валидации методик фенотипирования клеточных линий. В рамках данного исследования были рассмотрены ключевые параметры процесса валидации методики, а также актуальные данные об особенностях валидации, связанные с препаратами клеточной терапии, используемыми реактивами и оборудованием, редкими событиями и компенсацией.
Ключевые слова: валидация; фенотипирование; проточная цитометрия; контроль качества; клеточные линии
Статья получена 17.04.2024. Принята в печать 23.05.2024.
Для цитирования: Покровский Н.С., Водякова М. А., Меркулов В.А., Мельникова Е.В. Особенности и ключевые параметры валидации методик фенотипирования клеточных линий, входящих в состав препаратов клеточной терапии. Иммунология. 2024; 45 (3): 343-354. Б01: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-343-354
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России № 05600026-24-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР 124022200093-9). Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Написание текста, сбор и обработка материала - Покровский Н.С., Водякова М.А.; редактирование - Меркулов В. А.; концепция и дизайн исследования - Мельникова Е.В.
Pokrovsky N.S., Vodyakova M.A., Merkulov V.A., Melnikova E.V.
Specific aspects and key parameters of validation for methods of phenotyping of cell lines included in cell therapy products
Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russian Federation
Abstract
The authenticity (identity) of cell lines (cells) is one of the most important quality indicators of medicinal products containing viable human cells. Immunophenotypic characterization of human cells is fundamental to the identification of a cell therapy product before its clinical application. The most widely used method for phenotyping cell lines is flow cytometry. The study is devoted to the analysis of the specific aspects of cell line phenotyping methods validation. This study reviewed key parameters of the method validation process, as well as current data on validation specific aspects related to cell therapy products, reagents and equipment used, rare events and compensation.
Keywords: validation; phenotyping; flow cytometry; quality control; cell lines
Received 17.04.2024. Accepted 23.05.2024.
Для корреспонденции
Покровский Никита Станиславович -эксперт 2-й категории лаборатории биомедицинских клеточных продуктов ИЦЭКЛС ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: pokrovsky.ns@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-2355-0879
For correspondence
Nikita S. Pokrovsky - 2nd category expert of the Laboratory of Biomedical Cell Products of the TC MPQC of the SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: pokrovsky.ns@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-2355-0879
For citation: Pokrovsky N.S., Vodyakova M.A., Merkulov V.A., Melnikova E.V. Specific aspects and key parameters of validation for methods of phenotyping of cell lines included in cell therapy products. Immunologiya. 2024; 45 (3): 343-54. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-3-343-354 (in Russian)
Funding. The study reported in this publication was carried out as part of publicly funded research project No. 05600026-24-00 and was supported by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products, Ministry of Health of the Russian Federation (R&D public accounting 124022200093-9). Open publication of the research results is allowed.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Writing the text, collection and processing of material - Pokrovsky N.S., Vodyakova M.A.; editing - Merkulov V.A.; the concept and design of the study - Melnikova E.V.
Введение
Анализы, проводимые методом проточной цитофлуо-риметрии, используются на всех стадиях процесса разработки препаратов на основе жизнеспособных клеток человека: биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) и высокотехнологичных лекарственных препаратов (ВТЛП), а также при оценке их качества [1]. Эта технология позволяет проводить идентификацию клеточных маркеров на поверхности клеток, а также специфичные измерения в ее внутренних структурах. Метод проточной цитофлуориметрии также подходит для количественного определения растворимых ана-литов (цитокинов, фармацевтических субстанций, антител в образцах плазмы или сыворотки). Преимуществом метода проточной цитофлуориметрии является его способность к многопараметрическому анализу, что позволяет одновременно определять различные функциональные характеристики клетки [2, 3].
Проточная цитофлуориметрия применяется для анализа клеточного цикла, пролиферации, апоптоза, внутриклеточного сигналинга и многих других процессов в клетке. В некоторых клинических исследованиях подсчет (абсолютного значения и долей популяции) таких клеток, как СБ3+СБ4+- и СБ3+СБ8+-Т-клетки, В- и НК-клетки, методом проточной цитофлуориметрии является основной задачей оценки эффективности или ответа на терапию [3].
Определение идентичности клеточной линии в составе БМКП/ВТЛП может заключаться в определении фенотипического, генотипического и морфологического профиля. Иммунофенотипическая характеристика клеточных линий имеет основополагающее значение для идентификации препарата клеточной терапии перед его клиническим применением. Проточная цитомет-рия - наиболее широко используемый метод иммуно-фенотипического анализа, который позволяет быстро и по многим параметрам анализировать клеточную суспензию и подразумевает демонстрацию пригодности (валидацию) для каждой клеточной линии (определенного типа целевых клеток). Следует отметить, что оценка некоторых аналитических измерений (чувствительность, правильность и линейность) для валидации этого метода затруднена из-за отсутствия клеточных референсных материалов и сложности получения адекватных контролей (например, клеточных линий с различными уровнями экспрессии данного маркера) [4].
По сравнению с другими часто используемыми методами, обычно применяемыми в разработке лекарственных препаратов (например, масс-спектрометрия), процесс валидации методик проточной цитофлуоримет-рии представляет определенные трудности, заключающиеся в присутствии клеточного материала в образцах, специфических реагентах, в большинстве случаев отсутствии клеточного стандарта и технически сложном оборудовании [3]. Кроме того, необходимо отметить небольшое количество научных работ в области вали-дации метода проточной цитометрии непосредственно для препаратов на основе жизнеспособных клеток [4].
В 2013 г. группой экспертов Международного совета по стандартизации в гематологии (ICSH -International Council for Standardization in Haematology) и Международного общества клинической цитометрии (ICCS - International Clinical Cytometry Society) были разработаны основные принципы, которые должны служить эталоном для проточной цитофлуориметрии независимо от того, используются ли они для тестирования образцов, полученных от пациентов в процессе клинических испытаний (например, в целях исследования эффективности нового диагностического или терапевтического продукта), или разработки нового устройства для диагностики in vitro с использованием этой технологии [5-9].
В настоящее время не существует официальных научно-методических документов (руководств) по валидации анализов, выполняемых методом проточной цитометрии, в том числе единых принятых стандартов для оценки воспроизводимости, правильности и межлабораторной прецизионности.
Общие подходы к использованию метода проточной цитометрии для разработки, проверки, контроля, проведения и внедрения флуоресцентных клеточных анализов любой лабораторией представлены в Руководстве Н62 [3, 10]. Данное руководство содержит рекомендации по подходу «fit-for-purpose» (целеориентированный подход) к валидации методик, выполняемых с помощью проточной цитофлуориметрии. Этот подход подразумевает, что разработка дизайна и непосредственно валидация проводятся в зависимости от преследуемых исследователями целей и планируемого использования полученных данных. Если в период применения методики, для которой проводится валидация, изменится
предполагаемое использование данных, необходимо рассмотреть дополнительные параметры, связанные с новыми задачами [11].
Таким образом, в настоящее время отсутствует детальная информация по особенностям и перечню необходимых параметров для надлежащей валидации специфических методик, выполняемых с помощью проточной цитофлуориметрии применительно к препаратам клеточной терапии (БМКП/ВТЛП).
Цель данной работы - анализ особенностей, характерных для валидации методик проточной цитофлуо-риметрии для оценки идентичности (подлинности) препаратов на основе жизнеспособных клеток человека с помощью иммунофенотипирования.
Принцип работы проточного цитофлуориметра
Проточный цитофлуориметр (цитометр) - это устройство, используемое в молекулярной и клеточной биологии для анализа и подсчета клеток, частиц, растворимых белков и других биологических объектов на основе их оптических свойств. Он состоит из жидкостной (флюидной), оптической и электронной систем. Жидкостная система фокусирует образец в проточной ячейке путем обжимания его со всех сторон буферным раствором, выстраивая клетки или частицы в одиночный ряд. Наличие такой системы необходимо для формирования потока отдельных клеток. Далее поток протекает перпендикулярно лазерному лучу и флуорохромы на поверхности частиц и клеток излучают световые сигналы с длиной волны, большей, чем длина волны источника излучения. В то же время сама по себе частица преломляет и рассеивает попадающий на нее свет на той же длине волны, что и излучатель. Этот преломленный и рассеянный свет проходит через оптическую систему и попадает на детекторы. Затем электронная система светочувствительных элементов детектирует и преобразует сигнал, регистрируя значение основных параметров, которые измеряются проточным цитофлуориметром, таких как флуоресценция (от флуорохрома и автофлуоресценция), прямое (Р8С) и боковое (ББС) рассеяние.
Система детектирования проточного цитофлуо-риметра состоит из фотодетекторов и спектральных фильтров, которые позволяют измерять интенсивность света при разных длинах волн. Эта информация используется для создания многомерного профиля каждой клетки, что позволяет исследователям анализировать ее характеристики и классифицировать в соответствии с определенными критериями.
Степень и характер рассеяния света от клетки зависит от множества факторов, таких как размер, форма, внутренняя структура клетки, ее индекс рефракции, среда и даже углы, под которыми располагаются детекторы. В общем случае, показатель Б8С свидетельствует о размере клетки, а показатель 88С коррелирует со сложностью внутренней структуры клетки. Наиболее полезным стандартом для первоначальной настройки проточного цитометра будут непосредственно те клетки, которые используются в анализе [7].
Настройка параметров цитометра для конкретных типов анализа является ключевым этапом в многопараметрическом анализе фенотипа клеток и включает настройку дискриминатора для различения отдельных клеток и частиц, параметров светорассеяния для измерения их размера и структуры, чувствительности детекторов флуоресценции при определении типа и количества флуорохрома и введение коэффициентов компенсации для корректировки результатов измерений флуоресценции и учета перекрытия спектров излучения различных флуорохромов.
Ключевые параметры процесса валидации методик иммунофенотипирования
Классическое определение валидации аналитической методики заключается в подтверждении, что все необходимые требования для ее предполагаемого применения выполнены посредством проверок и представления объективных доказательств. Валидация методики означает успешную демонстрацию надежности метода, постоянства и правильности полученных с его помощью результатов путем проведения ряда действий, гарантирующих соответствие параметров валидации установленным критериям.
Согласно руководству ICH Q2 R2 [12], валидация каждой аналитической методики необходима для демонстрации того, что данный метод является подходящим для своей цели. Процесс валидации обычно состоит из четырех шагов: квалификация персонала и оборудования, описание стратегии валидации, непосредственно валидация, сбор данных и составление протоколов валидации [4, 13].
Протокол валидации должен четко описывать роли и зону ответственности каждого члена персонала, а также факторы, влияющие на процесс валидации (например, оборудование, расходные материалы, реагенты, стандартные образцы). Также должны быть описаны все параметры валидации, критерии их приемлемости, которые будут гарантировать успешную валидацию данной методики. Согласно ICH Q2 R2 и ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» ГФ РФ XV, для валидации методик количественного анализа необходимо определять следующие основные параметры: правильность, прецизионность (повторяемость внутри-лабораторная и межлабораторная), специфичность, предел обнаружения (limit of detection, LOD), предел количественного определения (limit of quantification, LOQ), линейность и аналитическая область [12, 13]. Но не все эти параметры в полном объеме могут быть определены в рамках методики иммунофенотипиро-вания на проточном цитофлуориметре, что связано со сложностью этой технологии, недостатком (или отсутствием) охарактеризованных контрольных образцов и биоаналитической категорией данных, получаемых при иммунофенотипировании. Большинство данных, получаемых в ходе анализов методом проточной цито-метрии, относятся к количественной биоаналитической категории (например, фармакокинетический анализ),
однако методика иммунофенотипирования относится к квазиколичественным, поскольку численные значения, генерируемые образцами, пропорционально связаны с количеством аналита, но для них отсутствуют калибровочная кривая или контрольные значения (табл. 1) [14]. Например, если необходимо получить значения уровня экспрессии поверхностных маркеров CD19 и при этом калибровка интенсивности флуоресценции проводилась на калибровочных частицах, то полученные данные будут относиться к относительно количественным. Тогда калибровка возможна путем использования антиген-связывающих частиц или частиц с заранее известным числом связанных флуоресцентных молекул. Но даже в этом случае калибровочные образцы не могут полностью соответствовать тестовым.
Особенности валидации методики проточной цитометрии
Несмотря на существование в литературе ряда общих и специфических рекомендаций по валидации, как например руководство H62, адаптировать подобные руководства для применения к препаратам клеточной терапии - довольно непростая задача из-за специфических требований к образцам и к характеристике клеток с учетом множества параметров, которые должны определяться в различных комбинациях, а также из-за большого количества взаимодействующих между собой переменных каждого эксперимента [2, 10]. Далее будут рассмотрены особенности проведения валидации, связанные с различными аспектами анализа, свойственными методу проточной цитометрии.
Клеточные образцы/продукты
Не все подходы к валидации традиционных имму-ноаналитических методик анализа можно легко адаптировать под препараты клеточной терапии. Одной из проблем является приготовление контролей в отношении анализа клеточных образцов, которое кардинально отличается от привычного приготовления контролей в анализах истинных растворов [5, 6]. В отличие от образцов в виде растворов, для которых смешивание двух образцов с разной концентрацией всегда приводит к известному результату, образцы, содержащие клетки с разными уровнями экспрессии анализируемого фактора (аналита), при смешивании будут показывать не усредненный показатель сигнала, а две отличные популяции с разными уровнями экспрессии. Это осложняет подход к изучению линейности метода.
Тот факт, что анализ методом проточной цитофлуо-риметрии проводится на образцах, содержащих клетки с уникальной экспрессией различных аналитов, их собственной аффинностью к красителям и другими индивидуальными характеристиками, создает определенные ограничения для проведения валидации, что не характерно для традиционных методов анализа.
Если лаборатория, проводящая валидацию метода проточной цитофлуориметрии, работает с клеточными
банками, референсные значения низких и высоких уровней сигнала для конкретной клеточной линии могут быть определены, основываясь на данных, полученных на серии анализов в течение нескольких дней при выполнении несколькими операторами-аналитиками [3].
Неочевидной особенностью валидации методики проточной цитофлуориметрии является то, что одна и та же популяция клеток в разных образцах может иметь разный уровень аутофлуоресценции или фоновой флуоресценции, что затрудняет и осложняет подход к проведению валидации некоторых параметров, например чувствительности, пределов обнаружения и количественного определения. Из-за того, что не существует стандартных образцов, содержащих известное количество клеток, исследователь не может определить, является ли применяемая методика правильной с точки зрения валидации.
Определение прецизионности может осложняться сроком годности и стабильности клеточных образцов. При сроке жизнеспособности клеток крови не более 72 ч проведение эксперимента по определению уровня межлабораторной прецизионности на протяжении нескольких дней практически не осуществимо. Это обусловливается тем фактом, что некоторые клеточные поверхностные маркеры или определенные субпопуляции клеток могут быть утеряны, деградированы или изменены в процессе хранения или транспортировки образцов. Эффект влияния транспортировки образцов и их состояния на результаты анализа при необходимости рекомендуется изучить [2]. Помимо этого, такие параметры образца с жизнеспособными клетками человека, как экспрессия антигенов, клеточная композиция и жизнеспособность, имеют тенденцию изменяться с течением времени даже в пробирке, содержащей антикоагулянт. Аналогично исследование повторяемости на серии повторных анализов тоже часто ограничено малыми объемами доступного для работы образца [5, 6].
Также в результате проведения одного анализа методом проточной цитофлуориметрии в образце могут быть определены несколько различных популяций клеток, в то время как в более традиционных методах анализа одно измерение часто обозначает единственный результат. Это приводит к более сложным методам интерпретации результатов и сравнения нескольких образцов между собой.
Еще одной особенностью, связанной с наличием клеточного материала в образцах, в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute), является необходимость в ежедневном подсчете концентрации клеток и их жизнеспособности непосредственно перед проведением анализа, ввиду того, что жизнеспособность клеточных популяций со временем снижается даже при поддержке роста питательными средами [16]. Для большей достоверности результатов и экономии трудозатрат такой подсчет
4
о
Параметр Определение Примечание
С. Lambert и соавт. [2] ГФ РФ XV [13] ICH [12]
Правильность Степень согласованности (близости) между измеренным и истинным значением Близость полученного значения к истинному (опорному), которая выражается величиной открываемости. Характеризует систематическую ошибку Степень согласованности (близости) между полученным значением и значением, принятым за истинное или референс-ное Измерение правильности, как правило, затруднительно и в значительной степени подвержено субъективному восприятию оператора, так как истинное значение аналита не может быть определено в отсутствии стандартного образца клеточной линии (клеток), входящих в состав БМКП/ВТЛП. Сравнение результатов межлабораторных испытаний усложняется из-за крайне короткого срока годности образцов. В достижении правильности могут помочь такие альтернативные методы, как стандартизация методики оценки правильности, многоцентровые испытания, сравнение с эталонным образцом и проведение анализа на калибровочных частицах [14]
Прецизионно сть Степень согласованности между значениями измеренных параметров, полученных множественными измерениями одного и того же образца (или схожих образцов) в определенных условиях Выражение близости (степени разброса) результатов (значений) между сериями измерений, взятых из одной и той же однородной пробы, в предписанных методикой условиях. Мерой прецизионности является величина стандартного отклонения результата отдельного определения, полученная для выборки достаточно большого объема Степень согласованности (близости, разброса) между серией измерений, полученных при многократном отборе одного и того же гомогенного образца при установленных условиях. Прецизионность делится на три уровня: повторяемость, внутрилабораторная прецизионность и межлабораторная прецизионность Повторяемость измеряется на наиболее репрезентативном образце, а также на наиболее репрезентативной популяции клеток в этом образце. Анализ внутрилабораторной прецизионности трудно провести в требуемом количестве повторений из-за ограниченного количества образца и стоимости анализа. Каждое проточно-цитометрическое исследование обычно представляет собой среднее значение или медиану 1000-50 000 отдельных измерений [5]
Линейность При отсутствии постоянного смещения значения сигнала, означает способность внутри определенного диапазона давать результаты, прямо пропорциональные количеству аналита в образце Прямо пропорциональная зависимость аналитического сигнала от концентрации (количества) определяемого вещества в анализируемой пробе в пределах диапазона применения (аналитической области) методики Способность методики получать результаты измерений, которые при заданном диапазоне прямо пропорциональны количеству аналита в образце Проверка линейности неприменима по отношению к квазиколичественным методам (иммунофенотипированию) [3, 14]. Однако некоторые работы предлагают определенный подход для проведения анализа линейности в биологических образцах. Для этого рекомендуется использовать серии последовательных разведений образцов исследуемых клеток образцами других клеток, заранее охарактеризованных и окрашенных по определенным поверхностным маркерам [2,4]. Этот подход является аналогом раститровки растворов в оценке линейности традиционных аналитических методик, но учитывает особенности валидации методик проточной цитометрии
i И
Ё §
|с »
ш «
1-°
а СО
I ß
И И
» Ш
as >>
80
^з ¡3
2 о
® ж
со tö
5 >
и со
Параметр Определение Примечание
С. Lambert и соавт. [2] ГФ РФ XV [13] ICH [12]
1£ < ч 1 < j j С С Рабочий интервал набора значений одного и того же типа, измеряемых конкретным прибором с его неопределенностью в указанных условиях Интервал между наибольшей и наименьшей концентрациями (количеством) определяемого вещества в образце (включая эти концентрации), для которого показано, что аналитическая методика имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности Интервал между верхней и нижней границей концентраций аналита в образце, для которого был продемонстрирован подходящий уровень прецизионности, правильности и линейности Рекомендуется проводить анализ диапазона измерений, допускаемого методикой, на одной репрезентативной популяции клеток в составе образца (с концентрацией этой популяции 104-105 кл/мкл) и использовать от 6 до 10 последовательных 3- или 4-кратных разведений [2]
-I С. ч j | j ; Показатель того, насколько сильно результат измерения количества аналита подвержен влиянию других компонентов в образце Способность аналитической методики однозначно оценивать определяемое вещество в присутствии сопутствующих компонентов Способность однозначно определять аналит в присутствии компонентов, нахождение которых в образце ожидаемо (например, примеси, продукты распада, матрикс и т.д.). Отсутствие специфичности конкретного анализа можно компенсировать другими вспомогательными типами анализа Валидация методики по специфичности должна отвечать на следующие вопросы: 1. Соответствуют ли события внутри определенного гейта тому, что ожидал увидеть исследователь, или в нем присутствуют артефакты в виде дубликатов, сторонней клеточной популяции, компенсационные ошибки или деградация тандемного красителя? 2. Происходит ли детектирование каждого отдельного антигена оптимальным образом? 3. Нет ли в ходе измерения уровней антигенов влияния других компонентов на результаты? Результаты валидации специфичности зависят от типа клеток, выбора антител, непосредственно анализа и стандартизованной интерпретации данных [2, 14].
LOD Значение, полученное данным методом измерения, для которого вероятность ложного утверждения об отсутствии аналита равно ß, при условии, что вероятность ложного утверждения о его наличии принимается за а; а и ß обычно принимаются за 5 % Наименьшее количество (концентрация) определяемого вещества в образце, которое может быть обнаружено, но необязательно точно количественно определено Нижний предел количества аналита в образце, которое может быть обнаружено, но не обязательно определено количественно Определение LOB и нижней границы LOQ в случае проведения анализа, не предполагающего обнаружение редких популяций, может быть необязательным. В остальных случаях после того, как LOB/LOD определены и установлены, все значения, полученные в ходе дальнейших анализов, которые будут ниже LOD, не должны использоваться в расчетах таких параметров валидации, как прецизионность, стабильность и нижняя граница LOQ. Эти данные необходимо отразить в отчете о валидации, указав, что их значения находятся ниже LOD [14].
LOQ Нижний предел количества аналита в образце, которое может быть количественно определено с достаточной прецизионностью и правильностью в экспериментальных условиях Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно определено с требуемой правильностью и внутри-лабораторной (промежуточной) прецизионностью Нижний предел количества аналита в образце, которое может быть количественно определено с достаточной прецизионностью и правильностью
Параметр
С. Lambert и соавт. [2]
Определение
ГФ РФ XV [13]
ICH [12]
Примечание
X р4
Разница между изменением сигнала и соответствующим изменением измеряемого значения (наклон калибровочной кривой)
С практической точки зрения относительная чувствительность проточных питометров к флуоресценции измеряется их способностью различать слабо окрашенные популяции и является важным аспектом в поиске и определении редких популяций и/или обнаружении слабоэкспрессирующихся антигенов [14]. На эту способность влияют как минимум три фактора:
1) эффективность детекции флуоресценции;
2) уровень фонового света;
3) электронный шум внутри прибора.
Эффективность детекции флуоресценции и уровень фонового света определяют количество фотоэлектронов, которые улавливаются фотоприемниками, а шум может привести к увеличению разброса значений на гистограмме флуоресценции.
Главной сложностью в валидации чувствительности - это разработка и создание валидационных образцов для определения предела холостой пробы, предела обнаружения и нижнего предела количественного определения [15]
о.
СГ
Значение измерения, принимаемое за предел принятия решения для разделения категорий результатов. Часто граница между положительным и отрицательным результатом
Количественный анализ силы экспрессии определенных антигенов на поверхности клеток имеет зависимость от плотности антигена на поверхности клетки, оптимальности иммуномаркирования и собственных особенностей флуорохрома. Использование контрольных частиц поможет определить границу фонового и целевого сигнала, а также провести сравнение разных инструментов по этому параметру [2]
>
о Ь
а р
« ©
Фактор переноса учитывает риск контаминации одного образца другим, который нужно учитывать в процессе разработки дизайна процесса валидации, так как образцы в одной партии могут иметь одновременно крайне низкие и очень высокие концентрации клеточной популяции (или популяций) в своем составе. Даже малое загрязнение может привести к ложноположительными результатам ввиду высокой чувствительности анализа. Величина риска контаминации между двумя отдельно взятыми образцами зависит от процесса подготовки образцов, а также работы оператора (смена носиков дозаторов между образцами и промывки). Проверка на наличие фактора переноса в ходе валидации проводится методом расположения пустых пробирок между пробирками, содержащими образец. Если после завершения анализа пустые пробирки показывают положительный результат (необходимо принять во внимание LOB, LOD и нижний предел LOQ), необходимо провести меры по ликвидации переноса в ходе анализа. Данные из пустых пробирок необходимо собирать в рамках той же стратегии гейтирования, что и для тестовых образцов [14]. При этом тестовые образцы должны давать сигнал, не менее, чем в 100 раз превышающий холостые пробы [2]
§ и
Ё в
|с »
ш «
1-° а M
I ё
S
И И
» S
» >•
ss ^
-о В
g о
® ж
со td
Т. >
m со
Примечание. БМКП - биомедицинский клеточный продукт; ВТЛП (limit of blank); LOD - предел обнаружения (limit of detection); LOO -
- высокотехнологичный лекарственный препарат; CV— коэффициент вариации; LOB -предел количественного определения (limit of quantification).
предел холостой пробы
и» чо
Зависимость минимально необходимого количества редких событий от доли этих клеток в популяции для разных коэффициентов вариации
Видно, что с увеличением точности измерения и снижением доли искомой субпопуляции в образце общее количество событий растет квадратично.
клеток рекомендуется проводить при помощи автоматического счетчика клеток. Однако стоит иметь в виду, что такой подход не оправдан, если известно, что в образце очень малое количество клеток или недостаточный объем образца не позволяет провести подсчет в автоматическом счетчике. В таком случае альтернативой будет ручной подсчет в камере гемоцитометра [5, 6] или цитометрические пробирки с заранее расфасованными частицами (например, ББ ТгисоиП). Какой бы метод подсчета концентрации клеток и их жизнеспособности в продуктах, содержащих клетки человека, ни был выбран, он также должен быть валидирован [17].
Эти особенности подготовки образцов для вали-дации методик, в котором анализируются жизнеспособные клетки человека в составе БМКП и ВТЛП, указывают на необходимость тщательного планирования при разработке дизайна процесса валидации, а также влияют на определение чувствительности, линейности, прецизионности, ЬОБ и ЬОр.
Используемые реактивы и оборудование
В мире на данный момент не существует «золотого стандарта» для определения правильности фенотипа определенной популяции клеток, а также абсолютной количественной величины, характеризующей этот параметр. Специфичность антител к определенным антигенам на поверхности клеток может широко варьировать в зависимости от клона, из которого они произведены, конъюгата, производителя и других параметров. С другой стороны, различные антитела могут связывать один и тот же антиген, что может повлиять на специфичность, если вероятность такого перекрестного связывания не будет учтена перед экспериментом или в ходе интерпретации результатов [2]. Расчет необходимого количества антител, которое будет добавлено
в каждый образец, необходимо проводить, исходя из результата подсчета концентрации клеток в образце непосредственно в день анализа.
Широкий ассортимент различных флуорохромов, доступный на сегодняшний день для проточной цитофлуориметрии, обусловливает рекомендации проведения валидационных исследований для каждого красителя на достаточном количестве образцов (5 или более). Такой эксперимент позволит исследователям убедиться в том, что используемые ими красители не меняют экспрессию изучаемого антигена [5, 6].
В постоянно меняющемся ландшафте биологических знаний, новых методов терапии и открывающихся новых технологических возможностей (в котором новые и оптимизированные комбинации антител иногда приходится включать в существующие исследования для повышения качества анализа) важно, чтобы протоколы применения антител оставались гибкими [2]. Известно, что сигнал интенсивности флуоресценции может варьировать в определенном диапазоне в зависимости от прибора, его настроек, аналитика и лаборатории. Поэтому рекомендуется проводить калибровку прибора, используя стандарты и/или калибровочные частицы [3].
Калибровка проточного цитофлуориметра для анализа количества антител на поверхности клетки может проводиться несколькими способами. Первый подход основан на использовании калибровочных частиц с известным количеством молекул флуорохрома на своей поверхности, известным количеством антител, либо известным значением емкости или аффинности к определенным антигенам. Другой подход подразумевает калибровку на клетках с заранее определенным средним значением антител, которые способны связаться с поверхностными рецепторами клетки. Помимо калибровки путем измерения заранее охарактеризованных частиц или клеток, существует также метод программной компенсации различий сигнала между разными партиями одного и того же красителя или партиями калибровочных частиц [7]. Калибровка интенсивности флуоресценции на контрольных образцах крови является подходящей для валидации не только качества реагентов, но также и процесса окрашивания клеток и состояния образца.
В целом рекомендуется проводить валидацию на наиболее репрезентативных типах образцов, которые наилучшим образом представляют образцы, которые впоследствии будут использоваться в данном анализе.
Редкие события
В ходе разработки дизайна валидации цитофлуори-метрического исследования образцов для экспертизы качества препарата клеточной терапии, а также диагностирования заболеваний или в рамках научно-исследовательской работы может возникнуть потребность в получении данных о редких или крайне редких событиях. Для достоверного результата редких событий требуется большое их количество (рис. 1), что значительно
Таблица 2. Общее количество клеток, необходимое для определения требуемого количества событий с различной частотой появления в популяции [2]
% клеток Коэффициент вариации СУ, % (требуемое количество событий 1)
в популяции СУ = 40 % СУ = 20 % СУ = 10 % СУ = 5 % СУ = 2 % СУ = 1 %
(Р) (1 = 6) (1 = 25) (1 = 100) (1 = 400) (1 = 2500) (1 = 10000)
5 125 500 2000 8000 5х104 2х105
2 313 1250 5000 2х104 1,25х105 5х105
1 625 2500 104 4х104 2,5х105 106
0.1 6250 2,5х104 105 4х105 2,5х106 107
Редкие события [18]
0.01 6,25х104 2,5х105 106 4х106 2,5х107 108
0.001 6,25х105 2,5х106 107 4х107 2,5х108 109
0.0001 6,25х106 2,5х107 108 4х108 2,5х109 1010
увеличивает минимально необходимое количество клеток в образце, которое следует проанализировать на приборе (табл. 2) [2].
Значения, указанные в табл. 2, получены на основе распределения Пуассона, которое при достаточно большом ожидаемом числе событий стремится к нормальному распределению.
На основе этого для получения других значений необходимо сперва определить количество событий, которое нужно получить на цитометре, исходя из коэф-фициента вариации (СУ), требуемого в данном исследовании:
/100\2 я=Ы.
Затем вычислить минимальное требуемое количество клеток N по формуле:
В некоторых случаях, когда искомые события очень редки либо вариабельность результатов высока, могут понадобиться дополнительная оценка и статистический анализ.
Компенсация
Введение коэффициентов компенсации - это прием, используемый в проточной цитометрии для корректировки и минимизации искажения данных, получаемых, когда флуорохром имеет диапазон испускания, пересекающийся с каналами, не предназначенными для его детекции. Такие каналы называются вторичными, а единственный канал, в котором должен регистрироваться сигнал данного флуорохрома, называется первичным. Это важный этап проведения анализа, поэтому он должен быть учтен в процессе проведения валидации. Введение коэффициентов компенсации позволяет свести к минимуму засветы на вторичных каналах, которые могут влиять на результаты анализа.
Компенсация выполняется вычитанием определенного процента сигнала, полученного в первичном канале, из сигналов во вторичных каналах.
Процесс ручной настройки флуоресцентной компенсации на детекторах цитофлуориметра основан на визуальной оценке представления полученных данных на графиках, в связи с чем подвержен ошибкам, связанным с субъективным восприятием оператора, проводящего настройку.
Для современных приборов и программного обеспечения существуют встроенные алгоритмы автоматической настройки компенсации напряжений, использование которых в большинстве случаев предпочтительнее, так как приводит к более повторяемым результатам. Применение таких алгоритмов - более простое и удобное решение этого вопроса, однако оно подразумевает использование специальных реагентов, которые значительно удорожают стоимость исследования [19].
Введение и регулировка коэффициентов компенсации в ходе валидации метода проточной цитофлуо-риметрии для БМКП/ВТЛП чрезвычайно важны, так как они помогают обеспечить надежность полученных данных с высокой правильностью и прецизионностью и минимизировать вероятность получения ложно-положительных и ложноотрицательных результатов (поскольку сигнал каждого используемого флуоро-хрома регистрируется только в одном канале), а также увеличивает чувствительность детекции во вторичных каналах за счет уменьшения нежелательных сигналов. Использование этого инструмента также увеличивает разрешение анализа и, соответственно, его чувствительность, приводя к более точному результату анализа фенотипа целевых клеток в препаратах клеточной терапии.
Проведение валидации на двух или более приборах (даже одной и той же модели) имеет свои особенности в рамках анализа БМКП/ВТЛП методом проточной цитофлуориметрии. Коэффициент вариации между разными моделями одного типа прибора может достигать достаточно высоких величин (> 15 % СУ), это необходимо принимать во внимание при использовании нескольких приборов в рамках проведения исследо-
вания [7]. Из-за того что чувствительность, заводская калибровка детекторов и параметры компенсации на каждом приборе могут немного отличаться, настройку нескольких приборов перед проведением валидации следует проводить с использованием калибровочных частиц или заранее охарактеризованных клеточных образцов. Поэтому при проведении исследования на более чем двух различных приборах полезно изучить величину относительной ошибки между ними, особенно, если анализ проводится на границе предела обнаружения, где различия в показаниях разных приборов могут быть значительными. Для этого можно провести анализ одного и того же контрольного образца последовательно на двух разных моделях прибора и таким образом определить величину их относительной ошибки, которую впоследствии можно будет компенсировать нормализацией полученных данных. Важно настроить оба прибора таким образом, чтобы результаты анализа одного и того же образца на разных приборах были наиболее схожими. В таком случае данные валидации по таким параметрам, как правильность, повторяемость и межлабораторная прецизионность, будут наиболее достоверными.
Если в лаборатории в наличии только один проточный цитометр, его абсолютный уровень производительности определять необязательно. Однако, несмотря на это, объективная оценка работы прибора крайне важна для гарантии получения стабильных результатов анализа [7].
Заключение
Фенотипирование клеточных линий (клеток) является одним из ключевых исследований в оценке качества и подтверждении подлинности препаратов на основе жизнеспособных клеток человека (БМКП/ ВТЛП). Наиболее часто для выполнения фенотипиро-вания используется проточная цитометрия, позволяющая в короткие сроки проанализировать клеточную суспензию по многим параметрам. Данная методика для каждой конкретной клеточной линии подразумевает валидацию, которая имеет множество особенностей.
В данном исследовании на основании анализа документов и научной литературы были выделены ключевые параметры валидации методики фенотипиро-вания клеточных линий, которые включают основные: правильность, прецизионность, специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, аналитическая область; и дополняющие: чувствительность, граничное значение и фактор переноса.
Описаны особенности валидации методики, связанные с трудностями при работе с образцами, содержащими жизнеспособные клетки, используемыми реактивами и оборудованием, редкими событиями и компенсацией, и их воздействие на ключевые параметры валидации. Показана необходимость тщательного планирования дизайна процесса валидации вследствие сложности приготовления контролей, наличия индивидуальных характеристик клеток, разного уровня аутофлуоресценции, ограничений по сроку годности и стабильности образцов и других особенностей. Установлено, что из-за отсутствия единого стандарта для определения правильности фенотипа популяции клеток и количественной величины, характеризующей этот параметр, необходимо учитывать специфику работы с антителами в проточной цитометрии, вероятность перекрестного связывания, а также калибровку прибора для обеспечения точности измерений фенотипа популяции клеток. Кроме того, представлен метод расчета общего количества клеток, которое требуется для определения заданного количества редких событий, а также освещена проблема компенсации в проточной цитомет-рии, ее вклад в искажения получаемых данных и способы минимизации этих искажений для увеличения точности и чувствительности анализа и достижения надежных результатов.
В дальнейшем авторы планируют разработать рекомендации по составлению дизайна валидации методик проточной цитофлуориметрии, их проведению, получению и обработке результатов, а также выбору критериев приемлемости полученных результатов.
■ Литература
1. Трусов Г.А., Чапленко А.А., Семенова И.С., Мельникова Е.В., Олефир Ю.В. Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2018; 18 (1): 16-24. DOI: https://doi. org/10.30895/2221-996X-2018-18-1-16-24
2. Lambert C., Yanikkaya D. G., Keller T., Preijers F., Psarra K., Schiemann M., Ôzçûrûmez M., Sack U. Flow Cytometric Analyses of Lymphocyte Markers in Immune Oncology: A Comprehensive Guidance for Validation Practice According to Laws and Standards. Front. Immunol. 2020; 11: 2169. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.02169
3. O'Hara D.M., Xu Y., Liang Z., Reddy M.P., Wu D.Y., Litwin V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. Journal of Immunological Methods. 2011; 363 (2): 120-34. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2010.09.036
4. Vigano M., Budelli S., Lavazza C., Montemurro T., Montelatici E., De Cesare S., Lazzari L., Orlandi A.R., Lunghi G., Giordano R. Tips and Tricks for Validation of Quality Control Analytical Methods in
Good Manufacturing Practice Mesenchymal Stromal Cell Production. Stem Cells International. 2018; 2018: 1-16. DOI: https://doi. org/10.1155/2018/3038565
5. Davis B.H., Wood B., Oldaker T., Barnett D. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS -part I - rationale and aims. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 282-5. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21104
6. Davis B.H., Dasgupta A., Kussick S., Han J.Y., Estrellado A. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part II - preanalytical issues. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 286-90. DOI: https://doi.org/10.1002/ cyto.b.21105
7. Tangri S., Vall H., Kaplan D., Hoffman B., Purvis N., Porwit A., Hunsberger B., Shankey T.V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part III - analytical issues. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 291-308. DOI: https:// doi.org/10.1002/cyto.b.21106
8. Barnett D., Louzao R., Gambell P., De J., Oldaker T., Hanson C.A. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part IV - postanalytic considerations. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 309-14. DOI: https://doi.org/10.1002/ cyto.b.21107
9. Wood B., Jevremovic D., Béné M.C., Yan M., Jacobs P., Litwin V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 315-23. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21108
10. CLSI. H62. Validation of Assays Performed by Flow Cytometry. 1st ed. 2021. 234 p. ISBN: 978-1-68440-128-4
11. Lee J.W., Devanarayan V., Barrett Y.C., Weiner R., Allinson J., Fountain S., Keller S., Weinryb I., Green M., Duan L., Rogers J.A., Millham R., O'Brien P.J., Sailstad J., Khan M., Ray C., Wagner J. A. Fit-for-Purpose Method Development and Validation for Successful Biomarker Measurement. Pharm Res. 2006; 23 (2): 312-28. DOI: https:// doi.org/10.1007/s11095-005-9045-3
12. European Medicines Agency (EMA). ICH Topic Q2 (R2) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2023. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q2r2-guideline-validation-analytical-procedures-step-5-revision-1_en.pdf
13. Министерство Здравоохранения Российской Федерации. Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания. ОФС. 1.1.0012 «Валидация аналитических методик». 2023. URL:
https://pharmacopoeia.regmed.rU/pharmacopoeia/izdanie-15/1/1-1/ validatsiya-analiticheskikh-metodik/
14. Selliah N., Nash V., Eck S., Green C., Oldaker T., Stewart J., Vitaliti A., Litwin V. Flow Cytometry Method Validation Protocols. Current Protocols. 2023; 3 (8): e868. DOI: https://doi.org/10.1002/cpz1.868
15. Sommer U., Eck S., Marszalek L., Stewart J.J., Bradford J., McCloskey T.W., Green C., Vitaliti A., Oldaker T., Litwin V. High-sensitivity flow cytometric assays: Considerations for design control and analytical validation for identification of Rare events. Cytometry Part B Clinical. 2021; 100 (1): 42-51. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21949
16. CLSI. H42. Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry. 2nd ed. 2007. 88 p. ISBN: 1-56238-640-9.
17. Vodyakova M.A., Pokrovsky N.S., Melnikova E.V., Merku-lov V.A. Recommendations for Validation of Automated Viable Cell Counting Methods (Review). Drug development & registration. 2023; 12 (4): 217-22. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2023-12-4-1424
18. Donnenberg A.D., Donnenberg V.S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 2007; 27 (3): 627-52. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cll.2007.05.013
19. Хайдуков С. В. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для иммунофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа. Медицинская иммунология. 2014; 9 (6): 569. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2007-6-569-574
■ References
1. Trusov G.A., Chaplenko A.A., Semenova I.S., Melnikova E.V., Olefir Yu.V. Use of Flow Cytometry for Quality Evaluation of Biomedical Cell Products. Biopreparaty Profilaktika, diagnostika, lechenie. 2018; 18 (1): 16-24. DOI: https://doi.org/10.30895/2221-996X-2018-18-1-16-24 (in Russian)
2. Lambert C., Yanikkaya D. G., Keller T., Preijers F., Psarra K., Schiemann M., Ozçûrûmez M., Sack U. Flow Cytometric Analyses of Lymphocyte Markers in Immune Oncology: A Comprehensive Guidance for Validation Practice According to Laws and Standards. Front Immunol. 2020; 11: 2169. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.02169
3. O'Hara D.M., Xu Y., Liang Z., Reddy M.P., Wu D.Y., Litwin V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. Journal of Immunological Methods. 2011; 363 (2): 120-34. DOI: https://doi.org/10.1016/jjim.2010.09.036
4. Vigano M., Budelli S., Lavazza C., Montemurro T., Montelatici E., De Cesare S., Lazzari L., Orlandi A.R., Lunghi G., Giordano R. Tips and Tricks for Validation of Quality Control Analytical Methods in Good Manufacturing Practice Mesenchymal Stromal Cell Production. Stem Cells International. 2018; 2018: 1-16. DOI: https://doi. org/10.1155/2018/3038565
5. Davis B.H., Wood B., Oldaker T., Barnett D. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS -part I - rationale and aims. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 282-5. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21104
6. Davis B.H., Dasgupta A., Kussick S., Han J.Y., Estrellado A. Validation of cell-based fluorescence assays: practice guidelines from the ICSH and ICCS - part II - preanalytical issues. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 286-90. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21105
7. Tangri S., Vall H., Kaplan D., Hoffman B., Purvis N., Porwit A., Hunsberger B., Shankey T.V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part III - analytical issues. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 291-308. DOI: https:// doi.org/10.1002/cyto.b.21106
8. Barnett D., Louzao R., Gambell P., De J., Oldaker T., Hanson C.A. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part IV - postanalytic considerations. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 309-14. DOI: https://doi.org/10.1002/ cyto.b.21107
9. Wood B., Jevremovic D., Béné M.C., Yan M., Jacobs P., Litwin V. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS - part V - assay performance criteria. Cytometry Part B:
Clinical Cytometry. 2013; 84 (5): 315-23. DOI: https://doi.org/10.1002/ cyto.b.21108
10. CLSI. H62. Validation of Assays Performed by Flow Cytometry. 1st ed. 2021. 234 p. ISBN: 978-1-68440-128-4.
11. Lee J.W., Devanarayan V., Barrett Y.C., Weiner R., Allinson J., Fountain S., Keller S., Weinryb I., Green M., Duan L., Rogers J.A., Millham R., O'Brien P.J., Sailstad J., Khan M., Ray C., Wagner J.A. Fit-for-Purpose Method Development and Validation for Successful Biomarker Measurement. Pharm Res. 2006; 23 (2): 312-28. DOI: https:// doi.org/10.1007/s11095-005-9045-3
12. European Medicines Agency (EMA). ICH Topic Q2 (R2) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2023. URL: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/ich-q2r2-guideline-validation-analytical-procedures-step-5-revision-1_en.pdf
13. The Ministry of Health of the Russian Federation. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation XV edition. OFS. 1.1.0012 «Validation of analytical techniques». 2023. URL: https://pharmacopoeia. regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-15/1/1-1/validatsiya-analiticheskikh-metodik/ (in Russian)
14. Selliah N., Nash V., Eck S., Green C., Oldaker T., Stewart J., Vitaliti A., Litwin V. Flow Cytometry Method Validation Protocols. Current Protocols. 2023; 3 (8): e868. DOI: https://doi.org/10.1002/cpz1.868
15. Sommer U., Eck S., Marszalek L., Stewart J.J., Bradford J., McCloskey T.W., Green C., Vitaliti A., Oldaker T., Litwin V. High-sensitivity flow cytometric assays: Considerations for design control and analytical validation for identification of Rare events. Cytometry Part B Clinical. 2021; 100 (1): 42-51. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.b.21949
16. CLSI. H42. Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry. 2nd ed. 2007. 88 p. ISBN: 1-56238-640-9.
17. Vodyakova M.A., Pokrovsky N.S., Melnikova E.V., Merku-lov V.A. Recommendations for Validation of Automated Viable Cell Counting Methods (Review). Drug development & registration. 2023; 12 (4): 217-22. DOI: https://doi.org/10.33380/2305-2066-2023-12-4-1424
18. Donnenberg A.D., Donnenberg V.S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 2007; 27 (3): 627-52. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cll.2007.05.013
19. Khaidukov S.V. Approaches to standardization of the flow cytometry method for cells immunophenotiping. Cytometrs adjustment and preparation of protocols for analysis. Med immunol. 2014; 9 (6): 569. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2007-6-569-574 (in Russian)
Сведения об авторах
Покровский Никита Станиславович - эксперт 2-й категории лаб. биомедицинских клеточных продуктов ИЦЭКЛС ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: pokrovsky.ns@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-2355-0879
Водякова Марина Андреевна - канд. фарм. наук, ведущий эксперт лаб. биомедицинских клеточных продуктов ИЦЭКЛС ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: vodyakova@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-6008-0554
Меркулов Вадим Анатольевич - д-р мед. наук, проф., зам. ген. директора по экспертизе лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: merkulov@expmed.ru http://orcid.org/0000-0003-4891-973X
Мельникова Екатерина Валерьевна - канд. биол. наук, начальник лаборатории биомедицинских клеточных продуктов ИЦЭКЛС ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: melnikovaev@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-9585-3545
Authors' information
Nikita S. Pokrovsky - 2nd category Expert of the Biomedical Cell Products Lab., TC MPQC of the SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: pokrovsky.ns@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-2355-0879
Marina A. Vodyakova - PhD, Leader Expert of the Biomedical Cell Products Lab., TC MPQC of the SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: vodyakova@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-6008-0554
Vadim A. Merkulov - MD, PhD, Prof., Deputy General Director for the Expertise of Medicines of the SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: merkulov@expmed.ru http://orcid.org/0000-0003-4891-973X
Ekaterina V. Melnikova - PhD, Head of the Biomedical Cell Products Lab., TC MPQC of the SCEEMP of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: melnikovaev@expmed.ru http://orcid.org/0000-0002-9585-3545
