CC BY
81
МОРФОЛОГИЯ И ОБЩАЯ ПАТОЛОГИЯ
УДК 611.018.63
ОСОБЕННОСТИ ГИСТОХИМИЧЕСКОЙ И ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ ТКАНЕЙ СЕРДЦА В ПРОЦЕССЕ АДАПТАЦИИ К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
Л.Г.Прошина, Н.П. Федорова, О.С.Быкова
Институт медицинского образования НовГУ, Lidiya.Proshina@novsu.ru
Исследованы гистохимические и иммуноцитохимические особенности кардиомиоцитов в экспериментальных моделях хронической сердечной недостаточности и эмоциональном стрессе. Выявлено, что экспериментальная хроническая сердечная недостаточность и эмоциональный стресс вызывают функциональную и структурную перестройку тканей миокарда и предрасположенность кардиомиоцитов к апоптозу. Реактивные изменения клеток и тканей миокарда носят адаптивнокомпенсаторный характер.
Ключевые слова: адаптация, стресс, гистохимия, иммуноцитохимия, кардиомиоциты, экспериментальная сердечная недостаточность, апоптоз
Characteristics of gistochemestrycal and immunocytochemestrycal myocardial changes in experimental cardiac failure and stress were investigated. It is shown that experimental cardiac failure and emotional stress caused functional and structure changes of cardiac parenchyma and stroma with aptitude of cardiomyocytes to apoptosis. Responsive changes of cardiac cells and tissues had adptive-compensatory character.
Keywords: adaptation, stress, gistochemestry, immunocytochemestry, cardiomyocytes, experimental cardiac failure, apoptosis
Адаптация биологических систем имеет в своей основе метаболическую адаптацию, отсюда особый интерес представляет изучение цитохимических изменений тканей и клеточных структур (определяющих их функциональные потенции) при экстремальных воздействиях. В структуре заболеваемости и смертности сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующие место [1]. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) является тяжелым осложнением практически всех болезней сердца, отягощающим их течение и прогноз. В настоящее время установлена четкая взаимосвязь между психоэмоциональным состоянием и патологией миокарда. Изучение морфологических основ адаптивных, реактивных и регенераторных изменений миокарда при патологии различного генеза, в частности при ХСН и стрессе, является важной составляющей современной медицины. ХСН встречается достаточно часто, несмотря на достижения в диагностике и лечении заболеваний сердца, поэтому поиск новых маркеров прогнозирования ее течения и эффективных средств терапии остается актуальным [2]. Кардиомиоциты являются детерминированными клетками миокарда, их потеря при экстремальных воздействиях и в частности ХСН и стрессе различной этиологии, в значительной мере определяет степень нарушения его сократительной способности [3,4]. На современном этапе развития медицины имеется значительное количество публикаций о патологии сердца [5,6], однако сведения о функциональных возможностях клеток миокарда при различной степени деструктивных изменений в процессе перестройки сердца под влиянием экспериментальных моделей ХСН и стресса противоречивы и недостаточны, неоднозначны материалы об индуктивных воздействиях и вкладе апоптоза в процессы гибели кардиомиоцитов.
Целью настоящего исследования является анализ метаболических, иммуноцитохимических и структурных особенностей миокарда при экспериментальных моделях хронической сердечной недостаточности и эмоционального стресса.
Материалы и методы
Исследование выполнено на крысах — самцах линии Wistar средней массой 200-220 г. Животные получены из питомника лабораторных животных «Раппо-лово» РАМН, Ленинградской области. Экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ЕТС N 123) (Страсбург, 18 марта 1986 г.).
Для исследования морфологических, иммуно-гистохимических и цитохимических особенностей кардиомиоцитов были сформированы три группы животных:
I. Интактные — содержались на стандартном рационе вивария.
II. Группа животных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН). Модель ХСН воспроизводилась по методу В.И.Инчиной (2000 г.), путем 20минутного плавания крыс до глубокого утомления, с предварительным введением им за 10-15 минут до плавания 0,1 мл 1% раствора мезатона в течение 14 дней.
III. Группа животных с эмоциональным стрессом. С целью определения индивидуально-типологических особенностей поведения и прогностической оценки устойчивости крыс к эмоциональному стрессу их предварительно подвергали модифицированному тесту «Открытое поле» (ОП). В качестве модели эмоционального стресса использовали иммобилизацию
животных с дополнительным апериодическим элек-трокожным раздражением. Через трое суток после тестирования в открытом поле крыс помещали в индивидуальные плексигласовые боксы, ограничивающие движения. Электрокожное раздражение наносили в области хвоста по стохастической схеме пороговым значением переменного тока, напряжением 4-6 В, частотой 50 Гц, длительностью импульсов 1 мсек. Продолжительность каждой стимуляции составляла 30 сек. — 1 мин. В качестве критериев устойчивости животных к экспериментальному стрессу использовали следующие показатели: 1) показатели поведения в тесте «ОП»; 2) изменение органов стресс-маркеров в условиях экспериментального стресса — гипертрофия надпочечников инволюция тимуса; 3) критерий выживаемости в условиях эмоционального стресса [7].
Материалом исследования служили ткани миокарда. Парафиновые срезы для морфологического исследования окрашивали гематоксилином-эозином и по Ван-Гизону. Морфометрически оценивалось количество (в объемных процентах, об.%) кардиомиоци-тов (КМЦ), сосудов и межклеточного вещества. Вычисляли соотношение КМЦ и межклеточного вещества, включающего соединительную ткань.
Известно, что стрессовая ситуация сопровождается изменением окислительно-восстановительного гомеостаза. Об интенсивности процессов ПОЛ в сердечной ткани судили по содержанию диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) [8]. Исследовали активность ферментов антиокси-дантной системы защиты (АОС): супероксидисмута-зы (СОД) и каталазы (КАТ) в тканях сердца [9].
В настоящее время имеются сведения о значительной роли апоптоза при ишемических повреждениях сердца и инфаркте миокарда [2,3,6], в связи с чем в данном исследовании изучали роль апоптоза в деструктивных изменениях тканей сердца. Определение экспрессии кардиомиоцитами ключевых белков-регуляторов апоптоза (Ьс1-2 и Ьах) выполнялось при помощи двухэтапного авидин-биотинового метода с демаскировкой антигена (путем высокотемпературной обработки ткани) на парафиновых срезах с использованием моноклональных антител и визуализирующей системы фирмы «Бако Суйтайоп» [9]. Результаты иммуногистохими-ческой реакции оценивались в световом микроскопе: для апоптоза — как отношение прореагировавших клеток к их общему количеству в 10 полях зрения. Функциональная активность кардиомиоцитов оценивалась по содержанию ключевых ферментов: лактатдегидрогена-зы (ЛДГ), сукцинатдегидрогеназы (СД) и гликогена по Э.Пирсу (1962) в собственной модификации.
Результаты исследования
Морфологический анализ миокарда контрольных групп животных продемонстрировал следующую картину. При средней массе крыс 250 ± 16,2 г масса сердца составляла 95,5 ± 41,6 мг. Относительная масса сердца к массе тела (мг на 1 грамм) равнялась 3,8. Объемная плотность кардиомиоцитов равна 85,5 ± 5,2 об.%; межклеточного вещества (включавшего аморфное вещество и коллагеновые волокна) — 14,5% ± 0,1 об.%. Соотно-
шение КМЦ и межклеточного вещества составляет 5,9. Строма миокарда представлена рыхлой соединительной тканью, оплетающей кардиомиоциты и включающей большое количество капилляров, объемная плотность которых составляет 7,4 ± 0,1 об.%.
Экспериментальная сердечная недостаточность вызвала деструкцию мышечных волокон. Выявляются контрактурные повреждения кардиомиоцитов, в ряде клеток имеет место ослабление анизотропии дисков А или исчезновение анизотропных структур в отдельных кардиомиоцитах. Объемная плотность кардиомиоцитов II группы животных уменьшилась на 27%, а III группы — на 23% по сравнению с интакт-ными. Объемная плотность капилляров снизилась на 17% и на 15% соответственно. Содержание межклеточного вещества возросло у II группы животных на 32%, у III группы — на 28% по сравнению с интакт-ными крысами (I группа животных). Соотношение КМЦ и стромальных компонентов миокарда при хронической сердечной недостаточности составило 1,5, а при эмоциональном стрессе — 3,5, что практически, в 4 и в 2 раза меньше, чем у интактных животных (5,9).
Иммуногистохимическое исследование показало, что экспрессия кардиомиоцитами антиапоптотиче-ского белка Ьс1-2 в группе контроля (группа I) выше, чем в группах с ХСН (группа II) и эмоционального стресса (группа III), достоверных различий эксперес-сии этого белка в экспериментальных группах не выявлено. Частота экспрессии проапоптотического белка Ьах повышается в экспериментальных группах (II, III) в 2,5 и в 2 раза соответственно (рис.1).
0,6
контроль ХСН стресс
□ Ьо,1-2 ■ bax
Рис.1. Частота экспрессии кардиомиоцитами антиапоптотиче-ского белка Ь^-2 и проапоптотического белка bax в норме, при экспериментальной сердечной недостаточности и при эмоциональном стрессе; * — р < 0,05, по сравнению с контролем
Анализ полученных данных свидетельствует о повышении содержания в кардиомиоцитах белка Ьах, который является маркером запуска программированной гибели клеток при ХСН и стрессе. Частота экспрессии кардиомиоцитами проапоптотического белка Ьах при ХСН выражена больше, в то время как экспрессия антиапоптотического белка Ьс1-2 при ХСН выражена меньше. Вышеизложенное свидетельствует о значительном вкладе апоптоза в процесс гибели кардиомиоцитов и, по всей видимости, послужило индукцией для развития соединительнотканных компонентов (в частности, коллагеновых волокон).
Исследование содержания гликогена в кардио-миоцитах показало, что его уровень во II экспериментальной группе снизился на 64%, во III группе — на 21%; активность ЛДГ — на 42% и на 72%; СДГ — на 23% и на 12% соответственно по сравнению с кардио-миоцитами интактных животных (рис.2). То есть как при ХСН, так и при эмоциональном стрессе, прослеживается снижение метаболической активности исследуемых ферментов, следовательно, и функциональных возможностей кардиомиоцитов, однако интенсивность падения энзимов в различных ситуациях неоднозначна, что, очевидно, свидетельствует о различном вкладе исследуемых ферментов в патогенез ХСН и стресса.
□ К КЗ ХСН ЕЗ стресс
Рис.2. Активность СДГ, ЛДГ и гликогена в кардиомиоцитах крыс линии Wistar в I, II и III экспериментальных группах; * — р < 0,05, по сравнению с контролем
дантов, что может быть интерпретировано как окси-дативный стресс, присутствующий как при ХСН, так и при эмоциональном стрессе. Однако при эмоциональном стрессе отмечается более выраженное падение антиоксидантных ферментов.
Заключение
Таким образом, изменения кардиомиоцитов в экспериментальных ситуациях хронической сердечной недостаточности и эмоционального стресса носят неспецифический характер: как при ХСН, так и при стрессе наблюдается уменьшение объемной плотности кардиомиоцитов и повышение объемной плотности соединительно-тканного компартмента. Однона-правлена, но с разной степенью выражена метаболическая активность СДГ, ЛДГ и гликогена. На модификацию функциональной активности и структурной организации миокарда, очевидно, оказывает определенное влияние окислительный стресс. Проведенное исследование демонстрирует более выраженную предрасположенность кардиомиоцитов к запуску программы гибели клеток в условиях повышенной нагрузки при ХСН. Морфофункциональные изменения носят адаптивно-компенсаторный характер и вызваны реакцией клеток и тканей на экстремальные воздействия ХСН и стресса.
Научно-исследовательская работы выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
Содержание продуктов ПОЛ и ферментов АОС в тканях сердца у крыс линии Wistar в норме при экспериментальной хронической недостаточности и эмоциональном стрессе
Серия эксперимента ДК, Е/г ткани МДА, нмоль/500 мг ткани в час СОД, ед/мин.мг белка КАТ, ед/мин.мг белка
Контроль I группа 0,87 ± 0,05 0,695 ± 0,041 1,71 ± 0,14 0,233 ± 0,015
Хроническая сердечная недостаточность II группа 1,67 ± 0,05* 0,859 ± 0,050* 0,65 ± 0,16* 0,326 ± 0,011
Эмоциональный стресс III группа 1,87 ± 0,08* 1,302 ± 0,043* 0,41 ± 0,07* 0,073 ± 0,006*
Примечание: * — p < 0,05, по сравнению с контролем.
В норме содержание ДК в тканях миокарда составляет 0,87 ± 0,05 Е/г ткани, МДА — 0,695 ± 0,041 нмоль/500 мг ткани в час. Активность СОД и КАТ составляет 1,71 ± 0,14 ед/мин.мг белка, — 0,233 ± 0,015 ед/мин.мг белка соответственно. В условиях экспериментальной хронической сердечной недостаточности и эмоционального стресса наблюдается значительное повышение содержание продуктов ПОЛ на 215% и 126% соответственно. Активность ферментов АОС при хронической сердечной недостаточности снижается: СОД — на 87%, КАТ — на 88%. При эмоциональном стрессе активность СОД снизилась на 76%, КАТ — на 69% (см. таб.).
Анализ содержания ДК, МДА в кардиомиоци-тах свидетельствует о смещении окислительновосстановительного гомеостаза в сторону проокси-
1. Казаков В.А., Суходоло И.В., Шипулин В.М., Миллер А.А. // Сибирский медицинский журнал. 2009. №4. Вып.1. С.6-11.
2. Бершова Т.В., Монаенкова С.В., Гасанов А.Г. // Педиатрия. 2009. Т.88. №5. С.147-154.
3. Залесский В.Н., Гавриленко Т.И., Фильченков А.А. // Лікарска справка. 2002. №1. С.21-24.
4. Bing O.H. // J. Mol. Cell Cordial. 1994. №26(8). P.943-948.
5. Fukuda N., Granzier H. // Curr. Vasc. Pharmacol. 2004. Vol.2. P.135-139.
6. Хлапов А.П., Вечерский Ю.Ю., Рязанцева Н.В., Калюжин
B.В. и др. // Бюл. сибирской медицины. 2008. №3. С.33-38.
7. Щеголева А.Н., Коплик Е.В., Прошина Л.Г. // Актуальные проблемы современной медицины. 2006. Т.8. С.176-177.
8. Гаврилов В.Г., Мешкорудная М.И. // Лаб. дело. 1983. №3.
C.33-35.
9. Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногистоцитохимия: Методические рекомендации. СПб.: ВЦЭРМ МСЧ России, 2001. С.36.
