CC BY
28
ОСОБЕННОСТ ДЕТЕРМИ
DOI: 10.17691/st_____________
УДК 615.281.5:575:616.921.5 Поступила 12.05.2022 г.
¡ИФИДОБАКТЕРИИ, ЮСПЕЦМФИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
A.Г. Точилина, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории микробиома человека и средств его коррекции1; доцент кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины2;
И.В. Белова, к.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микробиома человека и средств его коррекции1; доцент кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины2; Т.Н. Ильичева, д.б.н., ведущий научный сотрудник отдела зоонозных инфекций и гриппа3;
B.Ю. Марченко, к.б.н., ведущий научный сотрудник отдела зоонозных инфекций и гриппа3;
B.А. Жирнов, к.б.н., научный сотрудник лаборатории микробиома человека и средств его коррекции1;
C.Б. Молодцова, научный сотрудник лаборатории микробиома человека и средств его коррекции1; .В. Иконников, лаборант-исследователь2;
И.В. Мухина, д.б.н., профессор, директор Института фундаментальной медицины, зав. кафедрой нормальной физиологии им. Н.Ю. Беленкова2; А.С. Благонравова, д.м.н., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики; профессор кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины; проректор по научной работе2;
И.В. Соловьева, д.б.н., доцент, ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией микробиома человека и средств его коррекции1
Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, ул. М. Ямская, 71, Н. Новгород, 603950; 2Приволжский исследовательский медицинский университет, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005;
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Новосибирская область, 630559
Цель исследования — анализ особенностей генома пробиотических штаммов Bifidobacterium longum 379, Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium bifidum 791 и изучение их противовирусной активности.
Материалы и методы. Проведено полногеномное секвенирование трех штаммов бифидобактерий с использованием платформы MiSeq (Illumina Inc., США). Аннотацию геномов выполняли с помощью утилиты Prokka v. 1.11 и геномного сервера RAST. Поиск отдельных генетических детерминант проводили с использованием программ ResFinder 3.2, PathogenFinder, PlasmidFinder, RAST и Bagel 4. Исследование антивирусной активности штаммов против вирусов гриппа А осуществляли с использованием клеток MDCK (клетки почки собаки Мадина-Дарби), эпидемического штамма вируса гриппа A/Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) (EPI_ ISL_332798), штамма высокопатогенного вируса гриппа птиц A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) (EPI_ISL_336925) и витального красителя нейтрального красного.
Результаты. В геномах всех изученных штаммов обнаружены детерминанты, ответственные за утилизацию углеводов растительного происхождения, в геномах B. longum 379 и B. bifidum 791 представлены гены ключевых ферментов синтеза триптофана и фолиевой кислоты. Особенностью генома B. bifidum 791 является наличие детерминант, ответственных за синтез термостабильных бактериоцинов I типа — флавуцина и лассо-пептида. Установлено, что выраженную антивирусную активность против обоих штаммов гриппа А показал штамм B. bifidum 791, супернатант которого подавлял размножение вирусов in vitro до разведения 1:8, а клетки ингибировали репродукцию вирусов до концентрации 6-106 КОЕ/мл.
Заключение. Анализ полных геномов B. longum 379, B. bifidum 1 и B. bifidum 791 показал особенности, обусловливающие их штаммоспецифические свойства, выводы о которых ранее делались эмпирически, на основе косвенных признаков. В геномах штаммов B. longum 379 и B. bifidum 791 в отличие от штамма B. bifidum 1 обнаружены ключевые ферменты синтеза триптофана и фолиевой кислоты. Эти вещества разносторонне влияют на организм человека, в том числе оказывают тимолептическое действие (снижение эмоционального напряжения, раздражительности, тревоги, устранение вялости, апатии, тоски, беспокойства) и регулируют когнитивную активность. Наличие в геноме штамма B. bifidum 791 детерминант, ответственных за синтез термостабильных бактериоцинов I типа, обусловливает его выраженную противовирусную активность.
Ключевые слова: Bifidobacterium; пробиотики; противовирусная активность; полногеномное секвенирование; вирус гриппа А.
Для контактов: Точилина Анна Георгиевна, e-mail: [email protected]
Как цитировать: Tochilina A.G., Belova I.V., Ilyicheva T.N., Marchenko V.Yu., Zhirnov V.A., Molodtsova S.B., Ikonnikov A.V., Muhkina I.V., Blagonravova A.S., Soloveva I.V. Genome features of probiotic bifidobacteria determining their strain-specific properties. Sovremennye tehnologii v medicine 2022; 14(5): 36, https://doi.org/10.17691/stm2022.14.5.04
English
Genome Features of Probiotic Bifidobacteria Determining Their Strain-Specific Properties
A.G. Tochilina, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Human Microbiome and Means of Its Correction1;
Associate Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine2;
I.V. Belova, MD, PhD, Leading Researcher, Laboratory of Human Microbiome and Means for Its Correction1;
Associate Professor, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine2;
T.N. Ilyicheva, DSc, Leading Researcher, Department of Zoonotic Infections and Influenza3;
V.Yu. Marchenko, PhD, Leading Researcher, Department of Zoonotic Infections and Influenza3;
V.A. Zhirnov, PhD, Researcher, Laboratory of Human Microbiome and Means of Its Correction1;
S.B. Molodtsova, Researcher, Laboratory of Human Microbiome and Means of Its Correction1;
A.V. Ikonnikov, Research Assistant2;
I.V. Muhkina, DSc, Professor, Director of the Institute of Fundamental Medicine;
Head of the Department of Normal Physiology named after N.Y. Belenkov2;
A.S. Blagonravova, MD, DSc, Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics; Professor,
Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine; Vice-Rector for Science2;
I.V. Soloveva, DSc, Associate Professor, Leading Researcher, Head of the Laboratory of Human Microbiome
and Means of its Correction1
Academician I.N. Blokhina Nizhny Novgorod Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Rospotrebnadzor (Russian Federal Consumer Rights Protection and Human Health Control Service), 71 Malaya Yamskaya St., Nizhny Novgorod, 603950, Russia;
2Privolzhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia; 3State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" of Rospotrebnadzor, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559, Russia
The aim of the study was to analyze the genome features of the probiotic strains Bifidobacterium longum 379, Bifidobacterium bifidum 1, and Bifidobacterium bifidum 791 and study their antiviral activity.
Materials and Methods. Whole genome sequencing of three strains of bifidobacteria was performed on the MiSeq platform (Illumina Inc., USA). The genomes were annotated using the Prokka v. 1.11 utility and RAST genomic server. The individual genetic determinants were searched using the ResFinder 3.2, PathogenFinder, PlasmidFinder, RAST, and Bagel 4 software. The antiviral activity of the strains against influenza A viruses was studied using MDCK cells (Madin-Darby canine kidney cells), the epidemic strain of influenza A/ Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) (EPI_ISL_332798), the highly pathogenic avian influenza virus A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) strain (EPI_ISL_336925), and neutral red vital dye.
Results. The genomes of all studied strains contained determinants responsible for utilization of carbohydrates of plant origin; the genes of key enzymes for the synthesis of tryptophan and folic acid are present in the genomes of B. longum 379 and B. bifidum 791. A feature of the B. bifidum 791 genome is the presence of determinants responsible for the synthesis of thermostable type I bacteriocins — flavucin and lasso peptide. The B. bifidum 791 strain was found to show pronounced antiviral activity against both the strains of influenza A, the supernatant of which suppressed viral replication in vitro up to a dilution of 1:8, and the cells inhibited viral reproduction up to a concentration of 6106 CFU/ml.
Conclusion. The analysis of complete genomes of B. longum 379, B. bifidum 1, and B. bifidum 791 showed features that determine their strain-specific properties, the findings on which were previously made empirically based on indirect signs. In the genomes of B. longum 379 and B. bifidum 791 strains, in contrast to B. bifidum 1 strain, key enzymes for the synthesis of tryptophan and folic acid were found. These substances have an impact on the human body in many ways, including having a thymoleptic effect (reducing emotional stress, irritability, anxiety, eliminating lethargy, apathy, melancholy, anxiety) and regulating cognitive activity. The presence of determinants responsible for the synthesis of thermostable type I bacteriocins in the genome of B. bifidum 791 strain determines its pronounced antiviral activity.
Key words: Bifidobacterium; probiotics; antiviral activity; whole genome sequencing; influenza A virus.
Введение
Бактерии рода Bifidobacterium обладают рядом уникальных свойств и приносят неоценимую пользу здо-
ровью человека, поэтому их традиционно используют в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков [1].
К одним из важнейших свойств бифидобактерий-пробиотиков относят их метаболический потенциал.
В соответствии с концепцией академика А.М. Уголева, существуют два пищевых потока, поступающих из кишечника в другие органы и ткани: первый — результат всасывания продуктов ферментативного гидролиза пищи, а второй, не менее значимый, — всасывания продуктов бактериального гидролиза (симбионтное пищеварение) [2]. В результате гидролиза пробио-тическими штаммами пищевых волокон, крахмала, олигосахаридов и т.д. синтезируются короткоцепо-чечные жирные кислоты — ценные метаболиты, оказывающие комплексный положительный эффект на здоровье человека: энергообеспечение эпителия, регуляцию моторики кишечника, усиление местного иммунитета и др. [2, 3].
Другим существенным свойством штаммов-пробио-тиков является способность к синтезу нейромедиато-ров и их предшественников. Например, известно, что нормальная микробиота способна влиять на концентрацию важнейшего нейротрансмиттера серотонина как опосредованно, за счет купирования местных и системных воспалительных процессов, так и прямым путем, выделяя его предшественник — триптофан. Недостаток серотонина вызывает нарушения мозговой деятельности и психические изменения — повышенную тревожность, депрессию и когнитивные расстройства [3, 4].
В настоящее время многие исследователи рассматривают бифидобактерии как терапевтическое средство для лечения и профилактики острых вирусных инфекций, описаны механизмы их антивирусного действия, причем показано, что активность бактерий против вирусов является штаммовой характеристикой [5-9].
Ранее выводы о роли и функциях в организме человека, биохимических и пробиотических свойствах би-фидобактерий делались эмпирически, на основе косвенных признаков. В настоящее время использование полногеномного секвенирования с применением современных сервисов и методов биоинформационной обработки позволяет легко доказать наличие интересующих исследователя генетических детерминант, раскрыть и описать уникальные свойства штамма и в полной мере выявить его метаболический и пробиоти-ческий потенциал. Необходимо отметить, что получение подробной информации о свойствах конкретных пробиотических штаммов очень актуально в свете реализации концепции персонифицированной медицины, т.е. делает возможным подбор индивидуального пробиотика с учетом особенностей здоровья и диагноза пациента.
Цель данной работы — анализ особенностей генома пробиотических штаммов Bifidobacterium longum 379, Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium bifidum 791 и изучение их противовирусной активности.
Материалы и методы
Объектами исследования послужили штаммы B. bifidum 1 (Государственная коллекция патоген-
ных микроорганизмов, ГКПМ-Оболенск; №900791), B. bifidum 791 (ГосНИИгенетика, Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, ВКПМ; №В-3300), B. longum 379 (ВКПМ; №В-2000), используемые для производства пробиотических лекарственных средств и продуктов питания.
Лиофильно высушенные штаммы восстанавливали и готовили вторую генерацию культуры с использованием гидролизатно-молочной среды (Syntex, Россия), агаризованной среды Bifidobacterium Agar (HiMedia, Индия) и газогенерирующих пакетов GasPak EZ Anaerobe Gas Generating Pouch System with Indicator (BD, США).
Видовую идентификацию проводили с помощью времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex speed LRF (Bruker Daltonics, Германия), пробоподго-товку выполняли согласно стандартному операционному протоколу «Экстракция муравьиной кислотой» [10]. Все измерения делали в линейном режиме, детектируя положительные ионы. Идентификацию, запись, обработку и анализ масс-спектров осуществляли с помощью программы BioTyper Rtc [11]. Биохимические свойства штаммов подтверждали с использованием тест-системы API 20 А (BioMerieux, Франция).
Геномную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Германия), фрагментацию проводили с применением системы ультразвуковой фрагментации Covaris E210 (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя. Очистку смеси и отбор фрагментов (200-700 п.н.) выполняли при помощи магнитных частиц Agencourt AMPure beads (Beckman Coulter, США) и буфера NEBNext Sizing Buffer (New England Biolabs, США). Подготовку библиотек осуществляли с помощью набора TrueSeq (Illumina Inc., США), секвенирование выполняли на платформе MiSeq (Illumina Inc.). Исходные нуклеотидные прочтения (риды) обработаны с помощью утилиты Trimmomatic со стандартными параметрами для Illumina. Обработанные риды использовали для сборки генома de novo при помощи программ Spades; MIRA 4.0; Newbler 2.6.
Аннотацию геномов проводили с помощью утилиты Prokka v. 1.11 [12] и геномного сервера RAST (http:// rast.nmpdr.org). Поиск детерминант антибиотикоре-зистентности и патогенности осуществляли с использованием программных продуктов, представленных на сайте Центра геномной эпидемиологии (www.cge. cbs.dk): программ ResFinder 3.2, PathogenFinder и PlasmidFinder [13-15]. Для обнаружения генетических детерминант, ответственных за продукцию бактерио-цинов, применяли программу Bagel 4 [16]. Поиск ключевых ферментов, ответственных за синтез нейроме-таболитов, проводили с использованием геномного сервера RAST и данных научной литературы [17-20].
Для исследования антивирусной активности штаммов против вирусов гриппа А использовали клеточные суспензии третьей генерации каждой культуры бифи-
добактерий, содержащие 108 КОЕ/мл, выращенные на гидролизатно-молочной среде. Суспензии в объеме 1 мл центрифугировали 10 мин при 3000 g, для исследования противовирусной активности штаммов брали бактериальные клетки и надосадочную жидкость. Токсичность клеточных суспензий, надосадочных жидкостей и питательной среды для клеток MDCK (клетки почки собаки Мадина-Дарби) была исследована с помощью MTT-анализа [9].
Для анализа противовирусной активности штаммов in vitro использовали клетки MDCK, питательную среду DMEM Gibco (Thermo Fisher Scientific, США) с добавлением 5% сыворотки плодов коровы (Gibco) и антибиотиков, а также штаммы вируса гриппа A/Lipetsk/1 V/2018 (H1N1 pdm09) (EPI_ISL_332798) и A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6) (EPI_ ISL_336925), полученные из Коллекции микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора. Для исследования применяли витальный краситель нейтрального красного [21].
Терапевтический индекс рассчитывали делением 50% токсической дозы на 50% эффективную дозу. Для определения статистической значимости различий значений терапевтического индекса у разных субстанций использовали критерий х2. Расчет проводили с помощью статистического программного пакета Statistica 6.0. Различия считались статистически значимыми при р<0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы изучали фенотипические признаки штаммов путем исследования их биохимических свойств и белковых масс-спектров с целью выбора культур, предназначенных для дальнейшего секве-нирования.
После проведенного полногеномного секвениро-вания штаммов полученные риды использовали для сборки геномов de novo с применением современных биоинформационных программ. Геномы, собранные в формате контигов, зарегистрировали в международной базе данных GenBank. Основные характеристики геномов изученных штаммов представлены в таблице.
Анализ генома штамма B. longum 379. По данным, полученным с помощью сервиса PathogenFinder,
геном этого штамма не содержит детерминант пато-генности, а с использованием программ PlasmidFinder и ResFinder 3.2 установлено, что геном не содержит интегрированных плазмид и детерминант антибиоти-корезистентности. Данные об отсутствии детерминант устойчивости к антибиотикам подтверждены с использованием геномного сервера RAST, однако были выявлены другие механизмы резистентности — молекулярные эффлюксные насосы (помпы) семейства MATE (GenBank: KYJ82530.1) и цитоплазматический белок, защищающий рибосому от воздействия тетрациклина, — tetW (GenBank: KYJ81078.1).
При анализе метаболического потенциала штамма установлено, что наиболее широко представленными являются подсистемы белкового метаболизма и метаболизма сахаров, состоящие из 212 и 199 детерминант соответственно (рис. 1, а).
Подсистема метаболизма сахаров представлена детерминантами фосфокетолазного пути (fructose-6-phosphate phosphoketolase pathway), продуктами которого являются молочная, уксусная кислоты и этанол, а также детерминантами, ответственными за утилизацию моносахаров (ксилозы, рибозы, арабинозы), дисахаридов (сахарозы, мальтозы, лактозы, раффинозы и фосфоолигосахаридов), аминосахаров и крахмала. Гены метаболизма аминосахаров NagA, NagB, NagK, NagR и NagT расположены в пределах 8-го кон-тига (NCBI: LKUQ01000023.1), а локус, ответственный за метаболизм крахмала, представлен генами, кодирующими ферменты GAT (KYJ81114.1), GS (KYJ81082.1), GBr (KYJ82453.1), GP (KYJ83271.1), GdBr (фермент деградации крахмала; KYJ82081.1), AMse (амило-мальтаза; KYJ82084.1) и MalE (белок транспорта мальтозы и мальтодекстрина; KYJ78457.1).
Оперон утилизации раффинозы и фруктооли-госахаридов представлен детерминантами, кодирующими белки MsmR (регуляторный белок; KYJ82093.1), MsmE, MsmF, MsmG (транспортные белки; KYJ82142.1, KYJ82092.1, KYJ82141.1), SacA (KYJ78008.1), GtfA (сахарозо-фосфорилаза), Aga (KYJ83465.1), BG (бета-глюкозидаза).
В геноме штамма обнаружены детерминанты синтеза экзополисахаридов: гены синтеза рамно-зы, расположенные в пределах 5-го контига (NCBI: LKUQ01000020.1), капсульных полисахаридов Wzb (тирозин-киназа; KYJ83195.1), Wzc (тирозин-фосфа-таза; KYJ83223.1), детерминанты, ответственные за
Основные характеристики геномов изученных штаммов рода Bifidobacterium
Штамм Количество контигов Среднее покрытие Размер генома, п.н. GC-состав, % Количество CDS* Номер в базе GenBank
B. longum 379 24 150,0 2 387 620 60,2 1903 LKUQ00000000
B. bifidum 1 13 385,0 2198027 62,7 1521 NDXI00000000
B. bifidum 791 33 150,0 2285457 62,4 1769 LKUR00000000
* последовательности, кодирующие белки.
формирование сортаза-зависимых пилей — детерминанты SrtA (сортаза А; К^83477.1) и АР (KYJ83476.1), а также липопротеинов — ^ (KYJ83617.1) и LspA (KYJ77995.1). Обнаружены также ключевые ферменты синтеза триптофана — триптофан-синтаза, субъединицы а и в (^83618.1, ^83619.1) — и фолиевой кислоты — дигидроптероат-синтаза (KYJ81979.1).
Анализ генома штамма B. bifidum 1. По данным, полученным с использованием сервиса PathogenFinder, геном данного штамма не содержит отдельных детерминант и островков патогенности, а с применением сервисов ResFinder 3.2 и PlasmidFinder установлено, что геном не содержит интегрированных плазмид и детерминант антибиотикорезистент-ности. В ходе дальнейшего анализа с помощью геномного сервера RAST данные об отсутствии детерминант антибиотикорезистентности были подтверждены, а в геноме обнаружены молекулярные эффлюксные помпы семейства MATE (PDH98462.1). Фено типически наличие этого молекулярного механизма может выражаться в устойчивости к ряду антибактериальных препаратов.
Выявлено, что у штамма наиболее широко представлены подсистемы метаболизма белков (225 детерминант) и сахаров (175 детерминант) (рис. 1, б). Подсистема метаболизма сахаров включает детерминанты фосфокетолазного пути, продуктами которых являются молочная, уксусная кислоты и этанол. Штамм обладает низкой способностью к метаболизму моносахаров, однако активен в отношении ди-, олигоса-харидов и аминосахаров — хитина и N-ацетилглюкозамина. Оперон утилизации аминосахаров представлен
subsystem category Distribution
Subsystem Category Distribution
в Subsystem Category Distribution
Subsystem feature counts
Cofactors, Vitamins, Prosthetic Groups, Pigments (95)
Cell Wall and Capsule (63)
Violence, Disease and Defense (42)
Potassium metabolism (13)
Photosynthesis {0}
Miscellaneous (15)
Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids {2)
Membrane Transport (46)
Iron acquisition and metabolism (5)
MM Metabolism [S8;
nucleosides and Nucleotides (70)
Protein Metabolism (212)
Cell Olvision and Cell Cycle (2?)
Motility and Chemotaxis (6)
Regulation and Cell signaling (17)
secondary Metabolism (0)
DNA Metabolism (&7)
Fatty Adds, Lipids, and Isoprenoids (25)
nitrogen Metabolism (a)
Dormancy and spallation {2)
Respiration (3)
Stress Response (33)
Metabolism of Aromatic Compounds (!•)
Amino Adds and Derivatives (207)
Sulfur Metabolism (11)
Phosphorus Metabolism (30)
Carbohydrates (199)
Subsystem Feature Counts
Cefaclors, vitamins. Prosthetic Groups, Pigments (77)
Cell wall and Capsule (63)
Virulence, Disease and Defense (52)
Potassium metabolism (7)
photosynthesis (o)
Miscellaneous (13)
Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids (5)
Membrane Transport (32)
Iron acquisition and metabolism (1)
RNA Metabolism (54)
Nucleosides and Nucleotides (65)
Protein Metabolism (223)
Cell Division and Cell Cycle (28)
Motility and Chemotaxis (o)
Regulation and cell signaling (12)
secondary Metabolism (0)
DMA Metabolism (SO)
Fatty Adds, Lipids, and Isoprenoids (40)
Nitrogen Metabolism (10)
Dormancy and SporuJation (1)
Respiration (2)
Stress Response (31)
Metabolism of Aromatic Compounds (3)
Amino Acids and Derivatives (225)
Sulfur Metabolism (21)
Phosphorus Metabolism (43)
Carbohydrates (175)
Subsystem Feature Counts Colactors, vitamins, Pr&sttietlc Groups, Pigments (73) Ceil wall and Capsule (70) virulence. Disease and Defense (4t) Potassium metabolism (7) Photosynthesis (0) Miscellaneous (13)
Phages, Prophages, Transposable elements, Plasmids (7)
Membrane Transport (24)
Iron acquisition and metabolism (o)
RIW Metabolism (62)
Nucleosides and Nucleotides (61)
Protein Metabolism (20?)
cell Division and Cell Cycle (29)
Motility and Chemotaxis (0)
Regulation and Cell signaling (12)
Secondary Metabolism (0)
DNA Metabolism (66)
Fatty Acids, Lipids, and Isoprenoids (27)
Nilrogen Metaboism (ß)
Dormancy and Sporulation (1)
Respiration (2)
Stress ftesconse (30)
Metabolism of Aromatic Compounds (3)
Amino Acids and Derivatives (198)
sulfur Metabolism (17)
Phosphorus Metabolism (35)
Carbohydrates (150)
Рис. 1. Функциональная аннотация штаммов с использованием геномного сервера RAST:
а — B. longum 379; б — B. bifidum 1; в — B. bifidum 791
а
б
генами, детерминирующими следующие ферменты: NagK (бета-галакто-зид-^ацетилгексозамин; GenBank: PDH98478.1), NagA (PDH97531.1), NagB (PDH98129.1), транспортную систему ПТС NagT (PDH97280.1), регуляторный белок NagR, а также ферменты CbsA (бета-гексоминида-за; PDH98222.1) и Aga (PDH97428.1). В геноме также представлены гены, детерминирующие ферменты метаболизма крахмала: GAT, GS (PDH98335.1), GBr, GP (PDH97657.1), GdBr (PDH97486.1), AMse (амило-мальтаза).
Генов синтеза экзополисахаридов не обнаружено, однако присутствуют детерминанты, ответственные за формирование сортаза-зависимых пи-лей — SrtA (PDH97100.1, PDH97310.1), а также липопротеинов клеточной стенки — Lgt (PDH98440.1) и LspA (PDH98074.1).
Анализ генома штамма B. bifidum 791. По данным, полу-
ченным с использованием сервиса PathogenFinder, установлено, что в геноме штамма отсутствуют детерминанты патогенности, а с помощью программ PlasmidFinder и ResFinder 3.2 выявлено, что геном не содержит интегрированных плазмид и детерминант антибиотикорезистентности. В ходе подробного анализа генома с помощью геномного сервера RAST были подтверждены данные об отсутствии детерминант антибиотикорезистентности, обнаружены другие механизмы, приводящие к фенотипически выраженной резистентности к ряду антибиотиков, — молекулярные эффлюксные помпы семейства MATE (KYJ84349.1, KYJ84414.1).
Установлено также, что широко представленными являются подсистемы белкового метаболизма и метаболизма сахаров, состоящие из 207 и 150 генетических детерминант соответственно (рис. 1, в). Подсистема метаболизма сахаров включает детерминанты фосфокетолазного пути, продуктами которых являются молочная, уксусная кислоты и этанол. По своим сахаролитическим и иным свойствам штамм B. bifidum 791 близок к штамму B. bifidum 1. Так, в геноме штамма B. bifidum 791 практически не представлены детерминанты метаболизма моносахаров, однако есть гены, ответственные за расщепление более сложных углеводов: ди-, олигосахаридов, аминосаха-ров и крахмала.
Локус, ответственный за утилизацию аминоса-харов штамма B. bifidum 791, представлен генами, детерминирующими ферменты NagK (KYJ84330.1), NagA (KYJ85076.1), NagB (KYJ85077.1), транспортные системы ПТС NagT (KYJ85215.1, KYJ85216.1), регуляторный белок NagR (KYJ85078.1), а также CbsA (KYJ83728.1) и Aga (KYJ84485.1).
В геноме обнаружены детерминанты, кодирующие ферменты метаболизма крахмала, — GAT (KYJ83153.1), GS (KYJ84446.1), GBr (KYJ84933.1), GP (KYJ84691.1), GdBr (KYJ85154.1), AMse (KYJ84544.1) — и синтеза экзополисахаридов, включающие в том числе гены синтеза рамнозы, расположенные в пределах 3-го контига (NCBI: LKUR01000023.1), а также детерминанты, ответственные за формирование сортаза-зависимых пилей — SrtA (KYJ84870.1) и AP (KYJ84871.1) и липопротеинов клеточной стенки — Lgt (KYJ84380.1) и LspA (KYJ85145.1). Кроме того, обнаружены ключевые ферменты синтеза триптофана — триптофан-синтаза, субъединицы а и ß (KYJ84379.1, KYJ84378.1) и фолиевой кислоты — ди-гидроптероат-синтаза (KYJ84132.1).
В пределах 28-го контига (NCBI: LKUR01000021.1) обнаружены детерминанты, ответственные за синтез лассо-пептида, — рибосомно-продуцируемого пептида, проявляющего высокую противомикробную и противовирусную активность, и синтез бактериоцина флавуцина.
В результате проведенного анализа подтверждено, что штаммы B. longum 379, B. bifidum 1 и B. bifidum 791 не патогенны для человека, не содержат в геноме
генов антибиотикорезистентности трансмиссивного типа и интегрированных плазмид. Устойчивость к антибиотикам различных классов объясняется наличием молекулярных эффлюксных помп семейства MATE и протективного рибосомального белка TetW.
Установлено, что все штаммы способны утилизировать ди- и олигосахариды, аминосахара и крахмал. Продуктами их основного метаболизма являются молочная и уксусная кислоты. B. longum 379 и B. bifidum 791 содержат в геноме детерминанты синтеза экзо-полисахаридов, которые отсутствуют у B. bifidum 1. В геномах всех штаммов обнаружены детерминанты, ответственные за формирование сортаза-зависимых пилей и липопротеинов клеточной стенки.
Способность всех изученных штаммов утилизировать углеводы растительного происхождения: аминосахара (широко распространены в природе, входят в состав полисахаридов клеточных оболочек), фрукто-олигосахариды (растительные сахара), раффинозу (часто встречается в семенах, корнеплодах, овощах), крахмал — обеспечивает конкурентное преимущество для их существования в составе микробиоты кишечника и реализацию пробиотических свойств (обеспечение колонизационной резистентности, антагонизм против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов). С другой стороны, комплекс активных бактериальных гидролаз обеспечивает наиболее эффективное усвоение пищи макроорганизмом и активное симбионтное пищеварение.
Ценными продуктами активного расщепления углеводов изученными штаммами бифидобактерий являются молочная (лактат) и уксусная (ацетат) кислоты, относящиеся к важнейшим анионам, обеспечивающим легкое закисление полости кишечника, способствующим лучшему всасыванию электролитов и подавляющим рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Высокий уровень лактата способствует протрузии макрофагов (проникновению их отростков из слизистой оболочки в полость кишечника) и определяет иммунорегуляторные свойства бифидобактерий. Ацетат — ценная короткоцепочечная жирная кислота — выполняет важные энергетические задачи, всасываясь в кровь и попадая в клетки различных органов и тканей, снижает уровень токсических метаболитов и канцерогенов, нормализует моторику желудочно-кишечного тракта, уменьшает образование кетонов [2, 22].
В геномах штаммов B. bifidum 791 и B. longum 379 обнаружены ключевые ферменты синтеза ней-рометаболитов — триптофана и фолиевой кислоты. Продуцируемые бактериями триптофан и образуемый в результате его декарбоксилирования триптамин могут доставляться с кровотоком в мозг и выполнять в нем роль предшественников моноаминовых ней-ротрансмиттеров [4]. Кроме того, более 90% общего пула важнейшего нейромедиатора серотонина в организме человека синтезируется в пищеварительном тракте в результате метаболизации триптофана,
поступающего с пищей и продуцируемого микроби-отой [3]. Недостаток серотонина вызывает выраженные нарушения мозговой деятельности — снижение когнитивных функций, повышенную тревожность и депрессию. Ранее исследователями были получены доказательства способности бифидобактерий повышать уровень триптофана в крови лабораторных животных, облегчать их состояние в условиях стресса, т.е. оказывать выраженное тимолептическое действие [3].
Фолиевая кислота (витамин В9) — водорастворимый витамин, необходимый для роста и развития кровеносной и иммунной систем, ее недостаток может вызывать мегалобластную анемию (макроцитоз), повышает риск развития злокачественных опухолей, а при беременности служит причиной возникновения дефектов нервной трубки плода. Дефицит фолиевой кислоты также типичен для людей, страдающих депрессией [4]. Основные ее источники — пища (овощи, зелень, цитрусовые и др.) и микробиота кишечника человека, т.е. способность изученных штаммов к ее синтезу можно расценивать как важный дополнительный механизм введения этого вещества в организм человека.
Согласно современным научным данным, среди основных механизмов ингибирующего действия про-биотических бактерий на вирусы выделяют продукцию активных метаболитов — органических кислот, бактериоцинов, бактерицидных субстратов и др., которые понижают рН среды, предотвращают адгезию вирусных частиц и обладают прямым противовирусным действием [23]. Доказано также, что противовирусным действием обладают экзополисахариды про-биотических бактерий, сортаза-зависимые пили, а также липопротеины, выделяемые клеточными стенками (LpAs), которые физически препятствуют взаи-
модействию вирусных частиц с рецепторами клеток [24]. Известно, что противовирусную активность проявляют представители видов B. adolescentis, B. breve, B. longum [24-26].
В нашем исследовании все компоненты жидких культур бифидобактерий были не токсичны для клеток MDCK, они не снижали жизнеспособности клеток.
На рис. 2 представлены результаты исследования противовирусной активности бифидобактерий в отношении эпидемического штамма вируса гриппа A/Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) и высокопатогенного штамма A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6).
Супернатанты и клетки B. bifidum 1 и B. longum 379 не показали выраженного снижения цитопати-ческого действия вируса гриппа на клетки MDCK. Значительную активность против обоих штаммов обнаружил лишь супернатант, полученный от центрифугирования 1 мл культуры B. bifidum 791. Во всех разведениях до 1:8 он подавлял размножение вирусов in vitro. Клетки данного штамма ингибировали репродукцию вирусов до концентрации 6-106 КОЕ/мл.
В ходе анализа генома штамма B. bifidum 791 установлено, что он способен продуцировать не только органические кислоты, секретируемые липопротеины и экзополисахариды, но и антибактериальные пептиды — флавуцин и лассо-пептид, относящиеся к группе термостабильных бактериоцинов I класса [16, 27]. Бактериоцины этого класса обладают широким спектром противовирусной активности, способны ингиби-ровать все этапы репликации вирусов, блокировать их рецепторы и ферменты и предотвращать адсорбцию на эукариотических клетках [28-30]. Нами установлено, что термостабильные бактериоцины I класса являются определяющим фактором активности про-
20
<и ч:
15
10
1 1
1 1
Гидролизатно-молочная Супернатант среда в. bifidum 1
Супернатант B. bifidum 791
i 1
Супернатант B. longum 379
1 1
Клетки B. bifidum 1
Клетки B. bifidum 791
i 1
Клетки B. longum 379
H1N1 ■ H5N6
5
0
Рис. 2. Терапевтический индекс различных компонентов жидкой культуры бактерий B. longum 379, B. bifidum 1, и B. bifidum 791 в отношении штаммов вируса гриппа A/Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) (синий) и A/common gull/ Saratov/1676/2018 (H5N6) (оранжевый)
Результаты представляют собой средние значения ± стандартные отклонения от трех независимых экспериментов; * р<0,05
биотических штаммов бифидобактерий против эпидемического вируса гриппа A/Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) и высокопатогенного вируса гриппа птиц A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6).
Заключение
С использованием полногеномного секвенирова-ния получены новые данные о штаммоспецифич-ных особенностях пробиотических бифидобактерий. Установлено, что изученные штаммы способны утилизировать углеводы растительного происхождения. В геномах штаммов B. longum 379 и B. bifidum 791, в отличие от штамма B. bifidum 1, обнаружены ключевые ферменты синтеза триптофана (предшественника моноаминовых нейротрансмиттеров) и фолиевой кислоты — важнейшего водорастворимого витамина. Эти вещества разносторонне влияют на организм человека, в том числе оказывают тимолептическое действие и регулируют когнитивную активность. Особенностью генома B. bifidum 791 является также наличие детерминант, ответственных за синтез термостабильных бактериоцинов I типа — флавуцина и лассо-пептида, обусловливающих выраженную активность данного штамма против эпидемического штамма вируса гриппа A/Lipetsk/1V/2018 (H1N1 pdm09) и высокопатогенного вируса гриппа птиц A/common gull/ Saratov/1676/2018 (H5N6).
Финансирование исследования. Исследование проводилось в рамках отраслевой научно-исследовательской программы 2021-2025 гг. «Научное обеспечение эпидемиологического надзора и санитарной охраны территории Российской Федерации. Создание новых технологий, средств и методов контроля и профилактики инфекционных и паразитарных болезней», тема НИР №21091400194-0.
Конфликта интересов нет.
Литература/References
1. Probiotics. Advanced food and health application. Brandelli A. (editor). Academic Press; 2021; 530 p.
2. Корниенко Е.А. Метаболическое действие микро-биоты и метабиотики. Русский медицинский журнал 2016; 18: 1196-1201.
Kornienko E.A. Metabolic activities of microbiota and metabiotics. Russkij medicinskij zurnal 2016; 18: 1196-1201.
3. Oleskin A.V., Shenderov B.A. Neuromodulator effects, targets of the SCFAs and gasotransmitters produced by the human symbiotic microbiota. Microb Ecol Health Dis 2016; 27: 30971, https://doi.org/10.3402/mehd.v27.30971.
4. Oleskin A.V., Shenderov B.A. Probiotics and psychobiotics: the role of microbial neurochemicals. Probiotics Antimicrob Proteins 2019; 11(4): 1071-1085, https://doi. org/10.1007/s12602-019-09583-0.
5. Arena M.P., Elmastour F., Sane F., Drider D., Fiocco D., Spano G., Hober D. Inhibition of coxsackievirus B4 by Lactobacillus plantarum. Microbiol Res 2018; 210: 59-64, https://doi.org/10.1016/j.micres.2018.03.008.
6. Kim K., Lee G., Thanh H.D., Kim J.H., Konkit M., Yoon S., Park M., Yang S., Park E., Kim W. Exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum LRCC5310 offers protection against rotavirus-induced diarrhea and regulates inflammatory response. J Dairy Sci 2018; 101(7): 5702-5712, https://doi. org/10.3168/jds.2017-14151.
7. Lei S., Ramesh A., Twitchell E., Wen K., Bui T., Weiss M., Yang X., Kocher J., Li G., Giri-Rachman E., Trang N.V., Jiang X., Ryan E.P., Yuan L. High protective efficacy of probiotics and rice bran against human norovirus infection and diarrhea in gnotobiotic pigs. Front Microbiol 2016; 7: 1699, https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.01699.
8. Majamaa H., Isolauri E., Saxelin M., Vesikari T. Lactic acid bacteria in the treatment of acute rotavirus gastroenteritis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1995; 20(3): 333-338, https://doi. org/10.1097/00005176-199504000-00012.
9. Soloveva I.V., Ilyicheva T.N., Marchenko V.Y., Pyankov O.V., Tochilina A.G., Belova I.V., Zhirnov V.A., Bormotov N.I., Skarnovich M.O., Durymanov A.G., Molodtsova S.B., Filippova E.I., Ovchinnikova A.S., Magerramova A.V., Ryzhikov A.B., Maksyutov R.A. Genome features and in vitro activity against influenza A and SARS-CoV-2 viruses of six probiotic strains. Biomed Res Int 2021; 2021: 6662027, https://doi.org/10.1155/2021/6662027.
10. Чеботарь И.В., Поликарпова С.В., Бочарова Ю.А., Маянский Н.А. Использование времяпролетной масс-спек-трометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) для идентификации бактериальных и грибковых возбудителей III-IV групп пато-генности. Лабораторная служба 2018; 7(2): 78-86, https:// doi.org/10.17116/labs20187278-86.
Chebotar' I.V., Polikarpova S.V., Bocharova Yu.A., Mayansky N.A. Use of matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for identification of bacteria and fungi of the pathogenicity group III and IV. Laboratornaa sluzba 2018; 7(2): 78-86, https://doi.org/10.17116/labs20187278-86.
11. Соловьева И.В., Новикова Н.А., Точилина А.Г., Белова И.В., Кашников А.Ю., Сашина Т.А., Жирнов В.А., Молодцова С.Б. Пробиотический штамм Lactobacillus fermentum 39: биохимические свойства, особенности генома, антивирусная активность. Микробиология 2021; 90(2): 215-222.
Soloveva I.V., Novikova N.A., Tochilina A.G., Belova I.V., Kashnikov A.Y., Sashina T.A., Zhirnov V.A., Molodtsova S.B. The probiotic strain Lactobacillus fermentum 39: biochemical properties, genomic features, and antiviral activity. Mikrobiologiia 2021; 90(2): 215-222.
12. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 2014; 30(14): 2068-2069, https:// doi.org/10.1093/bioinformatics/btu153.
13. Zankari E., Hasman H., Cosentino S., Vestergaard M., Rasmussen S., Lund O., Aarestrup F.M., Larsen M.V. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J Antimicrob Chemother 2012; 67(11): 2640-2644, https://doi. org/10.1093/jac/dks261.
14. Cosentino S., Voldby L.M., Moller A.F., Lund O. PathogenFinder — distinguishing friend from foe using bacterial whole genome sequence data. PLoS One 2013; 8(10): e77302, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077302.
15. Carattoli A., Zankari E., García-Fernández A., Voldby Larsen M., Lund O., Villa L., M0ller Aarestrup F., Hasman H. In silico detection and typing of plasmids using PlasmidFinder
and plasmid multilocus sequence typing. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58(7): 3895-3903, https://doi.org/10.1128/ aac.02412-14.
16. van Heel A.J., Kloosterman T.G., Montalban-Lopez M., Deng J., Plat A., Baudu B., Hendriks D., Moll G.N., Kuipers O.P. Discovery, production and modification of 5 novel lantibiotics using the promiscuous nisin modification machinery. ACS Synth Biol 2016; 5(10): 1146-1154, https://doi.org/10.1021/ acssynbio.6b00033.
17. Rossi M., Amaretti A., Raimondi S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients 2011; 3(1): 118-134, https://doi. org/10.3390/nu3010118.
18. Gabris C., Bengelsdorf F.R., Dürre P. Analysis of the key enzymes of butyric and acetic acid fermentation in biogas reactors. Microb Biotechnol 2015; 8(5): 865-873, https://doi. org/10.1111/1751-7915.12299.
19. Prasirtsak B., Thitiprasert S., Tolieng V., Assabumrungrat S., Tanasupawat S., Thongchul N. D-lactic acid fermentation performance and the enzyme activity of a novel bacterium Terrilactibacillus laevilacticus SK5-6. Ann Microbiol 2019; 69: 1537-1546.
20. Kang D.W., Ilhan Z.E., Isern N.G., Hoyt D.W., Howsmon D.P., Shaffer M., Lozupone C.A., Hahn J., Adams J.B., Krajmalnik-Brown R. Differences in fecal microbial metabolites and microbiota of children with autism spectrum disorders. Anaerobe 2018; 49: 121-131, https://doi. org/10.1016/j.anaerobe.2017.12.007.
21. Vlasenko V.A., Ilyicheva T.N., Teplyakova T.V., Svyatchenko S.V., Asbaganov S.V., Zmitrovich I.V., Vlasenko A.V. Antiviral activity of total polysaccharide fraction of water and ethanol extracts of Pleurotus pulmonarius against the influenza A virus. Curr Res Environ Appl Mycol 2020; 10(1): 224-235, https://doi.org/10.5943/cream/10/1/22.
22. Morita N., Umemoto E., Fujita S., Hayashi A., Kikuta J., Kimura I., Haneda T., Imai T., Inoue A., Mimuro H., Maeda Y., Kayama H., Okumura R., Aoki J., Okada N., Kida T., Ishii M., Nabeshima R., Takeda K. GPR31-dependent dendrite protrusion of intestinal CX3CR1 + cells by bacterial metabolites. Nature 2019; 566(7742): 110-114, https://doi.org/10.1038/ s41586-019-0884-1.
23. Ермоленко Е.И., Суворов А.Н., Фураева В.А. Противовирусный эффект in vitro метаболитов, выделяемых
культурами энтерококка и лактобацилл. В кн.: Материалы VI Российского съезда врачей инфекционистов. М; 2003; с. 371.
Ermolenko E.I., Suvorov A.N., Furaeva V.A. Protivovirusnyy effekt in vitro metabolitov, vydelyaemykh kul'turami enterokokka i laktobatsill. V kn.: Materialy YI Rossiyskogo s"ezda vrachey infektsionistov [Antiviral effect in vitro of metabolites secreted by cultures of enterococcus and lactobacilli. In: Proceedings of the VI Russian congress of infectious disease physicians]. Moscow; 2003; p. 371.
24. El Kfoury K.A., Romond M.B., Scuotto A., Alidjinou E.K., Dabboussi F., Hamze M., Engelmann L., Sane F., Hober D. Bifidobacteria-derived lipoproteins inhibit infection with coxsackievirus B4 in vitro. Int J Antimicrob Agents 2017; 50(2): 177-185, https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2017.03.010.
25. Kang J.Y., Lee D.K., Ha N.J., Shin H.S. Antiviral effects of Lactobacillus ruminis SPM0211 and Bifidobacterium longum SPM1205 and SPM1206 on rotavirus-infected Caco-2 cells and a neonatal mouse model. J Microbiol 2015; 53(11): 796803, https://doi.org/10.1007/s12275-015-5302-2.
26. Olaya Galán N.N., Ulloa Rubiano J.C., Velez Reyes F.A., Fernandez Duarte K.P., Salas Cárdenas S.P., Gutierrez Fernandez M.F. In vitro antiviral activity of Lactobacillus casei and Bifidobacterium adolescentis against rotavirus infection monitored by NSP4 protein production. J Appl Microbiol 2016; 120(4): 1041-1051, https://doi.org/10.1111/jam.13069.
27. Lu W., Pei Z., Zang M., Zhao J., Chen W., Wang H., Zhang H. Comparative genomic analysis of Bifidobacterium bifidum strains isolated from different niches. Genes (Basel) 2021; 12(10): 1504, https://doi.org/10.3390/genes12101504.
28. Tiwari S.K., Dicks L.M.T., Popov I.V., Karaseva A., Ermakov A.M., Suvorov A., Tagg J.R., Weeks R., Chikindas M.L. Probiotics at war against viruses: what is missing from the picture? Front Microbiol 2020; 11: 1877, https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.01877.
29. Alvarez-Sieiro P., Montalbán-López M., Mu D., Kuipers O.P. Bacteriocins of lactic acid bacteria: extending the family. Appl Microbiol Biotechnol 2016; 100(7): 2939-2951, https://doi.org/10.1007/s00253-016-7343-9.
30. Maksimov M.O., Pan S.J., James Link A. Lasso peptides: structure, function, biosynthesis, and engineering. Nat Prod Rep 2012; 29(9): 996-1006, https://doi.org/10.1039/c2np20070h.
