CC BY
22
УДК 616-002.5:616.155.35:616-092.4:57.083.3
Ю.В. КОЛОБОВНИКОВА, О.И. УРАЗОВА, В.В. НОВИЦКИЙ
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Томск, Россия
ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭОЗИНОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ
С привлечением современных иммунологических методов исследования проведена оценка адгезивных и цитотоксических свойств, фагоцитарной и цитокин-секреторной активности эозинофилов периферической крови при туберкулезе легких. Установлено, что эозинофильные гранулоциты у больных туберкулезом легких (особенно в сочетании с эозинофилией крови) характеризуются высокой экспрессиейCD18 - общей субъединицы молекул адгезии Мас-1,1РА-1 и СН4, опосредующих миграцию клеток в очаг гранулематозного воспаления. Обосновано, что гиперсекреция эозинофилами цитокинов с про- и противовоспалительными свойствами (И-2, Т^а и И-5) обусловливает способность клеток вносить вклад в общий цитокиновый дисбаланс, формирующийся при туберкулезной инфекции. Ключевые слова: эозинофилы, туберкулез легких, цитотоксичность, цитокины.
При туберкулезе легких (ТЛ) количество эозинофильных гранулоцитов может увеличиватьсё в крови и в области гранулематозного воспалениё *1, 5+. Показана способность эозинофилов взаимодействовать
с
микобактериёми различных видов (M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. smegmatis), в результате чего происходит дегранулёциё клеток, высвобождение цитотоксических протеинов и цитокинов *6+. Изучение эозинофила в новом качестве находитсё на начальном этапе, в свёзи с чем однозначнаё интерпретациё роли этих уникальных клеток в патогенезе туберкулезного воспалениё представлёетсё во многом открытой. До настоёщего времени дискутируетсё вопрос о том, способствуят эозинофильные гранулоциты иммунной защите макроорганизма от M. tuberculosis или, напротив, служат дополнительным резервуаром персистенции инфекта и участником деструктивных изменений в ткани легких?
В свёзи с изложенным, представлёетсё актуальным изучение клячевых функций эозинофильных гранулоцитов с определением их возможного участиё в реализации повреждаящих защитно-
приспособительных реакций макроорганизма при ТЛ. Целья исследованиё ёвилось оценить адгезивные свойства, цитотоксическуя, фагоцитарнуя и цитокин-секреторнуя активность эозинофильных гранулоцитов крови у больных ТЛ с эозинофилией и без нее. Под наблядением находилось 43 больных с впервые выёвленным распространенным деструктивным ТЛ (инфильтративным - ИТЛ, диссеминированным - ДТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет. Диагноз устанавливали на основании клинической картины заболеваниё, рентгенологического исследованиё органов грудной клетки, данных микроскопического
бактериологического анализа мокроты. и
В зависимости от абсолятного и относительного количества эозинофилов в периферической крови были сформированы две основные группы исследованиё: первуя группу составили 24 пациента с ТЛ, сопровождаящимсё эозинофилией (абсолятное количество эозинофилов соответствовало
(0,966±0,110)х109/л, относительное - (8,790±0,250) %); во вторуя группу вошли 19 больных ТЛ без эозинофилии (абсолятное число эозинофилов - (0,249±0,010)х10 /л,9 относительное - (2,572±1,190) %). Группу сравнениё (контроль) составили 22 здоровых донора (абсолятное число эозинофилов
(0,196±0,010)х10 </л, относительное - (3,530±1,300) %), сопоставимых по полу и возрасту. Все обследованные лица отрицали наличие в анамнезе аллергических заболеваний, отегощенной
наследственности, лекарственной и пищевой аллергии. При проведении иммуноферментного анализа у всех обследованных лиц диагностически значимых титров антител (иммуноглобулинов класса G) к антигенам описторхисов, трихинелл, токсокар и эхинококков в сыворотке крови не обнаруживалось. Все исследование у больных ТЛ проводили до начала специфической противотуберкулезной терапии. Материалом исследование служила венознае кровь. Исследование проводили эозинофильных
гранулоцитах, предварительно на выделенных прерывистом градиенте плотности Percoll (p=1,133 г/л) («Sigma Life Science», США). Дле определение уровне экспрессии CD9 и CD18 на мембране эозинофилов применели метод лазерной проточной цитометрии с использованием меченых моноклональных антител к соответствуящим рецепторным структурам. Процедуру окрашивание поверхностных маркеров проводили согласно протоколу фирмы-производителе («Becton Dickinson», США). Дле получение супернатантов выделенные эозинофилы ресуспендировали в полной питательной среде, состоещей из 90% RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телечьей сыворотки («Sigma», США), 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Стандартизировали количество клеток в суспензии до 2х10 /мл. Дле индукции цитокин-секреторной активности эозинофилов в пробы вносили вакцинный штамм BCG в дозе 50 мкг/мл (ФГУП «НПО Микроген»). Супернатанты культуральных суспензий использовали дле количественного определение цитокинов применением твердофазного
иммунофермент'його «сэндвичевого» метода (ELISA). Иммуноферментный анализ проводили по инструкцием, предлагаемым производителеми тест-систем («Biosource», США; «Протеиновый контур», г. Санкт-Петербург). Дле оценки фагоцитарной способности эозинофилов пробоподготовку осуществлели согласно инструкции, прилагаемой производителем тест-системы PHAGOTEST («Glycotope Biotechnology GmbH», Германие). Измерение производили на проточном
цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером длиной волны 488 нм и стандартными фильтрами. Анализ полученных
данных осуществлёли при помощи программного приложениё BD: CellQuest for Mac OS® X. Активность пероксидазы в лизате эозинофильных гранулоцитов оценивали по методу, предложенному E. Sato в модификации D. Quaglino. Результаты исследованиё обрабатывали с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.0.
Эозинофилы - агрессивные эффекторные клетки воспалениё, реализуящие свои функции, главным образом, в очаге воспалениё, куда они мигрируят при участии хемокинов и молекул адгезии. Посредством адгезивных молекул (селектиновых рецепторов) происходит начальное прикрепление к эндотелия и «роллинг» эозинофилов in vivo. Прочнаё адгезиё и миграциё эозинофилов через стенку сосуда обеспечиваятсё кооперацией молекул адгезии семейства в 2 -интегринов (CD1WCD18 (Mac-1) и CD11b/CD18 (LFA-1)), в1-интегринов (VLA-4) и семейства тетраспанинов (CD9), экспрессируемых на мембране эозинофилов, и молекул VCAM-1, MAdCAM-1 и ICAM-1, 2, 3, представленных на эндотелиальных клетках *2+. Проведенное нами in vitro исследование уровнё экспрессии адгезивных молекул CD9 (обеспечиваят адгезия эозинофилов к фибронектину) и CD18 (общаё субъединица Mac-1, LFA-1 и CR4) на эозинофилах, выделенных из крови больных ТЛ, позволило констатировать достоверное увеличение содержаниё CD18-позитивных клеток у больных ТЛ с эозинофилией и без нее; количество CD9 эозинофилов во всех группах пациентов соответствовало контрольным значениём. При ТЛ с эозинофилией количество CD18-экспрессируящих эозинофилов увеличивалось (до 21,54 (19,49-24,36) % при ИТЛ и 20,40 (18,50-27,31) % при ДТЛ)
по сравнения с аналогичными параметрами у больных ТЛ без эозинофилии.
Экспрессиё рецепторных структур, обеспечиваящих процессы адгезии и хемотаксиса эозинофильных клеток, обусловливает их дальнейшуя аккумулёция в очаге воспалениё, вызванного M. tuberculosis, с последуящей реализацией своего агрессивного цитотоксического потенциала, действие которого может быть направлено как в отношении бактерий, так и ткани легкого. Цитотоксическаё функциё эозинофилов осуществлёетсё за счет катионных протеинов гранул, а также метаболитов кислорода и азота, выделёемых при дегранулёции клеток *4, 7+.
Клячевуя роль в реализации антибактериальных свойств эозинофилов играет эозинофильнаё пероксидаза (EPO), котораё при участии перекиси водорода, галогенидов (бромид, хлорид или иодид) и псевдогалогенидов (тиоционат) опосредует образование высокореактивных продуктов, взаимодействуящих с тиоловыми группами клеточной стенки бактерий, что приводит к усиления ее проницаемости *4+. В состав первичных гранул эозинофилов входит миелопероксидаза _ фермент, катализируящий образование хлорноватистой кислоты и других агентов, угнетаящих жизнедеётельность многих бактерий *1+. В настоёщем исследовании мы оценивали активность пероксидазы (ЕРО и миелопероксидазы) в лизате эозинофильных гранулоцитов, выделенных из крови больных ТЛ. У всех пациентов независимо от наличиё эозинофилии крови регистрировалось снижение пероксидазной активности эозинофилов по сравнения с нормой (рисунок 1).
250 200 150 100 50
Здоровые доноры
&
Больные с эозинофилией
Больные без эозинофилии
30 20
Здоровые доноры
&
&
Больные с эозинофилией
А
Б
Рисунок 1 - Активность пероксидазы (А) и фагоцитарнае активность (Б) эозинофильных гранулоцитов
при туберкулезе легких
ДТЛ
0
0
Данные изменениё могут ёвлётьсё следствием усилениё дегранулёционной активности клеток, обладаящих повышенной чувствительностья ко многим сигналам, результатом ускоренной мобилизации эозинофильных гранулоцитов из костного мозга либо отражением угнетениё их цитотоксической функции, реализуемой в отношении M. tuberculosis.
Нарёду с выделением пероксидазы и токсических метаболитов кислорода в межклеточное пространство эозинофилы способны уничтожать патоген в процессе фагоцитоза. Эозинофильные гранулоциты ёвлёятсё микрофагами, которые мигрируят из циркулёции в очаг воспалениё, где поглощаят гранулы тучных клеток, иммунные комплексы, бактерии и др. *7+. В ходе настоёщего исследованиё мы оценивали фагоцитарнуя активность клеток в культуре эозинофилов
in vitro по способности поглощать E. coli, меченные флуоресцентной меткой FITC. У всех больных ТЛ независимо от количества эозинофилов в крови и формы заболевание было зарегистрировано увеличение числа фагоцитируящих эозинофилов (рисунок 1). У больных ТЛ с эозинофилией содержание фагоцитируящих клеток достоверно превышало их уровень у пациентов, в крови которых количество эозинофилов соответствовало норме.
Согласно современным представлением, эозинофильные гранулоциты реализуят не только эффекторные функции в патогенезе многих защитно-приспособительных реакций макроорганизма, но и проевлеят регулеторнуя активность за счет секреции широкого спектра иммунорегулеторных молекул *3, 7+.
В настоещем исследовании проводилась оценка концентрации некоторых медиаторов с про- и противовоспалительными свойствами в интактной культуре эозинофилов и при добавлении в культуральнуя суспензия вакцинного штамма BCG (живой аттенуированный штамм M. bovis). Известно, что значительнуя роль в патогенезе ТЛ играят IL-2 - клячевой ростовой фактор Т-лимфоцитов, регулируящий клеточно-опосредованные реакции иммунитета, и TNFa, локальное высвобождение которого приводит к усиления хемотаксиса лейкоцитов, активации поглотительной и перевариваящей функций фагоцитируящих клеток *4+.
В результате исследование in vitro у больных ТЛ с эозинофилией было зарегистрировано увеличение базальной секреции TNFa эозинофильными гранулоцитами на фоне разнонаправленных изменений спонтанной продукции эозинофилами IL-2: гипопродукцие IL-2 при ИТЛ с эозинофилией и, напротив, гиперсекрецие цитокина при ДТЛ, сопровождаящимсе эозинофилией; у больных ТЛ без эозинофилии независимо от клинической формы заболевание уровень базальной секреции IL-2 и TNFa соответствовал норме (таблица 1).
Таблица 1 - Содержание цитокинов в супернатантах культуральных суспензий эозинофильных гранулоцитов у больных туберкулезом легких (пг/мл), Me (Q 1 -Q 3 )
Группы обследованных лиц IL-2 INFa IL-5
Интактнае BCG-индуциро-ваннае Интактнае BCG-индуциро-ваннае Интактнае BCG-индуциро-ваннае
Здоровые доноры 52,29 (24,4569,50) 57,35 (30,7065,76) 615,25 (553,501014,20) 855,44 (622,901352,00) Р4<0,05 6,22 (3,1310,75) 9,15 (4,5112,61) р4<0,05
¡■((к ни ИТЛ 38,37 (22,3049,02) р 1<0,05 44,35 (28,9950,27) р1 <0,05 881,38 (659,841559,04) р1<0,05 1665,83 (662,852295,01) р1<0,05 р4<0,05 15,61 (12,6919,08) р1<0,05 28,27 (22,0336,08) р1<0,05 р4<0,05
ДТЛ 76,63 (51,5080,15) р1<0,05 р3<0,05 67,05 (60,1071,50) р1<0,05 964,02 (655,981533,93) р1<0,05 1025,00 (817,322140,00) р1<0,05 р3<0,05 14,56 (11,6720,34) р1<0,05 27,58 (24,7328,60) р1<0,05 р4<0,05
MIHI ■III ИТЛ 57,15 (24,7570,24) р2<0,05 (23,0662,04) р1<0,05 р2<0,05 р4<0,05 645,70 (554,23987,25) р2<0,05 1381,40 (827,201640,10) р1<0,05 р 4 <0,05 4,16 (2,3112,80) р1<0,05 р 2 <0,05 4,92 (1,617,45) р1<0,05 р2<0,05
ДТЛ 50,65 (23,4271,35) р 2 <0,05 52,25 (39,7459,74) р2<0,05 р3<0,05 641,90 (347,391028,00) р 2<0,05 833,55 (432,641794,20) р2<0,05 р 3 <0,05 р 4 <0,05 4,99 (2,5210,53) р 2<0,05 4,50 (2,139,45) р1<0,05 р2<0,05
Примечан ие: р 1 - уровень статистическои значимости различии по сравнения с аналогичными п араметрами у здоро вых доноров; р2 -
больных туберкулезом легких с эозинофилией; р 3 - у больных инфильтративным туберкулезом легких; р 4 - по сравнения с интактной культурой клеток внутри одной группы обследованных.
Представителем цитокинов альтернативными
свойствами, направлеящих дифференцировку лимфоцитов из ТЬЮ в ТЬ|2, евлеетсе ^-5, который стимулирует процессы пролиферации
и
дифференцировки В-лимфоцитов, индуцирует продукция В-клетками цитокинов и (при трансформации их в плазматические клетки) иммуноглобулинов различных классов *3, 4+.
Как показали результаты проведенных нами исследований, спонтаннае секрецие 11.-5 эозинофильными гранулоцитами периферической крови оказалась достоверно выше больных ТЛ,
сопровождаящимсе эозинофилией (таблица 1). В свези с этим, важно отметить, что гиперпродукцие ТЬ|2-
цитокинов клетками крови ассоциирована прогрессируящим течением ТЛ с преобладанием деструктивных изменений в легочной ткани. Исследование цитокинсекреторной активности эозинофильных гранулоцитов при добавлении в культуральнуя суспензия клеток вакцинного штамма BCG позволило констатировать достоверное повышение уровней BCG-индуцированной in vitro продукции IL-5 и TNFa у больных ТЛ с эозинофилией. При этом уровень BCG-индуцированной секреции IL-2 увеличивалсе лишь у пациентов с диссеминированной формой ТЛ (таблица 1). Выевленные изменение свидетельствуят о повышенной реактивности эозинофильных клеток, способных регулировать процессы адаптивного
противотуберкулезного иммунитета при
дополнительной антигенной нагрузке. Таким образом, эозинофильные гранулоциты крови при ТЛ (особенно сопровождаящимсе эозинофилией) характеризуятсе высокой активностья в отношении экспрессии рецепторных структур, опосредуящих миграция клеток в очаг воспаление. Это в сочетании с истощением пероксидазной активности клеток в
условиех активации их фагоцитарной функции свидетельствует об участии эозинофилов в реализации эффекторных механизмов противотуберкулезной защиты. Гиперсекрецие эозинофилами медиаторов ТЬ|1-и ТИ2-профиле подтверждает их иммунорегулеторные свойства и способность вносить вклад в общий цитокиновый дисбаланс, формируящийсе при туберкулезной инфекции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Borelli V., Vita F., Shankar S., Soranzo M.R. Human Eosinophil Peroxidase Induces Surface Alteration, Killing, and Lysis of Mycobacterium tuberculosis. Infect. and Immun., 2003, Vol. 71, рр. 605-613.
Curran C.S., Bertics P.J. Lactoferrin regulates an axis involving CD11b and CD49d integrins and the chemokines MIP-1a and MCP-1 in GM-CSF-treated human primary eosinophils / J. Interferon Cytokine Res., 2012, Vol. 32(10). рр. 450-461. Fulkerson P.C., Rothenberg M.E. Targeting eosinophils in allergy, inflammation and beyond / Nat. Rev. Drug Discov., 2013, Vol. 12(2). рр. 117 - 129.
Hogan S.P., Rosenberg H.F., Moqbel R. Eosinophils: Biological Properties and Role in Health and Disease / J. Clinic. & Exper.l Allergy., 2008, Vol. 38. рр. 709-750.
Kirman J., Zakaria Z., McCoy K. Role of eosinophils in the pathogenesis of Mycobacterium bovis BCG infection in gamma interferon receptor-deficient mice / J. Infect. Immun., 2009, Vol. 68(5). рр. 2976-2978.
Legrand F., Driss V., Woerly G.A. A Functional y6TCR/CD3 Complex Distinct from y6T Cells Is Expressed by Human Eosinophils / J. PLoS ONE., 2009, Vol. 4(6). рр. 5926-5931.
Park Y.M., Bochner B.S. Eosinophil Survival and Apoptosis in Health and Disease / J. Allergy Asthma Immunol. Res., 2010, Vol. 2(2). рр. 87-101.
1
2
3
4
5
6
7
YU.V. KOLOBOVNIKOVA, O.I. URAZOVA, V.V. NOVITSKY
Siberian State Medical University, Tomsk, Russia
FEATURES OF THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE EOSINOPHIL GRANULOCYTES IN PULMONARY TUBERCULOSIS
Resume: With attraction of modern immunological research methods evaluation of adhesive and cytotoxic properties as well as phagocytic and cytokin-secretory activity of peripheral blood eosinophils in pulmonary tuberculosis was performed. It was established that eosinophil granulocytes in TB patients (especially in combination with blood eosinophilia) are characterized by high experession of CD18 - a common subunit of adhesion molecules Mac-1, LFA-1 and CR4, which mediate cell migration into the focus of the granulomatous inflammation. It was justified that hypersecretion of cytokines with pro- and anti-inflammatory properties (IL-2, TNFa and IL-5) by eosinophils determines the ability of cells to contribute to the general cytokine imbalance formed in the TB infection.
Keywords: eosinophils, pulmonary tuberculosis, cytotoxicity, cytokines.
УДК 618.11-089-071-091.8
А.Т. КОНУРКУЛЬЖИНОВ
ЦГКБ, гинекологическое отделение, г.Алматы
КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТИНА У ПАЦИЕНТОК, ПЕРЕНЕСШИХ ОПЕРАЦИИ НА ЯИЧНИКАХ
Проблема восстановления репродуктивной функции после операции на яичниках актуальна и социально значима в практике акушер-гинеколога. Актуальность проблемы диктует необходимость разработки мероприятий по предотвращению развития патологии яичников и востановлении их функции. Ключевые слова: яичники, опухоли, репродуктивная функция, резекция яичника, аднексэктомия.
