CC BY
41
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПА ЛИМФОЦИТОВ... 71
УДК 616.248-036.65:616.155.32 1 1 2 2 2 И.О. Чикилева , М.В. Киселевский , Т.В. Борисова , О.Г. Фотиади , А.В.Караулов ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПА ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ В ПЕРИОД ОБОСТРЕНИЯ 1РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва
Первый Московский государственный университет имени ИМ. Сеченова Минздравсоцразвития, Москва Контактная информация
Караулов Александр Викторович, профессор, чл.-корр. РАМН, заведующий кафедрой клинической иммунологии и аллергологии
Адрес:119992, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2; тел. +7(495)395-64-97 e-mail: karaulov@mtu-net.ru
Статья поступила 03.12.2010., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
Целью настоящей работы было исследование содержания регуляторных Т-лимфоцитов (Трег), активированных Т-хелперов (Тх) и натуральных киллеров (НК) в крови больных бронхиальной астмой в период обострения по сравнению со здоровыми донорами. Для характеристики содержания субпопуляций лимфоцитов был использован метод многоцветной проточной цитофлуорометрии. Содержание Трег и Тх определяли при помощи одновременного окрашивания клеток антителами к маркерам CD4; CD25 и FoxP3. Для оценки доли НК использовали антитела к CD16 и CD56. Показано, что у пациентов наблюдается значительное увеличение доли активированных Тх CD4+CD25+Foxp3-. При этом количество Трег остается практически неизменным. Среди пациентов были отмечены лица как с повышенной, так и с пониженной долей НК. Однако даже при повышенном уровне НК отмечались нарушения в экспрессии на поверхности НК маркеров активации CD58 и NKG2D. Таким образом, при бронхиальной астме в период обострения наблюдаются изменения субпопуляционного состава лимфоцитов, проявляющиеся, прежде всего, в повышении содержания активированных Тх и альтерациях в экспрессии маркеров активации НК.
Ключевые слова: бронхиальная астма, Трег, FoxP3, НК.
I.O. Chikileva1, M.V. Kiselevsky1, T.V. Borisova2, O.G. Fotiadi2, A.V.Karaulov2
UNUSUAL PHENOTYPIC FEATURES OF LYMPHOCYTES
IN BLOOD OF BRONCHIAL ASTHMA PATIENTS DURING EXACERBATION
1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS,
2I.M. Sechenov 1st Moscow State University Ministry of Health and Social Development Abstract
The purpose of the present work was to study the content of regulatory T-lymphocytes (Tregs), activated T helpers (Th) and natural killer (NK) cells in the blood of bronchial asthma patients in the period of exacerbation and to compare with healthy controls. To characterize percentages of different lymphocyte subpopulations, we applied multicolor fluorescent flow cytometry. The content of Tregs and Th cells were determined by simultaneous staining with antibodies towards CD4, CD25, and FoxP3 markers. To measure of NK-cell percentages, antibodies to CD16 and CD56 were applied. Significant increase in the content of activated CD4+CD25+Foxp3-Th cells was shown in the patients’ group. At the same time quantities of Tregs remained on the same level. In this study we observed the patients manifesting increased as well as decreased percentages of NK-cells. However, even patients with increased NK cells showed abnormalities in expression of NK-cell activation CD58 and NKG2D markers. Taken together, there are changes in subpopulation composition of lymphocytes during exacerbation of bronchial asthma manifesting. The alterations were observed first of all in the increasing of the content of activated Th cells and modulation of NK-cell activation markers expression profile.
Key words: bronchial asthma, Tregs, FoxP3, NK cells.
Введение
У больных бронхиальной астмой отмечаются разнообразные изменения субпопуляционного состава лимфоцитов. В частности, рядом исследователей обнаружено увеличение экспрессии активационных молекул (ИЬЛ-ОК, 0025), зависящее от выраженности основных симптомов заболевания [1; 2; 5; 6; 8; 10].
Кроме того, было показано, что один из возможных механизмов, ведущих к развитию аллергических состояний и астмы, заключается в нарушениях функционирования Трег [11; 14].
В модели на мышах было показано, что накопление Трег в легких и дренирующих лимфати-
ческих узлах коррелирует с прекращением аллергических воспалительных процессов [3].
Многие исследования указывают на существенные изменения содержания НК, их фенотипических и функциональных характеристик при астме [2; 7; 13; 15]. Однако их роль в развитии аллергических реакций и, в частности, атопической бронхиальной астмы до сих пор остается исследованной слабо. Данные о характере изменений содержания НК-клеток при астме противоречивы, что, по всей видимости, объясняется различными выборками пациентов [1; 2; 5; 6; 8-10; 12].
Целью работы было исследование содержания Т-лимфоцитов и НК в крови больных бронхиальной астмой в период обострения.
Материалы и методы
Выделение МНК периферической крови
МНК 11 здоровых доноров и 11 больных астмой в период обострения выделяли из стабилизированной гепарином (25 Ед./мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла плотностью 1,077 г/см3 (ПанЭко, Россия) центрифугированием при 400 g в течение 20 минут. Мо-нонуклеарные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали в среде RPMI-1640. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g.
Фенотипическая характеристика МНК
Содержание Трег CD4+CD25+Foxp3+ и активированных Тх CD4+CD25+Foxp3- определили у 6 пациентов и 6 доноров группы сравнения. Используя МКА (BeckmanCoulter, США), на поверхности МНК больных и здоровых доноров исследовали уровень экспрессии молекул CD4 и CD25. Уровень экспрессии FoxP3 определяли с помощью внутриклеточного окрашивания клеток МКА к FoxP3 (Miltenyi Biotec Inc., Германия). Клетки окрашивали моноклональными FITC (флюоресциинизотио-ционат)-мечеными антителами против CD4, PE (фикоэритрин)-мечеными против CD25 и APC (ал-лофикоцианин)-мечеными антителами против
FoxP3. Результаты учитывали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Содержание НК- и НКТ-клеток определили у 11 пациентов и 11 доноров группы сравнения. Для определения содержания НК- и НКТ-клеток МНК окрашивали комбинацией антител к CD16(FITC), CD56(APC) и CD3(PE). Для характеристики НК были также использованы антитела к CD58 (FITC, BeckmanCoulter, США) и NKG2D(PE) (Miltenyi Biotec Inc., Германия). Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5000 клеток в гейте лимфоцитов. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WIN MDI 2.9. Расчет содержания популяций клеток, несущих разные комбинации трех маркеров (Трег CD4+CD25+Foxp3+, активированных Тх CD4+CD25+Foxp3- и др.) проводился, как описано в нашей работе [4].
Результаты и обсуждение
Наше исследование показало, что у больных бронхиальной астмой наблюдается повышенный уровень экспрессии на поверхности лимфоцитов компонента рецептора интерлейкина-2 CD25, который представляет собой один из маркеров активации лимфоцитов (рис. 1А-Б).
Эти данные согласуются с результатами других исследователей [1; 2]. При этом у данной группы пациентов была значительно повышена доля активированных Тх (CD4+CD25+Foxp3-; рис. 2 А).
В среднем содержание активированных Тх в популяции лимфоцитов больных составило 16± 5% по сравнению с 2,5±1,2 % для здоровых доноров (статистически достоверное отличие при p<0,05). Согласно современным взглядам о важной роли в аллергических процессах эффекторных Тх-лимфо-цитов 2 типа (Тх2) [3; 11], мы предполагаем, что в данной популяции преобладали активированные Тх2-клетки.
б _________
й
свичге
Рис. 1. Типичные точечные графики (дот-плоты) распределения лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции антител к
004, меченных ИТ0, и к 0025(РЕ).
А: здоровый донор.
Б: пациент с астмой.
У пациентов с астмой в период обострения отмечается увеличение экспрессии активационного маркера 0025 также на поверхности лимфоцитов, отличных от 004-позитивных Тх, что, по-видимому, отражает общую напряженность иммунной системы у больных астмой в период обострения. Интересно отметить, что по данным других исследователей даже в период стабилизации у пациентов с астмой отмечается повышенное содержание активированных лимфоцитов как среди 004+ Тх, так и 008+ ци-тотоксических лимфоцитов, также и среди В-лимфоцитов [2].
Содержание супрессорной субпопуляции Трег (004+0025 Рохр3+) у больных астмой практически не отличалось от здоровых доноров (рис. 2Б). Средние значения величины доли Трег для больных составили 2,4+1,1 %, а для здоровых доноров - 2,3+1,3 %. Таким образом, их соотношение с активированными Тх-лимфоцитами у больных астмой значительно ниже, чем у здоровых доноров. Наши данные, подобно результатам других авторов, позволяют предположить недостаточность Трег у больных астмой в период обострения по сравнению со здоровыми индивидуумами контрольной группы [11; 14].
У большинства пациентов с астмой отмечалась очевидная тенденция к снижению количества НК (рис. 3) по сравнению с таковым контрольной группы здоровых индивидуумов. Только у 3 больных, напротив, отмечалось повышение доли НК-клеток.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПА ЛИМФОЦИТОВ... 73
о
о
о
о
А
О 1
■ 2
А 3
□ 4
• 5
• 6
- медиана
♦ 1
2
3
4
5
6
— медиана
Б
Рис. 2. Сравнение содержания активированных Тх и Трег в крови пациентов с астмой и здоровых доноров. На каждой диаграмме приведена медиана значений. Значения процентной доли Тх и Трег для разных индивидуумов в ряде случаев оказались очень близкими, поэтому точки почти сливаются. Каждый пациент или донор обозначен собственным значком.
А: активированные Тх.
Б: активированные Трег.
♦ і ■ 2 Д 3
♦ 4
□ 5
• 6 7
□ 8
А 9 О 10 ■ 11
Рис. 3. Сравнение содержания НК (СШ6+С056+) в крови пациентов с астмой и здоровых доноров. На каждой диаграмме приведена медиана значений. Значения для разных индивидуумов в ряде случаев оказались очень близкими, поэтому точки почти сливаются. Каждый пациент или донор обозначен собственным значком.
74 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ ФЕНОТИПА ЛИМФОЦИТОВ...
Рис. 4. Точечные графики (дот-плоты) распределения лимфоцитов пациента с астмой, имеющего повышенное содержание НК и типичного здорового донора в координатах логарифма интенсивности флуоресценции антител к CD58, меченных FITC, и к NKG2D(PE). NKG2D - активирующий рецептор НК, который экспрессируется практически всеми НК и частью Т-клеток. У пациента практически не заметна популяция клеток, экспрессирующих одновременно NKG2D и молекулы адгезии CD58.
А: пациент.
Б: здоровый донор.
Однако даже у пациентов с повышенным содержанием НК отмечались нарушения активационного статуса клеток. В частности, у 2 из 3 из вышеуказанных пациентов на поверхности НК в значительной степени была понижена экспрессия активационного рецептора НК NKG2D (0-1 % от CD56+ НК) и молекул адгезии CD58 (0-4 % от CD56+ НК) (рис. 4). В группе сравнения практически все НК экспрессировали NKG2D (90-100 % от CD56+ НК), а число CD56+ НК, несущих CD58, варьировало от 30 до 80 %. Однако в настоящем исследовании у больных бронхиальной астмой не удалось выявить статистически достоверного отличия содержания субпопуляции НК по сравнению с таковым группы здоровых доноров (см. рис. 3).
Исследования некоторых авторов указывают, что содержание НК и их активность повышены у пациентов с астмой по сравнению со здоровыми индивидуумами [1; 5; 6; 8-10]. Тем не менее, другими исследователями было показано, что содержание НК у пациентов с атопической астмой в период стабилизации не изменено по сравнению со здоровыми индивидуумами группы контроля [2]. Однако авторы данной работы отмечают повышенное содержание НКТ-лимфоцитов CD3+CD16+CD56+ в группе лиц, страдающих атопической астмой по сравнению с таковым контрольной группы. Эти данные согласуются с работой F. Liu et al., которые показали, что содержание НК у пациентов с бронхиальной астмой во время стабилизации не отличается от такового здоровых индивидуумов [12]. В то же время в период обострения, как и по нашим данным, авторы этой статьи отметили статистически достоверное снижение у пациентов с астмой процентного содержания НК. Как было показано в еще одной работе, снижение содержания НК у детей при тяжелой инфекции респираторным синцитиальным вирусом индуцирует развитие или ведет к обострению аллергической астмы [7]. Авторы связывают это частично с тем, что НК представляют собой один из важнейших источников интерферона-у, цитокина, который направляет иммунные реакции по Тх1-типу и препятствует развитию аллергических реакций Тх2-типа. К сожалению, у нас отсутствуют данные о причине обострения
астмы у пациентов. Поэтому сложно делать четкие предположения о том или ином характере изменений НК.
НК, по всей видимости, играют существенную роль в развитии аллергического воспаления при астме. НК-клетки 2 класса могут секретировать цитокин ИЛ-4, который усугубляет аллергические реакции Тх2-типа [15]. Данные другой работы показали в модели на мышах, что во время контакта животных с аллергеном НК-клетки накапливаются и пролиферируют в лимфатических узлах, дренирующих легкие [13]. Результаты исследования указали, что НК способны потенцировать накопление в легких эозинофилов. Интересно, что авторы отметили увеличение экспрессии на поверхности НК активационного маркера молекул костимуляции презентации антигенов 0086 во время введения мышам аллергена [13]. Наши данные также указывают на существенные фенотипические изменения НК у части пациентов, которые существенно могут повлиять на функционирование клеток. В особенности, понижение экспрессии рецептора ЫКС20 у части пациентов с обострением бронхиальной астмы может привести к понижению способности НК лизировать свои обычные мишени - клетки, инфицированные вирусом или злокачественно трансформированные. Данный рецептор распознает на поверхности своих мишеней лиганды, индуцируемые клеточным стрессом при злокачественной трансформации и вирусной инфекции, а также некоторые вирусные белки. Понижение экспрессии молекулы 0058 может также понизить функциональную активность НК в отношении своих мишеней и, кроме того, с большой вероятностью, приведет к нарушениям в процессах регулирования НК.
Наши результаты и данные других исследователей свидетельствуют о том, что при бронхиальной астме, в особенности при ее обострении, наблюдаются патологические изменения ряда иммунных эффекторов, включая НК, Тх и другие группы лимфоцитов. Точную физиологическую значимость данных явлений и причинно-следственные связи между различными изменениями иммунных клеток при бронхиальной астме предстоит еще досконально изучить.
Выводы
Таким образом, при бронхиальной астме в период обострения наблюдаются изменения субпо-пуляционного состава лимфоцитов, проявляющиеся прежде всего в повышении содержания активированных Тх-клеток (С04+С025+Рохр3-), при этом
доля Трег (С04+С025+Рохр3+) не отличается от здоровых доноров. У большинства пациентов экспериментальной группы было отмечено уменьшение доли НК. Дополнительные исследования показали изменение экспрессии маркеров активации НК (С058, ЫКС20) у некоторых пациентов с повышенным уровнем НК.
Литература
1. Aguilar-AngelesD, Rojo-GutiürrezM.I., Lypez-ValladaresK.E.etal. Lymphocytes B and NK in respiratory allergy // Rev. Alerg. Mex. - 2005. - 52. - P. 183-7.
2. Boh6cs A., P6llingerЙ, Tam6si L. et al. Surface markers of lymphocyte activation in pregnant asthmatics // Inflamm. Res. - 2010. - 59. - P. 63-70.
3. Carson IV W. F, Guernsey L. A., Singh A. et al. Accumulation of Regulatory T Cells in Local Draining Lymph Nodes of the Lung Correlates with Spontaneous Resolution of Chronic Asthma in a Murine Model // Int. Arch. Allergy Immunol. - 2008. - 145(3) - P. 231-43.
4. Chikileva IO; Shubina IZh; Baronzio G; Kiselevsky MV. Is it necessary to deplete the lymphokine activated killers’ populations of CD4+CD25+ lymphocytes? Regulatory Foxp3-positive T cells within lymphokine activated killers // Biomed. & Pharmacother. - 2010. - 64. - P. 379-85.
5. Corrigan C.J. T lymphocytes in asthma pathogenesis. In: Barnes PJ, ed., Asthma. - Philadelphia: Lippin-cott-Raven, 1997. - P. 433-51.
6. Jira M, Antosova V., Vondra J. et al. Natural killer and interleukin-2 induced cytotoxicity in asthmatics. I. Effect of acute antigenspecific challenge // Allergy. - 1988. - 43. - P. 294-8.
7. Kaiko G.E., Phipps S., Angkasekwinai P. et al. NK Cell Deficiency Predisposes to Viral-Induced Th2-Type Allergic Inflammation via Epithelial-Derived IL-25 //J. Immunol. - 2010. - 185(8). - P. 4681-90.
8. Korsgren M, Persson C.G.A., Sundler F. et al. Natural Killer Cells Determine Development of Allergen-induced Eosinophilic Airway Inflammation in mice // J. Exp. Med. - 1999. - 189 - P. 553-62.
9. Korsgren M. NK cells and asthma // Curr. Pharm. Des. - 2002. - 8. - P. 1871-6.
10. Krejsek J., Kral B, Vokurkova D. et al. Decreased peripheral blood y5T cells in patients with bronchial
asthma //Allergy. - 1998. - 53. - P. 73-7.
11. Larchü M. Regulatory T Cells in Allergy and Asthma // Chest. - 2007. - 132. - P. 1007-14.
12. Liu F, Luo Y.L., Wu Y.X., Kong O.Y. Peripheral natural killer cell counting and its clinical significance
blood in patients with bronchial asthma // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. - 2008. - 28(5). - P. 780-2.
13. Ple C, Barrier M, Amniai L. et al._Natural killer cells accumulate in lung-draining lymph nodes and regulate airway eosinophilia in a murine model of asthma //_Scand. J. Immunol. - 2010 - 72(2). - P. 118-27.
14. van Oosterhout A.J.M., Bloksma N. Regulatory T-lymphocytes in asthma // Eur. Respir. J. - 2005. - 26 - P. 918-32.
15. Wei H, Zhang J, Xiao W. et al. Involvement of human natural killer cells in asthma pathogenesis: natural killer 2 cells in type 2 cytokine predominance // J. Allergy. Clin. Immunol. - 2005. - 115(4). - P. 841-7.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ НМ. Н,Н. БЛОХИНА РАМН
