CC BY
26
УДК: 616.344-002-031.84: 616-018
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ АПОПТОЗА ПРИ БОЛЕЗНИ КРОНА
В.В. Павленко, Г.А. Катаганова, Л.З. Амирханова Ставропольская государственная медицинская академия, Ставрополь, Россия
EXPRESSION OF APOPTOSIS MARKERS FOR CROHN'S DISEASE
V.V. Pavlenko, G.A. Kataganova, L.Z. Amirkhanova Stavropl State Medical Academy, Russia
© В.В. Павленко, Г.А. Катаганова, Л.З. Амирханова, 2012
Исследование посвящено изучению роли биологических маркеров апоптоза - CD-95, CD-95-L,
Bcl-2 в патогенезе болезни Крона. Обследованы 30 пациентов с болезнью Крона в динамике лечения различными комбинациями лекарственных препаратов. Экспрессию маркеров апоптоза нейтрофильными лейкоцитами и лимфоцитами периферической крови определяли методом проточной цитометрии. Не выявлено возрастных или половых отличий в способности лейкоцитов крови к экспрессии маркеров апоптоза CD-95, CD-95-L, Bcl-2. Экспрессия маркеров апоптоза CD-95, CD-95-L и Bcl-2 нейтрофильными лейкоцитами и лимфоцитами зависит от характера течения болезни Крона. Установлено, что в период обострения болезни Крона экспрессия CD-95 и Bcl-2 нейтрофилами и лимфоцитами периферической крови повышена; экспрессия CD-95-L нейтрофилами повышена, а лимфоцитами - снижена. В период выраженных клинических проявлений болезни Крона количество нейтрофилов и лимфоцитов крови, экспрессирующих Вс1-2, CD-95 было повышено пропорционально тяжести течения заболевания, а экспрессия CD-95-L иммуноцитами крови находилась в обратной зависимости от клинических проявлений болезни Крона. Выявлена корреляционная взаимосвязь между индексом клинической активности (индекс Беста), с одной стороны, и показателями апоптоза - с другой. Используемые в терапии болезни Крона лекарственные препараты способны оказывать то или иное влияние на процессы апоптоза реактивных лейкоцитов периферической крови. Наибольшей апоптотической активностью обладает инфликсимаб.
Ключевые слова: болезнь Крона, маркеры апоптоза, лимфоциты, нейтрофилы.
Study investigates the role of biological markers of apoptosis - CD-95, CD-95-L, Bcl-2 in the pathogenesis of Crohn’s disease. A total of 30 patients with Crohn’s disease treatment dynamics in various combinations of drugs. The expression of markers of apoptosis of neutrophils and lymphocytes of peripheral blood were determined by flow cytometry. There were no age or sex differences in the ability of leukocytes to the expression of apoptotic markers CD 95, CD-95-L, Bcl-2. Expression of apoptosis markers CD-95, CD-95-L and Bcl-2 neutrophilic leukocytes and lymphocytes depends on the nature of the flow of Crohn’s disease. It was established that during the period of exacerbation of Crohn’s disease expression of CD-95 and Bcl-2 by neutrophils and peripheral blood lymphocytes increased, the expression of CD-95-L increased neutrophils and lymphocytes - reduced. During the period of marked clinical manifestations of Crohn’s disease, the number of neutrophils and lymphocytes expressing Bcl-2, CD-95 was increased in proportion to the severity of the disease, and the expression of CD-95-L of blood immunocytes was inversely related to the clinical manifestations of Crohn’s disease. Correlation relationship between clinical activity index (Best index), on the one hand, and the rates of apoptosis - the other side. Used in the treatment of Crohn’s disease drugs are able to exert a particular influence on the process of apoptosis of reactive peripheral blood leukocytes of patients. The highest apoptotic activity has infliximab.
Key words: Crohn’s disease, markers of apoptosis, lymphocytes, neutrophils.
Болезнь Крона (БК) - хроническое иммуно-воспалительное заболевание кишечника с неизвестной этиологией [1]. Считается, что у лиц с генетической предрасположенностью к БК в совокупности с повреждающими факторами (бактериальные антигены, токсины, аутоантигены) происходит нарушение селективного иммунного ответа,
что сопровождается активацией Т-лимфоцитов (Л), нейтрофилов (ПМЯЛ), нарушением функции макрофагов. В результате происходит образование иммунных комплексов, которые, откладываясь в слизистой оболочке, инициируют выделение различных медиаторов воспаления с повреждением ткани кишечника [2].
Апоптоз является одним из наиболее важных регуляторных механизмов поддержания иммунологического гомеостаза. В нормальной кишке лейкоциты собственной пластинки чувствительны к факторам, запускающим апоптоз, однако, как полагают, при БК формируется резистентность к этим факторам [3].
Цель исследования
Изучение экспрессии маркеров апоптоза -CD-95, CD-95-L, Bcl-2 лейкоцитами периферической крови больных БК в динамике лечения различными комбинациями лекарственных препаратов.
Материалы и методы
Обследованы 30 больных БК (14 мужчин и 16 женщин) в возрасте от 20 до 60 лет в стадии обострения и в динамике лечения (в среднем через 4 недели). Рецидивирующее течение БК установлено у 19 пациентов, острое - у 4, непрерывное - у 7. Для определения тяжести БК использовали индекс активности CDAI (Crohn’s disease activity index) - индекс Беста. Легкая форма БК установлена у 8 пациентов (индекс Беста 150300), среднетяжелая - у 12 пациентов (индекс Беста 301-450), тяжелая - у 10 больных (индекс Беста > 450). В зависимости от тяжести заболевания использовали препараты 5-АСК, глюкокортикостероиды (ГКС), цитостатики, биологическую терапию (инфликсимаб), антибиотики и другие дополнительные средства.
Контрольную группу составили 10 практически здоровых людей. Экспрессию маркеров апоптоза - CD-95, CD-95-L, Bcl-2 лимфоцитами и полиморфноядерными лейкоцитами периферической крови определяли методом проточной цитометрии (проточный цитометр FacCalibur, Becton Dickinson). В контрольной группе экспрессия Bcl-2 ПМЯЛ и лимфоцитами составила 58,2±3,7 и 55,87+4,9%, CD-95 - 64,6±5,6 и 59,9±7,4%, CD-95-L - 10,27+0,9 и 11,05+0,7% клеток соответственно.
При статистической обработке использовали t-критерий Стьюдента, коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs), точный критерий Фишера.
Результаты и их обсуждение
В период обострения БК экспрессия Bcl-2 ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови повышена (66,3+9,06 и 81,7+6,9%, Р < 0,05 с контролем). Подобная закономерность установлена и в отношении экспрессии лейкоцитами
крови CD-95 в этой фазе заболевания. Количество нейтрофилов, экспрессирующих CD-95, составило 77,1±4,2%, а лимфоцитов - 76,9±7,8,0% (Р < 0,05 с контролем). В динамике стационарного этапа лечения количество нейтрофилов и лимфоцитов, экспрессирующих Вс1-2 нормализовалось (56,2±4,03 и 47,6±5,8%, соответственно, Р > 0,05 с контролем). При этом экспрессия CD-95 лейкоцитами крови снизилась, но оставалась выше контрольных величин. Экспрессия CD-95-L лимфоцитами в периферической крови, наоборот, в период обострения БК была снижена (7,05±1,6%, р < 0,05 с контролем), а ПМЯЛ - повышена (16,6±4,2%, Р < 0,05 с контролем). В период формирования клинической ремиссии ( в среднем через 4 недели лечения) экспрессия CD-95-L ПМЯЛ и лимфоцитами нормализовалась (10,05±1,4 и 11,5±2,03%, Р > 0,05 с контролем).
Нами проведен анализ экспрессии СD-95, CD-95-L, Вс1-2 лейкоцитами периферической крови в зависимости от пола и возраста пациентов. Установлено, что способность ПМЯЛ и лимфоцитов к экспрессии маркеров апопто-за СD-95, CD-95-L, Вс1-2 у мужчин (74±11,6 и 71±10,4%; 21,82±13,75 и 7,03±2,4%; 45,8±26,92 и 67,8±13,5%, соответственно) и женщин -(78±10,1 и 88±12,3%, 11,28±6,49 и 3,4±5,7%; 55,5±20,36 и 60,7±13,7%, соответственно) не различалась (Р > 0,05). Не выявлено различий в экспрессии CD-95, CD-95-L и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами в различных возрастных группах пациентов с БК.
Представлял определенный интерес анализ экспрессии CD-95, CD-95-L, Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови в зависимости от характера течения и тяжести БК.
Установлено (табл. 1), что наибольшее количество нейтрофилов, способных экспрессировать Вс1-2 и CD-95, наблюдалось при непрерывном течении БК, а наименьшее - при остром течении заболевания. В то же время экспрессия CD-95-L ПМЯЛ периферической крови была более низкой при непрерывном течении БК. Экспрессия Вс1-2, CD-95 и CD-95-L лимфоцитами периферической крови не зависела от характера течения БК.
В период выраженных клинических проявлений БК количество ПМЯЛ и лимфоцитов крови, экспрессирующих Вс1-2, CD-95, было повышено пропорционально тяжести течения заболевания (табл. 2). При этом экспрессия CD-95-L имму-ноцитами крови находилась в обратной зависимости от клинических проявлений БК.
Таблица 1
Экспрессия CD-95, CD-95-L, Bcl-2 ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови больных БК в зависимости от характера течения (Х±mx)
Течение БК Вс1-2 CD-95-L CD-95
ПМЯЛ Л ПМЯЛ Л ПМЯЛ Л
Острое(п = 4)(1) 43,06±3,02* 66,2±11,8* 29,3±5,8* 3,4±0,7* 67,2±0,7* 84,9±2,2*
Р1 < 0,05 Р1 > 0,05 Р1 < 0,05 Р1 > 0,05 Р1 < 0,05 Р1 > 0,05
Рецидивирующее 62,3±4,19* 62,4±3,2* 17,4±1,3* 4,55±3,25* 77,57±4,3* 76,5±13,4*
(п = 19) (2) Р2 < 0,05 Р2 > 0,05 Р2 < 0,05 Р2 > 0,05 Р2 < 0,05 Р2 > 0,05
Непрерывное 86,63±2,82* 70,6±4,4* 3,36±1,01* 2,6±0,2* 85,97±1,5* 90,6±2,4*
(п = 7) (3) Р3 < 0,05 Р3 > 0,05 Р3 < 0,05 Р3 > 0,05 Р3 < 0,05 Р3 > 0,05
Примечание: * - Р < 0,05 с контролем: Р1 - различия показателей 1 и 2 групп; Р2 - различия показателей 2-й и 3-й групп; Р3 - различия показателей 1-й и 3-й групп.
Таблица 2
Экспрессия Вс1-2, CD-95 и CD-95-L ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови больных БК в зависимости от тяжести (индекс Беста) (Х±mx)
Тяжесть Вс1-2 CD-95-L (%) CD-95 ( %)
БК ПМЯЛ Л ПМЯЛ Л ПМЯЛ Л
Легкое 60,4±0,9* 56,8±1,6* 16,1±7,6* 10,2±3,4* 62,3±5,6* 66,4±0,8*
(140-300 баллов) (п = 8) (1) Р1 > 0,05 Р1 > 0,05 Р1 > 0,05 Р1 < 0,05 Р1 < 0,05 Р1 < 0,05
Среднее 67,1±12,2* 63,95±3,3* 10,3±5,0* 4,1±2,2* 70,1±5,7* 89,9±2,2*
(301-450 баллов) (п = 12) (2) Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 < 0,05 Р2 > 0,05
Тяжелое 86,6±0,8* 86,0±2,0* 2,9±0,8* 2,6±0,2* 83,9±2,3* 92,8±3,9*
( > 450 баллов) (п = 10) (3) Р3 < 0,05 Р3 < 0,05 Р3 < 0,05 Р3 < 0,05 Р3 < 0,05 Р3 < 0,05
Примечание: * - Р < 0,05 в сравнении с контрольной группой: Р1 - различия показателей 1-й и 2-й групп, Р2 - различия показателей 2-й и 3-й групп; Р3 - различия показателей 1-й и 3-й групп.
Выявленную закономерность демонстрирует проведенный корреляционный анализ между показателями апоптоза и клиническим индексом активности БК (индекс Беста) с использованием непараметрического метода ран-
говой корреляции Спирмена (табл. 3). Выявлена прямая достоверная связь между индексом клинической активности и содержанием Вс1-2, CD-95 и обратная - с CD-95-L.
Таблица 3
Взаимосвязь (г.) между показателями апоптоза лейкоцитами периферической крови и показателями индекса клинической активности БК по Бесту
Индекс Беста Вс1-2 CD-95-L CD-95
ПМЯЛ Л ПМЯЛ Л ПМЯЛ Л
150-300 0,414* 0,548* -0,415* -0,371* 0,311* 0,519*
301-450 0,511* 0,620* -0,400* -0,344* 0,434 * 0,652 *
> 450 0,703** 0,663* -0,223 -0,246 0,601* 0,675*
Примечание: *- Р < 0,05; ** - Р < 0,001.
С целью изучения влияния фармакологических препаратов и их комбинаций, используемых в терапии БК, на экспрессию изучаемых маркеров апоптоза лейкоцитами крови обследуемые больные были условно разделены на группы в зависимости от вида лечения (рис. 1, 2).Первую группу больных составили 8 пациентов с легким течением БК (индекс Беста = 150-300), получавших препараты 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) в виде монотерапии. Вторую группу составили 12 больных среднетяжелым БК (индекс Беста = 301-450), получавших комбинацию препаратов
5-АСК с ГКС (преднизолон, будесонид). Третью группу составили 7 больных с тяжелой формой БК (индекс Беста > 450), получавшие в течение 4-х недель сочетанную терапию гормонами и азатиоприном в рекомендованных дозировках. В четвертую группу вошли трое пациентов БК высокой степени клинической активности, получившие в дополнение к базисной терапии Инфликсимаб (Ремикейд) по индукционной схеме в дозе 5 мг/кг массы тела.
Установлено, что у больных 1-й группы на фоне приема 5-АСК экспрессия лейкоцитами изучаемых маркеров апоптоза к концу 4-й недели лечения достоверно снизилась (не до нормы). Во 2-й группе больных с исходно более высоким уровнем иммуноцитов, экспрессирующими CD-95, Вс1-2 и CD-95-L, использование комбинации препаратов 5-АСК с гормонами также способствовало апоптозу определенного количества
реактивных лейкоцитов. В то же время в группе больных с тяжелым течением БК (3-я группа) использование ГКС с цитостатиками способствовало снижению экспрессии иммунокомпе-тентными клетками только CD-95 и Вс1-2, при этом количество лейкоцитов, экспрессирующих CD-95-L, увеличилось. В 4-й группе больных с исходно более высокой экспрессией CD-95, Вс1-2 и низкой - CD-95-L добавление к базисной терапии Инфликсимаба достоверно увеличило уровень готовности иммунореактивных клеток к апоптозу.
Таким образом, не вызывает сомнений ведущая роль иммунных нарушений в развитии воспалительной реакции в кишечнике при БК. Данные литературы свидетельствуют о многочисленных, но не закономерных изменениях клеточного и гуморального иммунитета при БК [4]. Ранее нами была выявлена высокая иммунореактивность лейкоцитов периферической крови у больных с воспалительными заболеваниями кишечника в отношении синтеза биологически активных веществ - цитокинов, простаноидов, лейкотриенов, молекул межклеточной адгезии, кислородных радикалов и др., причем степень функциональной мобилизации иммунокомпетентных клеток сопрягалась с тяжестью иммуновоспалительного процесса [5, 6]. Полагаем, что в данном случае нарушение в регуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток - важный компонент патогенеза воспалительных заболеваний кишечника.
%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ік
до после
ВсІ-2
□ 5-АСК
□ 5-АСК + ГКС
□ ГКС + цитостатики
□ Инфликсимаб
до после
00-95-1. Нейтрофилы
до после
00-95
* - Р < 0,05 с контролем;
** - Р < 0,05 между группами до и после лечения
ВсІ-2
□ 5-АСК
□ 5-АСК + ГКС
□ ГКС + цитостатики
□ Инфликсимаб
00-95-1
Лимфоциты
00-95
* - Р < 0,05 с контролем;
** - Р < 0,05 между группами до и после лечения
Рис. 1. Динамика экспрессии маркеров апоптоза нейтрофильными лейкоцитами в зависимости от вида лечения
Рис. 2. Динамика экспрессии маркеров апоптоза лимфоцитами в зависимости от вида лечения
%
Клетки могут приобрести устойчивость к апоптозу путем усиленной экспрессии анти-апоптотических факторов или в результате мутаций в генах проапоптотических молекул [7]. Так, в активной стадии БК нами выявлена избыточная экспрессия Bcl-2 и CD-95 нейтрофильными лейкоцитами и лимфоцитами периферической крови. При длительной антигенной стимуляции клетки подвергаются апоптозу по механизму индуцированной активацией клеточной гибели. Этот механизм обусловлен тем, что в нем участвует семейство рецепторов фактора некроза опухоли (ФНО). Наиболее важный из них - рецептор Fas, который при связывании со своим лигандом Fas-L вызывает активацию каскада каспаз и в итоге - гибель клетки [8]. Выявленная нами недостаточная экспрессия данного лиганда им-муноцитами больных активным БК, видимо, может нарушать апоптотические механизмы за счет нарушения связывания индукторов апоп-тоза с CD-95-L на поверхности иммунокомпе-тентных клеток, повышать их жизнестойкость, способствуя чрезмерной функциональной активности с развитием воспалительной инфильтрации стенки кишечника и пролонгируя, таким образом, хроническое иммунное воспаление.
Позитивное влияние используемых лекарственных средств при разнообразных формах БК связано с их различным механизмом действия на механизмы апоптоза. Так, недостаточный апоптотический эффект препаратов 5-АСК осуществляется, видимо, по FAS-зависимому пути, но при этом может вовлекаться и митохондриальный путь апоптоза [9]. В результате 4-недельной терапии препаратами 5-АСК экспрессия проапоптотических и антиапоптотиче-ских факторов на поверхности ПМЯЛ и лимфоцитах снизилась, оставаясь, однако, выше контрольных величин.
Не исключено, что тяжелому течению БК способствует и нарастающая резистентность иммуноцитов к факторам апоптоза. Добавление к терапии ГКС и иммуносупрессоров, видимо, способствует в определенной степени преодолению этой резистентности.
Действие ГКС опосредовано внутриклеточными специфическими рецепторами. Рецептор, связывая лиганд, регулирует транскрипцию гормоночувствительных генов. Это могут быть гены, продукты которых регулируют продвижение клетки по клеточному циклу или апоптоз-специфические гены. Показано, что гормоны
индуцируют в активированных лимфоцитах, нейтрофилах и эозинофилах эндонуклеазы, разрушающие ДНК в межнуклеосомных участках, что заканчивается апоптозом клеток. Терапевтический эффект азатиоприна объясняется проапоптотическим действием его метаболита
6-тиогуанина, который, подвергаясь фосфори-лированию, снижает активации антиапоптоти-ческих факторов.
При включении инфликсимаба в комплексную терапию БК (индукционный курс) готовность иммуноцитов к апоптозу значительно возросла. Терапевтический эффект инфликси-маба связан с нейтрализацией растворимого ФНО-а, способного активировать транскрипцию ядерного фактора NFkB, что, видимо, приводит к редукции антиапоптотического механизма в иммуноцитах и клетки подвергаются апоптозу посредством взаимодействия Fas/Fas-лиганд.
Следовательно, используемые в терапии БК лекарственные препараты способны оказывать то или иное влияние на процессы апоптоза реактивных лейкоцитов периферической крови у больных БК. В то же время перспективным подходом к лечению БК, видимо, является использование селективных антиапоптотических лекарственных средств.
Выводы
1. В период обострения БК экспрессия CD-95 и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови повышена; экспрессия CD-95-L ПМЯЛ повышена, а лимфоцитами - снижена.
2. В период формирования клинической ремиссии экспрессия CD-95 и ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови снижается, а количество экспрессируемых иммуноцитами CD-95-L и Вс1-2 нормализуется.
3. Не выявлено возрастных или половых отличий в способности лейкоцитов крови к экспрессии маркеров апоптоза СD-95, CD-95-L, Вс1-2.
4. Экспрессия маркеров апоптоза CD-95, CD-95^ и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами зависит от характера течения БК.
5. Экспрессия CD-95 и Вс1-2 ПМЯЛ и лимфоцитами периферической крови прямо пропорциональна, а CD-95-L обратно пропорциональна клинической активности заболевания.
6. Динамика показателей апоптоза зависит от используемых в лечении БК лекарственных препаратов. Наибольшую апоптотическую активность проявляет инфликсимаб.
Литература
1. Воробьева, Г.И. Неспецифические воспалительные заболевания кишечника/ Г.И. Воробьева, И.Л. Халиф // М. Миклош - 2008. - 399 с.
2. Wehkamp, J. Mechanisms of disease: defensins in gastrointestinal diseases/J. Wehkamp, K. Feller-mann, K.R. Herrlinger [et al.] // Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. - 2005. - Vol. 2. -P. 406-415.
3. Neurath, M.F. Regulation of T-cell apoptosis in inflammatory bowel disease: to die or not to die, that is the mucosal question / M.F. Neurath, S. Finotto, I. Fuss [et al.] // Trends Immunol. -2001.- Vol. 22. - P. 21-26.
4. Ardizzone, S. Biologic therapy for inflammatory bowel disease / S. Ardizzone, G. Bianchi Porro // Drugs. - 2005. - Vol. 65. -P. 2253-2286.
5. Павленко, В.В. Клинико-диагностическое и прогностическое значение некоторых ци-токинов при воспалительных заболеваниях кишечника : автореф. дисс. ... канд. мед. наук /
В.В. Павленко, Н.В. Кораблина. - Ставрополь, 2008. - С. 10-16.
6. Павленко, В.В Растворимые молекулы адгезии (ICAM-1, ICAM-2 и L-селектин) при язвенном колите / В.В. Павленко, Л.З. Амирханова, Г.А. Катаганова, Е.А. Цурова // Мед. вестник Северного Кавказа, - 2012. - № 1. - С. 4-6.
7. Francois, S. Inhibition of neutrophil apoptosis by TLR agonists in whole blood: involvement of the phosphoinositide 3-kinase/Akt and NF-kappaB signaling pathways, leading to increased levels of Mcl-1, A1, and phosphorylated Bad / S. Francois, J. Benna, P.M. Dang [et al.] // J. Immunol. -2005. - Vol. 174. - Р. 3633-3642.
8. Mudter, J. Mucosal T-cells: mediators or guardians of inflammatory bowel disease? / J. Mudter, M.F. Neurath // Curr Opin Gastroenterol. - 2003. - Vol. 19. - P. 343-349.
9. Doering, J. Induction of T lymphocyte apoptosis by sulphasalazine in patients with Crohn’s disease/ J. Doering, B. Begue, M.J. Lentze, [et al.] // Gut. - 2004. - Vol. 53. - P. 1632-1638.
В.В. Павленко
Тел.: (8652)75-54-50
e-mail: [email protected]
