CC BY
45
вает целесообразность мониторинга уровня СРБ при СЭД IV типа.
Специфическое лечение СЭД сосудистого типа в настоящее время отсутствует. Кроме симптоматического лечения проводятся профилактические мероприятия и генетическое консультирование. Ведение пациентов предполагает междисциплинарный подход. Педиатры, генетики, терапевты, ортопеды, физиотерапевты, специалисты ЛФК, неврологи, кардиологи и другие специалисты подключаются на различных этапах жизни пациента и с учетом доминирующих на этот момент клинических симптомов. Пациентам и их семьям должна быть оказана психологическая помощь и поддержка. Следует избегать приема антиагрегантов, антикоагулянтов и препаратов, повышающих артериальное давление. Использование блокатора р1-адренорецеп-торов целипролола, а также ингибитора ренин-ангиотензиновой системы лозартана снижает риск сосудистых осложнений при СЭД IV типа [4]. Гемостатическая терапия направлена на улучшение функционирования сосудистой стенки, возможно назначение аскорбиновой кислоты (аскорутина), этамзилата, антифибринолитиков. В случаях оказания экстренной помощи используется интенсивная гемостатическая терапия: трансфузии тромбоцитов, свежезамороженной плазмы, препаратов VII фактора, эритроцитной массы с заместительной целью.
Приведенный клинический случай является уникальным из-за несоответствия жалоб
пациента (на выраженную слабость, невозможность выполнять минимальную физическую работу во второй половине дня, появление рецидивирующей кожной сыпи, рецидивирующие кровотечения, полиартралгии) объективной, хотя и скудной симптоматике, нормальным результатам, полученным при лабораторных исследованиях, что вызывает трудности в определении тяжести заболевания, несмотря на неблагоприятный прогноз.
Заключение
Наличие семейного анамнеза СЭД, разрывов артерий или диссекции у лиц моложе 40 лет, необъяснимых перфораций сигмовидной кишки, спонтанных пневмотораксов и других симптомов из группы диагностических критериев СЭД является показанием для проведения молекулярно-генетического исследования для верификации диагноза СЭД.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. The international consortium on the Ehlers-Danlos syndromes / L. Bloom [et al.] // Am. J. Med. Genet. C. Semin. Med. Genet. — 2017 Mar. — Vol. 175, № 1. — P. 5-7.
2. The 2017 international classification of the Ehlers-Danlos syndromes / F. Malfait [et al.] // Am. J. Med. Genet. C. Semin. Med. Genet. — 2017 Mar. — Vol. 175, № 1. — P. 8-26.
3. Адаскевич, В. П. Классический тип синдрома Элерса-Данло у 56-летнего пациента / В. П. Адаскевич, О. В. Морозова // Вестник ВГМУ. — 2017. — Т. 16, № 6. — С. 107-113.
4. Сосудистый тип синдрома Элерса-Данло / М. В. Губанова, Л. А. Добрынина, Л. А. Калашникова // Анналы неврологии. — 2016. — Т. 10. — С. 45-51.
5. Germain, D. P. Ehlers-Danilos syndrome type IV. Orphanet / D. P. Germain // J. Rare Dis. — 2007. — Т. 2. — С. 32.
Поступила 06.02.2018
НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 618.19-006.6-07
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРА ПРОЛИФЕРАЦИИ Ы-67 КАК ПОКАЗАТЕЛЯ КАЧЕСТВА ФИКСАЦИИ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Ю. В. Крылов1, А. Ю. Крылов2, А. Н. Млявый1, В. В. Янченко3
Учреждение здравоохранения «Витебское областное клиническое патологоанатомическо>е бюро», г. Витебск, Республика Беларусь Государственное учреждение образования «Институт повышения квалификации и переподготовки кадров Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь», г. Минск, Республика Беларусь
3Учреждение образования «Витебский государственный медицинский университет», г. Витебск, Республика Беларусь
Цель: изучить возможность использования в качестве показателя некачественной фиксации при раке молочной железы особенности локализации маркера пролиферации К1-67 в образцах опухоли с отсроченной фиксацией.
Материал и методы. Материалом исследования являлись 9 образцов опухолей с диагнозом рака молочной железы, удаленных во время операции, которые были разделении на 3 части. Один кусочек являлся контролем, в двух — фиксация была отсрочена на 6 и 12 часов. Проведено стандартное иммуногистохими-ческое исследование HER2, ER, PR и Ю-67 реактивами фирмы <ЮЛКО» (Дания).
Результат. При отсроченной на 6 часов фиксации в инвазивном компоненте опухоли имело место появление Ki-67 в строме в виде мелких гранул и наличие артифициальных щелей. При отсрочке на 12 часов эти изменения были более выражены. При отсроченной фиксации во всех случаях отмечено снижение степени экспрессии HER2. Изменения количественных показателей (%) экспрессии ER и PR были менее однозначны.
Заключение. Наличие Ki-67 в строме опухоли молочной железы может являться признаком некачественной фиксации при анализе материала, поступающего на иммуногистохимическое исследование. Некачественная фиксация искажает результаты имммуногистохимического исследования операционного материала.
Ключевые слова: рак молочной железы, иммуногистохимическое исследование, отсроченная фиксация, маркер пролиферации Ki-67.
FEATURES OF EXPRESSION OF THE KI-67 PROLIFERATION MARKER AS A FIXATION QUALITY INDICATOR IN BREAST CANCER
Yu. V. Krylov1, A. Yu. Krylov2, A. N. Mlyaviy1, U. V. Yanchenko3
Vitebsk Regional Clinical Pathoanatomical Bureau, Vitebsk, Republic of Belarus 2Institute for Advanced Training and Retraining of Personnel of the State Committee of Forensic Expertise of the Republic of Belarus, Minsk, Republic of Belarus 3Vitebsk State Medical University Vitebsk, Republic of Belarus
Objective: to study the opportunity of using the localization features of the Ki-67 proliferation marker in tumor samples with delayed fixation as an indicator of poor-quality fixation in breast cancer.
Material and methods. The material of the study was 9 tumors diagnosed with breast cancer removed during surgery which were divided into 3 parts. One piece was for control, in the two other pieces fixations were delayed for 6 and 12 hours. The standard immunohistochemical study of HER2, ER, PR and Ki-67 with DAKO reagents (Denmark) was carried out.
Result. Ki-67 appeared in the stroma in the form of small granules and artificial fissures were present in the invasive component of the tumor in the 6-hour delayed fixation. In the 12-hour delayed fixation, these changes were more pronounced. A decrease in the degree of hER2 expression was observed in all the cases of the delayed fixation. Changes in the quantitative indices (%) of ER and PR expression were less unambiguous.
Conclusion. The presence of Ki-67 in the mammary tumor stroma can be a sign of poor-quality fixation in the testing of the material received for the immunohistochemical examination. Poor-quality fixation distorts the results of the immunohistochemical study of the surgical material.
Key words: breast cancer, immunohistochemical examination, delayed fixation, Ki-67 proliferation marker.
Введение
Высокая стоимость диагностики и лечения пациенток с диагнозом: «Рак молочной железы» (РМЖ) в настоящее время существенно повышает требования к качеству проводимых иммуногистохимических (ИГХ) исследований, результаты которых позволяют онкомаммоло-гу оценивать прогноз заболевания и выбирать тактику лечения. Отсюда весьма актуальна их стандартизация и воспроизводимость. Одним из подходов к оценке качества, предложенными нами ранее, является оценка процента тройного негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) в различных лабораториях. Этот показатель несомненно зависит от качества фиксации. Плохо фиксированный материал может быть тройным негативным, поэтому оценка качества фиксации особенно в случаях, предполагающих ИГХ-исследование, весьма актуальна. Анализ процента ТНРМЖ в имму-ногистохимических лабораториях также может быть одним из подходов к оценке качества ИГХ-исследования при РМЖ [1]. В наших
предыдущих исследованиях на материале оперативно удаленных лейомиом показана возможность оценки скорости и полноты фиксации материала путем добавления пищевого красителя (заявка на патент РБ № а20160264 от 07.07.2016 г.). Данный подход может быть использован при мониторинге полноты фиксации биопсийного материала при РМЖ [2, 3]. Вместе с тем очевидна необходимость иметь в арсенале морфолога чувствительный способ оценки качества фиксации препаратов, поступающих на гистохимическое исследование. Маркер пролиферации К>67 входит в обязательный набор, рекомендуемый для ИГХ-исследования РМЖ наряду с НЕЯ2, ЕЯ и РЯ, отсюда целесообразно выяснить возможность использования его в качестве маркера некачественной фиксации.
Цель исследования
Изучить возможность использования в качестве показателя некачественной фиксации особенности локализации маркера пролиферации Ю-67 в образцах опухоли с отсроченной фиксацией.
Материал и методы
Для исследования использовали операционный материал пациенток, с РМЖ, полученный после удаления опухоли. Материал был разделен на три группы: 1-я группа — контроль (фиксированная в течение 1 часа после взятия); 2-я группа — опытная (фиксация через 6 часов после взятия; кусочки помещенные в марлевый мешочек и оставленный на 6 часов при комнатной температуре); 3-я группа — опытная (фиксация через 12 часов после взятия; кусочки помещенные в марлевый мешочек и оставленный на 12 часов при комнатной температуре). Для проверки различий между
Учитывая рекомендации по использованию в качестве положительного контроля при исследовании Ю-67 слизистой оболочки тонкой кишки [4], нами проведены исследования материала подвздошной кишки со стандартной и отсроченной на 6 и 12 часов фиксацией от умершего 66 лет с диагнозом: «Инфаркт мозга», без видимых макроскопических изменений в кишечнике. Вскрытие проведено через 4 часа после смерти.
Весь материал фиксировался в 10 % забуфе-реном формалине, в том числе и в случаях с отсроченной фиксацией, осуществлялась проводка материала по стандартной методике. Проводились ИГХ-исследования на К>67, НЕЯ2, ЕЯ и РЯ реактивами фирмы <ЮАКО» (Дания). Оценка ре-
Рисунок 1 — Препарат подвздошной кишки — контроль (фиксирован в 10 % нейтральном забуференном формалине в течение 1 часа, подвздошная кишка от трупа, вскрытие через 4 часа после смерти), отчетливая ядерная экспрессия антигена И-67 (увеличение: х400)
двумя выборками парных измерений, не соответствующим законам нормального распределения (малая выборка), применили непараметрический метод (критерий Вилкоксона), значение показателей приводим в виде медианы и величины интерквартельного размаха (Ме (25 %; 75 %)). Различия считали достоверными при вероятности р < 0,05.
Гистологические варианты опухоли были представлены: инфильтративным дольковым раком — 3 случая; инфильтративной неспецифической карциномой — 6 случаев. Клинико-морфологическая характеристика представлена в таблице 1.
зультатов ИГХ-исследования НЕЯ2 проводилась полуколичественным методом, согласно общепринятым рекомендациям [4]. При изучении ЕЯ, РЯ и К>67 подсчитывалось количество позитивно окрашенных клеток не менее чем в трех полях зрения, высчитывали их процент. Результаты и обсуждение При анализе контрольного материала (подвздошная кишка) (рисунок 1) при окраске на Ю-67 видны железы с отчетливым ядерным окрашиванием.
При отсроченной на 6 часов фиксации в материале появлялись железы с признаками дискомплексации, наличием Ю-67 в строме (рисунок 2).
Рисунок 2 — Препарат подвздошной кишки — отсроченная на 6 часов фиксация. Дискомплексация желез, наличие Ю-67 в строме показано стрелкой (увеличение: х400)
Таблица 1 — Клинико-морфологическая характеристика исследованного материала РМЖ
№ п/п Возраст Гистология Размер Грейд *LVSI Mts (N)
1. 61 Инфильтративная неспецифическая карцинома 3 см 3 +
2. 43 Инфильтративный дольковый рак 2 см 2 + 1+
3. 81 Инфильтративная неспецифическая карцинома 2,5 см 2 - -
4. 60 Инфильтративный дольковый рак 2 см 3 + 2+
5. 68 Инфильтративный дольковый рак 6 см 2 -
6. 36 Инфильтративная неспецифическая карцинома 2 см 3 + 6+
7. 38 Инфильтративная неспецифическая карцинома 3 см 3 + 1+
8. 51 Инфильтративная неспецифическая карцинома 2 см 2 + 7+
9. 52 Инфильтративная неспецифическая карцинома 3 см 2 + 5+
* — lymph-vascular space invasion (LVSI)
При отсроченной на 12 часов фиксации по сравнению с отсроченной фиксацией на 6 часов артифициальные щели, участки с диском-плексацией желез и выявление Кт-67 в строме встречались чаще (рисунок 3).
При РМЖ в контроле имело место четкое ядерное окрашивание Ю-67 клеток опухоли в коричневый цвет (рисунок 4).
При отсроченной на 6 часов фиксации в инва-зивном компоненте опухоли имело место увеличение размеров опухолевых клеток, экспрессирую-щих Ю-67, и появления Ю-67 в строме в виде мелких гранул (рисунок 5). В отдельных полях зрения
Рисунок 3 — Препарат подвздошной кишки -
отсроченная на 12 часов фиксация. Наличие Ш-67 в строме показано стрелкой (увеличение: х400)
Рисунок 5 — Эта же опухоль с отсроченной на 6 часов фиксацией. Наличие Ш-67 в строме показано стрелкой (увеличение: х400)
встречались артифициальные разрывы стромы.
При отсроченной на 12 часов фиксации в инвазивном компоненте опухоли имели место артифициальные разрывы в строме практически во всех полях зрения, увеличение размеров опухолевых клеток, экспрессирующих Ю-67, появления «кляксовидных» фигур, окрашенных Ю-67, наличие Кь67 в строме большинства полей зрения в виде гранул неправильной формы по сравнению с отсроченной на 6 часов фиксацией (рисунок 6).
Результаты ИГХ-исследования изучаемого материала представлены в таблице 2.
Рисунок 4 — Инвазивная неспецифическая карцинома, Грейд 2 — контроль (фиксированная в 10 % нейтральном забуференном формалине, взята в течение 1 часа после радикальной мастэктомии). Отчетливая ядерная экспрессия маркера Ш-67 клетками опухоли (увеличение: х400)
Рисунок 6 — Эта же опухоль с отсроченной на 12 часов фиксацией. Артифициальные разрывы стромы. Наличие Ш-67 в строме показано стрелкой (увеличение: х400)
Таблица 2 — ИГХ-характеристика опухолей РМЖ в случаях отсроченной фиксации 6 и 12 часов
№ п/п Контроль 6 часов 12 часов
Ег Ря HER2 К1-67 Ег Ря HER2 Ю-67 Ег Ря HER2 К1-67
1. 90 % 40 % 0 16 % 80 % 30 % 0 40 % 70 % 20 % 0 40 %
2. 0 % 1 % 0 70 % 0 % 0 % 0 70 % 90 % 80 % 0 70 %
3. 80 % 80 % 2 10 % 80 % 80 % 1 10 % 80 % 80 % 1 10 %
4. 98 % 15 % 2 20 % 96 % 10 % 1 30 % 0 % 0 % 1 40 %
5. 99 % 98 % 0 2 % 95 % 95 % 0 6 % 90 % 80 % 0 6 %
6. 0 % 0 % 1 18 % 0 % 0 % 0 40 % 0 % 0 % 0 30 %
7. 97 % 97 % 1 20 % 95 % 95 % 1 40 % 95 % 95 % 0 35 %
8. 3 % 1 % 3 25 % 2 % 0 % 2 40 % 1 % 0 % 2 40 %
9. 0 % 0 % 1 30 % 0 % 0 % 1 40 % 0 % 0 % 0 50 %
Анализ данных таблицы 2, в которой представлены стандартные ИГХ-показатели, используемые при исследовании РМЖ, показал, что при отсроченной фиксации все случаи со значением 0 для НЕЯ2 при 6 и 12 часах не изменились. В трех случаях со значением НЕЯ2 +1 перешли в 0 при 12 часах отсроченной фиксации, причем один — на 6 часах. У двух женщин с НЕЯ2 +2 статус изменился на НЕЯ2 +1 при 6- и 12-часовх отсрочках фиксации. В одном наблюдении с гиперэкспрессией НЕЯ2 +3 статус снизился до +2 на 6 и 12 часах. Изменения уровня экспрессии ЕЯ и РЯ в процессе отсроченной фиксации были менее зна-
чимы по сравнению с контролем, за исключением двух случаев. В случае № 4 при высоких значениях ЕЯ и РЯ в контроле и отсроченных на 6 и 12 часов фиксациях они были нулевыми. В случае № 2 при низком и отрицательном значении контроля и на 6 часах экспрессия ЕЯ и РЯ на 12 — составила, соответственно, 90 и 80 %.
При анализе экспрессии Ю-67 в двух наблюдениях (случаи 2 и 3) экспрессия не изменилась. Во всех остальных случаях отсроченная фиксация приводила к увеличению процента экспрессии Ю-67, начиная с 6 часов и продолжаясь на 12 часах, результаты представлены в таблице 3 и на рисунках 7 и 8.
Box & Whisker Plot
Er - КС Er - ОФ на 12 ч
Er - ОФ на 6 часов
Средний 25%-75% Min-Max
Box & Whisker Plot
Средний 25%-75% Min-Max
Box & Whisker Plot
Box & Whisker Plot
HER2 - КС HER2 - ОФ на 12 ч
HER2 - ОФ на 6 часов
Средний 25%-75% Min-Max
С#
Ki-67 - КС Ki-67 - ОФ на 12 ч:
Ki-67 - ОФ на 6 часов
Средний 25%-75% Min-Max
d*
№ п/п Контроль 6 часов 12 часов
% ПЗ с Ki-67 в строме % ПЗ с АИ % ПЗ с Ki-67 в строме % ПЗ с АИ % ПЗ с Ki-67 в строме % ПЗ с АИ
1. 0 0 10 30 20 100
2. 5 0 30 40 50 100
3. 0 20 20 50 20 100
4. 0 0 30 40 40 100
5. 0 0 30 40 40 100
6. 0 0 30 50 30 100
7. 0 0 30 40 30 100
8. 0 30 20 60 40 100
9. 5 0 20 50 50 100
Примечание. Результаты округлены для удобства восприятия таблицы
20
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
b
a
Рисунок 7 — Изменение экспрессии маркёров в зависимости от времени фиксации:
a) ER; b) PR; c) HER2; d) Ki-67 * — достоверное отличие между экспрессией Ki-67 в контрольной серии (КС) и сериями отсроченной фиксации (ОФ) на 6 и 12 часов, р=0,018; # - статистически значимое отличие между экспрессией HER2 контрольной серии и отсроченной фиксации на 12 часов, р = 0,023
Таблица 3 — ИГХ-динамика изменения полей зрения с выходом в строму маркёра пролиферации Ki-67 в препаратах РМЖ в случаях отсроченной на 6 и 12 часов фиксации и обнаружения артифи-циальных изменений, щелей
Рисунок 8 — Изменение полей зрения с выходом в строму маркёра пролиферации Ш-67 в препаратах РМЖ и артифициальные изменения в зависимости от времени фиксации: а) с выходом в строму маркёра пролиферации Ш-67; Ь) с артифициальными щелями
* — достоверное отличие между выходом в строму Ш-67 в контрольной серии (КС) и сериями отсроченной фиксации на 6 и 12 часов, р = 0,007; # — статистически значимое отличие между количеством полей зрения с артифициальными щелями контрольной серии и серий с отсроченной фиксацией на 6 и 12 часов, р=0,007
Box & Whisker Plot
5
Средний 25%-75% Min-Max
Box & Whisker Plot
:±
Средний 25%-75% Min-Max
b#
Таким образом, во всех случаях с отсроченной фиксацией имеет место снижение экспрессии НЕИ2. Изменения экспрессии ЕЙ, PR и Ю-67 были менее однозначны, что требует дальнейшего изучения.
Нами были проведен пересмотр микропрепаратов 32 случаев ТНРМЖ, диагностированных в отделении онкоморфологии УЗ «Витебское областное клиническое патологоана-томическое бюро» в 2016 г. В двух наблюдениях были обнаружены изменения, описанные нами на 6 часах отсроченной фиксации.
В исследовании Конышева К.В. (2017 г.) 25 случаев первичной опухоли РМЖ с неопределенным уровнем НЕИ2 (+2) проведено сопоставление с результатами ИГХ-исследования их метастазов. При этом в 20 исследованиях уровень экспрессии в метастазах понизился и составил 0 и 1+ [5]. В этом плане, учитывая полученные данные, можно предположить, что лимфоузлы, обладающие капсулой, фиксировались до поступления на морфологическое исследование не разрезанными, что, к сожалению, нередко встречается в повседневной практике. Поэтому снижение уровня экспрессии НЕИ2 в метастазах по сравнению с первичной опухолью, по-видимому, обусловлено несвоевременной недостаточной фиксацией, как и в нашем экспериментальном материале.
Заключение
Экспериментально подтверждено наше предположении о том, что некачественная фик-
сация при РМЖ искажает результаты ИГХ-исследования. При отсроченной на 12 часов фиксации во всех случаях отмечено достоверное (р = 0,023) снижение степени экспрессии НЕИ2. Изменения количественных показателей (%) экспрессии ЕЙ, РИ были менее однозначны. Экспрессия Ю-67 при отсроченной на 6 и 12 часов фиксации достоверно увеличивается (р = 0,18). При отсроченной на 6 часов фиксации в инвазивном компоненте опухоли имело место появление Ю-67 в строме в виде мелких гранул и наличие артифициальных щелей. При отсроченной на 12 часов фиксации эти изменения были более выражены (р = 0,007). Наличие Ю-67 в строме опухоли молочной железы может являться признаком некачественной фиксации при анализе материала, поступающего на иммуногистохимиче-ское исследование.
Данные о выявлении некачественной фиксации путем оценки особенности локализации Ю-67 в материале, несомненно, обладают научной новизной. Однако, учитывая, что этот маркер используется в повседневной практике исследования РМЖ, а результаты ИГХ-исследования операционного материала имеют важное значение для выбора противоопухолевой лекарственной терапии, мы решили не подавать заявку на патент и сделать эти результаты наших исследований по оценке Ю-67 в биопсийном материале общедоступными.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Крылов, А. Ю. Оценка качества иммуногистохимическо-го исследования при раке молочной железы / А. Ю. Крылов / Клиническая и экспериментальная морфология. — 2017. — № 1(21). — С. 24-28.
2. Оценка скорости и качества фиксации биопсийного материала при раке молочной железы / А. Ю. Крылов [и др.] // Рецензируемый научно-практический журнал «Охрана материнства и детства». — 2016. — № 2(28). — С. 13-15.
3. Оценка скорости и полноты фиксации биопсийного материала добавлением в формалин пищевого красителя / А. Ю. Кры-
лов [и др.] // Журнал «Судебная экспертиза Беларусии». — 2017. — № 1 (4). — С. 52-54.
4. Рак молочной железы. Практическое руководство для врачей / Ю.Ю. Андреева [и др.]; под ред. Г. А. Франк, Л. Э. За-валишиной, К. М. Пожарисского. — М.: Практическая медицина, 2014. — 176 с.
5. Амплификация гена егЬЬ2 в клетках первичной опухоли и экспрессия белка НЕЯ2/пеи в ткани регионарных метастазов при раке молочной железы / К. В. Конышев // Материалы V съезда Российского общества патологоанатомов. — Челябинск, 2017. — С. 155-156.
Поступила 06.07.2017
