CC BY
7doi: 10.17116/terarkh201587797-100 © Коллектив авторов, 2015
Особенности диагностики острого лейкоза со смешанным фенотипом: сочетание экспрессии В-клеточных антигенов по результатам проточной цитометрии и морфологических маркеров миелоидной дифференцировки в бластных клетках
С.В. ГРИЦАЕВ, И.И. КОСТРОМА, Г.М. РЯДНОВА, С.А. ТИРАНОВА, Ж.В. ЧУБУКИНА, В.А. БАЛАШОВА, М.Н. ЗЕНИНА, И.С. МАРТЫНКЕВИЧ, Н.А. ПОТИХОНОВА, К.М. АБДУЛКАДЫРОВ
ФГБУ «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» ФМБА России, Москва, Россия
The specific features of diagnosis of mixed-phenotype acute leukemia: A combination of B-cell antigen expressions according to the results of flow cytometry and morphological markers of myeloid differentiation in blast cells: A clinical case
S.V. GRITSAEV, I.I. KOSTROMA, G.M. RYADNOVA, S.A. TIRANOVA, Zh.V. CHUBUKINA, V.A. BALASHOVA, M.N. ZENINA, I.S. MARTYNKEVICH, N.A. POTIKHONOVA, K.M. ABDULKADYROV
Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Federal Biomedical Agency of Russia, Moscow, Russia
Аннотация
Диагностика редкого варианта острого лейкоза, бластные клетки которого экспрессируют миелоидные и/или лимфоидные маркеры, осуществляется преимущественно по данным проточной цитометрии. Приведен клинический случай острого лейкоза со смешанным фенотипом, при котором методом проточной цитометрии выявлена экспрессия В-лимфоидных антигенов, в то время как в морфологических препаратах костного мозга обнаружены признаки, типичные для бластных клеток миелоидной направленности. Сделано заключение о необходимости комплексного обследования больных с впервые выявленным острым лейкозом и совокупным анализом результатов проточной цитометрии с данными морфологического и цитохимического исследований.
Ключевые слова: острый лейкоз, смешанный фенотип.
This rare type of acute leukemia, blast cells of which express myeloid and/or lymphoid markers, is mainly diagnosed using flow cytometric findings. The paper describes a clinical case of mixed-phenotype acute leukemia, in which B-cell lymphoid antigen expressions were revealed by a flow cytometric technique, while bone marrow morphological specimens showed the signs of myeloid differentiation specific to blast cells. It is concluded that there is a need for a comprehensive examination of patients with new-onset acute leukemia and for an aggregate analysis of flow cytometric results with morphological and cytochemical findings.
Key words: acute myeloid leukemia, mixed-phenotype.
БК — бластные клетки ОЛ-СФ — ОЛ со смешанным фенотипом
КМ — костный мозг ОМЛ — острый миелоидный лейкоз
ОЛ — острый лейкоз ПЦМ — проточная цитометрия ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз/лимфома
Согласно классификации ВОЗ, выделяют 3 вида острого лейкоза (ОЛ) [1]: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) и родственные неоплазии из миелоидных предшественников; острый лимфобластный лейкоз/лимфома (ОЛЛ); наконец, ОЛ, для обозначения которого предложен термин «ambiguous» (неоднозначный, двусмысленный), который может быть интерпретирован как «неопределенный».
Данный термин представляется вполне оправданным, если принять во внимание, что при этом варианте ОЛ невозможно корректно верифицировать ни ОМЛ, ни ОЛЛ. Речь идет об остром недифференцированном лейкозе и ОЛ со смешанным фенотипом (mixed phenotype acute leukemia — MPAL) — ОЛ-СФ. В первом случае отсутствуют маркеры линейной принадлежности бластных клеток (БК), во втором одновременно выявляется экспрессия миелоидных и/или лимфоидных (В- и/или Т-клеточных) маркеров (не путать с аберрантной коэкспрессией лимфоидных или миелоидных маркеров на бластных клетках ОМЛ или ОЛЛ!).
У больных ОЛ со смешанным фенотипом антигены разных клеточных линий могут быть экспрессированы на одних и тех же бластах (ранее так называемый острый бифенотипичный лейкоз) или обнаруживается сосуществование популяций бластов разной клеточной направленности (ранее так называемый острый билинейный лейкоз).
В классификации ВОЗ ОЛ со смешанным фенотипом (ОЛ-СФ) представлен пятью подвариантами. Два из них характеризуются неслучайными хромосомными аберрациями, а именно транслокацией 1(9;22)(д34;д11.2)/БСК-АБЬ1 и транслокацией 1(у;1Ц23)/МЬЬ. Остальные 3 подварианта: острый В-клеточный/ миелоидный лейкоз, без дополнительных характеристик; острый Т-клеточный/миелоидный лейкоз, без дополнительных характеристик и острый В-клеточный/Т-клеточный/миелоидный лейкоз.
Необходимо отметить, что диагностика смешанно-линейной принадлежности БК — завершающий этап алгоритма обследования больных ОЛ. Предварительно необходимо исключить
случаи ОЛЛ и ОМЛ с аберрантной экспрессией антигенов, а также бластный криз хронического миелолейкоза. Таким образом, диагностика при ОЛ-СФ, как и во всех других случаях, строится по результатам комплексного обследования, обязательными элементами которого являются иммунологические и молекулярно-генетические исследования.
Это обосновано тем, что при обнаружении неслучайных хромосомных аберраций, типичных для ОМЛ, например транслокации t(8;21) или inv(16)/t(16;16) или выявлении клинических и лабораторных характеристик, соответствующих критериям диагностики ОМЛ с признаками миелодисплазии или вторичного ОМЛ после ранее проведенной цитостатической и/или лучевой терапии, устанавливается соответствующий диагноз, даже если результаты иммунофенотипирования БК соответствуют параметрам ОЛ-СФ.
Согласно классификации ВОЗ, для верификации ОЛ-СФ достаточно изучение небольшого числа маркеров, обладающих высокой степенью специфичности. Речь идет прежде всего о ми-елоидной и Т-клеточной направленности БК, которая может быть установлена при обнаружении соответственно миелоперок-сидазы и цитоплазматического или поверхностного антигена CD3. Что касается моноцитарной и В-клеточной направленности БК, то по причине отсутствия единственного высокоспецифичного для каждой из этих клеточных линий маркера рекомендовано расширить список изучаемых антигенов. Так, для того чтобы подтвердить В-клеточную направленность БК, следует выявить сочетание сильной экспрессии CD19 и сильной экспрессии одного из следующих антигенов: цитоплазматический CD79a, цитоплазматический CD22 или CD10. Вторая комбинация представлена слабой экспрессией CD19, но сильной экспрессией не менее 2 из 3 ранее указанных антигенов.
Основным методом диагностики ОЛ-СФ является проточная цитометрия (ПЦМ). Тем не менее, разбирая критерии, предложенные экспертами ВОЗ, следует обратить внимание на то, что в классификации не указан уровень экспрессии отдельных антигенов, который мог быть использован как пограничный показатель, необходимый для корректной верификации ОЛ-СФ. В ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России условно приняты следующие значения: для линейно-неограниченных ^D34, CD38, HLA-DR) и цитоплазматических линейно-ассоциированных (специфических) позитивным считается уровень 10% и выше, для поверхностных линейно-ассоциированных антигенов — 20% и выше. E. Matutes и соавт. [2] в своей работе анализируют данные обследования 100 больных ОЛ-СФ, включая 59 с В-клеточным/миелоид-ным и 35 с Т-клеточным/миелоидным вариантами. У 98% из этих больных экспрессия миелопероксидазы выявлена не менее чем на 5% БК и только у 76% больных миелопероксидаза экспресси-рована более чем на 20% БК. У 4 больных, которым не выполнена проточная цитометрия, миелоидная направленность БК установлена по результатам стандартного цитохимического исследования: в 5—9% бластов выявлена положительная реакция на миело-пероксидазу и судан черный. При этом количество БК, коэк-
Сведения об авторах:
Грицаев Сергей Васильевич — г.н.с. клинического отд. гематологии
Ряднова Галина Михайловна — врач клинического отд. гематологии
Тиранова Софья Александровна — врач клинико-диагностической лаб.
Чубукина Жанна Викторовна — с.н.с. лаб. иммуногематологии Балашова Валентина Андреевна — с.н.с. лаб. лейкозов Зенина Марина Николаевна — врач клинико-диагностической лаб.
Мартынкевич Ирина Степановна — рук. молекулярно-генетиче-ской лаб.
Потихонова Надежда Александровна — зав. клинико-диагностической лаб.
Абдулкадыров Кудрат Мугутдинович — рук. клинического отд. гематологии
спрессирующих миелопероксидазу и лимфоидные маркеры, у отдельных больных варьировало от 5 до 95%.
Для выявления миелопероксидазы наряду с ПЦМ экспертами ВОЗ рекомендовано манипулировать результатами иммуно-гистохимического и цитохимического методов. Не менее информативными представляются и находки при световой микроскопии, в частности обнаружение такого специфического маркера миелоидной природы БК, как палочки Ауэра. В качестве примера можно привести описания двух клинических случаев острого Т-клеточного/миелоидного лейкоза, опубликованные в 2014 г. [3, 4]. У больных 15 и 28 лет при первичном обследовании выявлена тотальная инфильтрация костного мозга (КМ) БК, которые, как установлено по результатам ПЦМ, экспрессировали Т-клеточные антигены. Миелоидные и В-клеточные антигены при ПЦМ не обнаружены. Тем не менее у обоих больных диагностирован ОЛ-СФ. Основанием послужили находки при световой микроскопии и цитохимическом исследовании: палочки Ауэра и положительная окраска на миелопероксидазу соответственно в 6 и 3% БК.
Ранее авторы данной статьи сообщали о крайне редкой частоте ОЛ-СФ в их клинической практике: 1 из 132 больных ОЛ, которым выполнено иммунофенотипирование БК с применением расширенного набора моноклональных антител [5]. Вместе с тем данные литературы и накапливающийся собственный опыт свидетельствуют, что число больных ОЛ-СФ может быть несколько большим, если проводить совокупный анализ результатов морфологического, цитохимического, иммунологического и молекулярно-генетического исследований. Иллюстрацией данного тезиса может быть следующее клиническое наблюдение.
Больная О., 44 года, направлена в гематологическую клинику ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России с предварительным диагнозом ОЛ. За 2 нед до госпитализации в анализе крови, выполненном в связи с жалобами анемического характера, обнаружена бластемия до 10%. Для коррекции анемии больная получила трансфузии донорских эритроцитов. Цитостатические препараты не назначались. В анамнезе отсутствовали указания на предшествующие курсы химио- и/или лучевой терапии, а также на контакт с генотоксичными веществами.
При госпитализации состояние средней тяжести. Температура тела в норме. Бледность слизистых оболочек и кожи, без ге-моррагий. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Печень и селезенка не пальпируются. В клиническом анализе крови гемоглобин 130 г/л, тромбоциты 55-109/л, лейкоциты 1,2-109/л, из них бласты 50%.
В пунктате КМ миелокариоциты 35,0-109/л, бласты 75%. Бластная популяция представлена бластами I и II типов, вариабельна по размеру и форме и однородна морфологически. Структура ядерного хроматина мелкозернистая, ядрышки (от 1 до 3) крупные, хорошо очерченные. Цитоплазма от голубых до базо-фильных тонов. Ядерно-цитоплазматическое соотношение в бластах II типа более низкое, чем в бластах I типа, с наличием нескольких крупных азурофильных гранул. В единичных клетках встречены палочки Ауэра, вакуолизация ядра цитоплазмы (рис. 1, а—и см. на цв. вклейке).
Цитохимические реакции на миелопероксидазу, липиды, кислую фосфатазу и PAS-реакцию в БК КМ отрицательные.
По результатам ПЦМ, выполненной на цитометре Beckman Coulter в пятицветном анализе, установлена В-лимфоидная направленность БК: CD34+ HLA-DR+CD38+CD117+cyCD79a+CD19+ CD20- CD22- MPO- CD117+ CD33- CD13+ cyCD3- CD7+ CD3-CD1a- CD2- CD5- CD10- CD64- CD14- CD56-. Экспрессия ци-топлазматической миелопероксидазы обнаружена в 3,6% бла-стов. Тест на экспрессию цитоплазматического антигена CD3 отрицательный (рис. 2).
При стандартном цитогенетическом исследовании выявлены множественные поломки, соответствующие критериям ком-
Контактная информация:
Кострома Иван Иванович — м.н.с. клинического отд. гематологии; 193024 Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16; тел.: +7(921)784-8282; e-mail: obex@rambler.ru
Особенности диагностики острого лейкоза со смешанным фенотипом
плексного кариотипа: mos46,XX,der(1),der(2)t(2;?)(p13;?),der(5) t(5;?)(p11;?), del(7)(q22),—10,—11,del(12)(p11),del(13)(q21),—14,+(1—) mar, парные фрагменты с вариациями [18]/46,ХХ [2]. Одновременно характер хромосомных аберраций соответствовал и критериям моносомного кариотипа [6]. Химерные гены BCR/ABL, AF4/MLL, E2A/PBX1, CBFb/MYH1, RUNX/RUNX1T1, а также мутации в генах NPM1 и FLT3 не обнаружены. Несмотря на негативные результаты цитохимического исследования и слабую экспрессию цитоплазматической миелопероксидазы по данным ПЦМ, диагностирован острый смешанный В-клеточный/миело-идный лейкоз без дополнительных характеристик. Основанием послужила находка палочек Ауэра в ряде бластов КМ при световой микроскопии. Дополнительным аргументом для окончательной верификации диагноза послужила высокая экспрессия мие-лоидного антигена CD13: на 93,4% БК.
После подписания больной информированного согласия инициирован поиск совместимого по HLA неродственного донора и начато лечение по протоколу ОЛЛ-2009. Данный протокол выбран из-за преимущественной экспрессии лимфоидных маркеров. Ввиду отсутствия клинически значимого уменьшения количества БК после завершения предфазы больная переведена на прием дексаметазона. Первый индукционный курс оказался неэффективным, морфологическая санация КМ не достигнута. Си-блингов у больной нет. Совместимых по HLA неродственных доноров в регистре доноров КМ ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России не найдено. Продолжено лечение по схемам вне рамок какого-либо протокола в амбулаторных условиях.
ОЛ-СФ — редкий вариант у детей и взрослых. Его распространенность среди всех ОЛ не превышает 2—5% [7—9]. Тем не менее необходимость выделения данного варианта обосновывается прежде всего неудовлетворительными результатами лечения как цитостатическими препаратами, так и после выполнения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток [2, 10—13].
Выбор протокола для лечения больных ОЛ, характеризующегося коэкспрессией миелоидных и лимфоидных маркеров, всегда затруднителен. Используют протоколы для лечения больных как ОЛЛ, так и ОМЛ. Нередко применяют схемы, представляющие комбинацию препаратов, назначаемых больным ОМЛ и ОЛЛ. Предполагается, что проблема индивидуализации лечения может быть отчасти решена по результатам изучения профиля экспрессии микроРНК (miR-23a, miR-27a, miR-199b, miR-221 и miR-223) [14].
Несомненно, добавление иматиниба к цитостатической терапии в тех случаях, когда выявляется транслокация 1(9;22), может значительно повысить частоту полных ремиссий, а также бессобытийную и общую выживаемость [15]. Однако необходимо учитывать, что наиболее частой находкой у больных ОЛ-СФ является комплексный кариотип, обнаруживаемый в 24—32% случаев [2, 10, 16].
Коэкспрессия на БК миелоидных и лимфоидных антигенов в совокупности с антигенами СБ34 и СБ117 дает основание предполагать возникновение ОЛ-СФ на уровне ранних стволовых клеток, еще обладающих способностью дифференцироваться и в лимфоидном, и в миелоидном направлениях. В то же время отсутствие уникального для всех больных молекулярно-генети-ческого повреждения и, напротив, многообразие цитогенетиче-ских аберраций в случаях с нарушениями кариотипа позволяют обсуждать вопрос о биологической гетерогенности ОЛ-СФ [2]. Возможно, что именно вариабельность биологических механизмов, вовлеченных в формирование патологического клона, например в виде мутаций отдельных генов [10], может рассматриваться как причина того, что в ряде случаев морфологические, цитохимические и иммунологические находки отличаются от классических параметров, заданных в классификации ВОЗ. Примером может быть и представленное клиническое наблюдение, когда, несмотря на низкую экспрессию миелопероксидазы по данным ПЦМ (в 4% БК), в морфологических препаратах КМ выявлены палочки Ауэра.
В заключении необходимо еще раз подчеркнуть, что верификация варианта ОЛ должна осуществляться по результатам комплексного обследования больного. Несмотря на приоритетную роль метода ПЦМ в распознавании линейной принадлежности БК, корректная диагностика ОЛ-СФ возможна при сопоставлении данных иммунофенотипирования с результатами морфологического, цитохимического и молекулярно-генетического исследований. Трудности диагностики в совокупности с неудовлетворительными результатами лечения явились основанием для совместного с городскими гематологами обсуждения проблемы ОЛ-СФ. Принято решение о создании экспертной группы на базе гематологической клиники ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России, целью работы которой планируется улучшение качества диагностики посредством анализа препаратов КМ и результатов имму-нофенотипирования независимыми экспертами, а также разработка единого протокола лечения больных ОЛ-СФ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, Brunning RD, Borowitz MJ, Porwit A, Harris NL, Le Beau MM, Hellstrom-Lindberg E, Tefferi A, Bloomfield CD. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood. 2009;114:937-951.
2. Matutes E, Pickl WF, Van't Veer M, Morilla R, Swansbury J, Strobl H, Attarbaschi A, Hopfinger G, Ashley S, Bene MC, Porwit A, Orfao A, Lemez P, Schabath R, Ludwig WD. Mixed-phe-notype acute leukemia: clinical and laboratory features and outcome in 100 patients defined according to the WHO 2008 classification. Blood. 2011;117:3163-3171.
3. Gajendra S, Sachdev R, Dorwal P, Goel S, Jha B, Sahni T. Mixed-phenotypic acute leukemia: cytochemically myeloid and phenotypically early T-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood Res. 2014;49:196-198.
4. Naseem S, Agarwal P, Varma N. Acute leukemia cytochemically
myeloid and immunophenotypically T lymphoid. J Pediatr Hematol Oncol. 2014;36:387-388.
Грицаев С.В., Чубукина Ж.В., Мартынкевич И.С., Кострома И.И., Глазанова Т.В., Петрова Е.В., Мартыненко Л.С., Тиранова С.А., Потихонова Н.А., Зюзгин И.С., Бубнова Л.Н., Абдулкадыров К.М. Клинико-гематологическая и молекулярно-генетическая вариабельность острого миело-идного лейкоза с аберрантной экспрессией CD7 на поверхности бластных клеток. Клиническая онкогематология. 2013; 4:427-433.
Breems DA, Löwenberg B. Acute myeloid leukemia with mono-somal karyotype at the far end of the unfavorable prognostic spectrum. Haematologica. 2011;96:491-493.
Bene MC, Castoldi G, Knapp W, Ludwig WD, Matutes E, Orfao A, van't Veer MB. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European group for the immunological characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia. 1995;9:1783-1786.
Aribi A, Bueso-Ramos C, Estey E, Estrov Z, O'Brien S, Giles F, Faderl S, Thomas D, Kebriaei P, Garcia-Manero G, Pierce S, Cortes J, Kantarjian H, Ravandi F. Biphenotipic acute leukemia. Br J Haematol. 2007;138:213-216.
7
9. Rubnitz JE, Onciu M, Pounds S, Shurtleff S, Cao X, Raimondi SC, Behm FG, Campana D, Razzouk BI, Ribeiro RC, Downing JR, Pui CH. Acute mixed lineage leukemia in children: the experience of St Jude Children's Research Hospital. Blood. 2009;113:5083-5089.
10. Yan L, Ping N, Zhu M, Sun A, Xue Y, Ruan C, Drexler HG, Macleod RA, Wu D, Chen S. Clinical, immunophenotypic, cytogenetic, and molecular genetic Features in 117 adult patients with mixed-phenotype acute leukemia defined by WH0-2008 classification. Haematologica. 2012;97:1708-1712.
11. Weir EG, Ali Ansari-Lari M, Batista DA, Griffin CA, Fuller S, Smith BD, Borowitz MJ. Acute bilineal leukemia: a rare disease with poor outcome. Leukemia. 2007;21:2264-2270.
12. Al-Seraihy AS, Owaidah TM, Ayas M, El-Solh H, Al-Mahr M, Al-Ahmari A, Belgaumi AF. Clinical characteristics and outcome of children with biphenotypic acute leukemia. Haematologica. 2009;94:1682-1690.
13. Park JA, Ghim TT, Bae K, Im HJ, Jang SS, Park CJ, Chi HS, Seo JJ. Stem cell transplant in the treatment of childhood bipheno-typic acute leukemia. Pediatr Blood Cancer. 2009;53:444-452.
14. de Leeuw DC, van den Ancker W, Denkers F, de Menezes RX, Westers TM, Ossenkoppele GJ, van de Loosdrecht AA, Smit L. MicroRNA profiling can classify acute leukemias of ambiguous lineage as either acute myeloid leukemia or acute lymphoid leukemia. Clin Cancer Res. 2013;19:2187-2196.
15. Lee KH, Lee JH, Choi SJ, Lee JH, Seol M, Lee YS, Kim WK, Lee JS, Seo EJ, Jang S, Park CJ, Chi HS. Clinical effect of imatinib added to intensive combination chemotherapy for newly diagnosed Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2005;19:1509-1516.
16. Zixing Y, Shujie W. Mixed phenotype acute leukemia. Chin Med J. 2014;127:2999-3003.
Поступила 06.02.2015
