CC BY
127
раздел ФИЗИКА
УДК 577.323
ОСОБЕННОСТИ АСМ-ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛ ДНК НА СЛЮДЕ
© Т. И. Шарипов1*, Р. Р. Гарафутдинов2, Р. З. Бахтизин1
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450074, ул. Фрунзе, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 65 74.
E-mail: Sha-T@yandex. ru 2Институт биохимии и генетики УНЦРАН Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450054, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 60 88.
Методами атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследовались структура и иммобилизационные свойства молекул ДНК. Разработаны методики приготовления образцов для атомно-силовой микроскопии молекул ДНК на слюде. Получены АСМ-изображения фрагментов ДНК и молекул ДНК бактериофага X.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, ДНК, структура, иммобилизация.
Мощным инструментом для исследования биологических макромолекул являются сканирующий туннельный и атомно-силовой микроскопы. Молекулы ДНК, играющие важную роль в молекулярной биологии и создании технологии биочипов, интенсивно изучаются с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ), имеющей меньше ограничений по применимости. При подборе адекватной методики приготовления образцов атомно-силовой микроскоп представляет собой удобный и надежный прибор для исследования свойств биологических структур на молекулярном уровне. В 1992 г. были опубликованы первые надежные и воспроизводимые результаты исследования ДНК методом АСМ [1]. Необходимым условием успешности таких исследований является иммобилизация молекул ДНК на атомарно гладкую поверхность подложки, позволяющая исследовать их структурные особенности. Для этого необходимо разработать
методику приготовления образцов. Важно, чтобы исследуемые молекулы прочно фиксировались на поверхности подложки в расправленном состоянии.
Существуют две наиболее часто используемые методики приготовления образцов для исследования ДНК методом атомно-силовой микроскопии. По первой методике изучаемые объекты наносят из капли рабочего раствора на поверхность слюды (слюда является типичной подложкой для АСМ-исследований), которая предварительно модифицируется катионами двухвалентных металлов [2,3] (рис. 1а). Следует отметить, что в водных растворах поверхность слюды становится отрицательно заряженной. В то же время фосфатные группы ДНК имеют отрицательный заряд. Таким образом, вследствие электростатического отталкивания молекулы ДНК не могут закрепиться на слюде. Поэтому катионы служат связующими элементами между ДНК и поверхностью слюды.
Рис. 1. Связывание молекулы ДНК и подложки: а) ионами металлов; б) пленкой силанов.
Также для иммобилизации ДНК на подложке используют химическую модификацию, которая заключается в обработке поверхности слюды различными производными силана (APTES, APS, си-латран и др.) (рис. 1б) [4]. При этом поверхность модифицированной слюды остается достаточно гладкой для проведения АСМ-исследований.
Типичными артефактами при АСМ-иссле-дованиях молекул ДНК являются завышенные латеральные размеры - 10-15 нм - и заниженные вертикальные - около 0,7-0,8 нм, в то время, как диаметр одиночной молекулы ДНК около 2 нм. Завы-
шение латеральных размеров обусловлено конечной величиной радиуса кривизны зонда [5]. Причиной занижения вертикальных размеров может являться деформация молекулы под действием зонда.
АСМ-исследования проводили в полукон-тактном режиме на приборе «Solver P47» (ЗАО «NT -MDT», г. Зеленоград, Россия) на воздухе с использованием отечественных Si кантилеверов (ЗАО «NT-MDT»). В качестве подложек использовали поверхности свежего скола слюды, модифицированные благодаря обработке катионами метал-
Вестник Башкирского университета. 2007. Т. 12, №3
19
лов. При приготовлении всех растворов использовали бидистиллированную деионизованную воду шПИ^. Исследуемыми образцами служили фрагменты двуцепочечной нативной ДНК и молекулы ДНК бактериофага А.
Исследование фрагментов нативной ДНК
С целью получения четких изображений молекул ДНК на слюде был испробован ряд методик иммобилизации ДНК, в ходе которых варьировались концентрация образцов и условия среды. В первую очередь была проверена способность ионов двухвалентных металлов закреплять ДНК на поверхности. В качестве связующих катионов были опробованы катионы Мп2+, №2+, М^2+. Обнаружено, что наилучшими иммобилизующими свойствами обладает Мп2+, дающий хорошо воспроизводимые результаты.
Образцы были приготовлены следующим образом: свежесколотую слюду выдерживали в течение 40 мин. в 10 мМ растворе Мп804, а затем подвергали сушке на воздухе и наносили на нее иммобилизационный раствор, содержащий 10 мМ Мп804 и 10 нг/мкл ДНК (фрагменты двуцепочечной молекулы с «липкими» (т. е.
отжигающимися друг на друге) концами длиной 250 п.о.). Раствор выдерживали на слюде в течение 10 мин., после чего дважды промывали водой по 100 мкл и вновь сушили. Для дополнительного осушения образец помещали в эксикатор с Р2О5. На полученном изображении (рис. 2) наблюдаются кольцевые структуры. «Загрузка» поверхности (плотность иммобилизованных молекул) оказывается достаточной для наблюдения отдельных молекул. Поскольку образцы представляют собой фрагменты ДНК с «липкими» концами, то вполне объяснимым является образование этих кольцевых структур.
Рис. 2. АСМ-изображение фрагментов ДНК с «липкими» концами, иммобилизованных на слюде, модифицированной катионами Мп, полученное в полуконтактном режиме.
Исследование А,-ДНК
В этом случае на поверхность подложки наносили каплю иммобилизационного раствора, содержащего 2,5 мМ Мп804 и 1 нг/мкл молекул А,-ДНК,
представляющих собой длинные (ок. 48000 п.о.) последовательности нуклеотидов, затем высушивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Подложку не промывали водой. На полученном изображении (рис. 3) отчетливо наблюдаются нитевидные объекты и сетевидная структура, являющаяся результатом объединения отдельных нитей-молекул ДНК.
0 0,5 1,0 1,5 2,0 нт
Рис. 3. АСМ-изображение молекул А,-ДНК, иммобилизованных на слюде, модифицированной катионами Mn, полученное в полуконтактном режиме.
Заключение
В ходе исследования разработаны методики приготовления образцов для атомно-силовой микроскопии молекул ДНК, найдены оптимальные концентрации компонентов раствора-образца.
Получено АСМ-изображение фрагментов ДНК с «липкими» концами - наблюдаются кольцевые структуры, а также изображение А-ДНК - наблюдаются нитевидные и сетеподобные структуры. В результате удалось надежно закрепить молекулы ДНК на поверхности подложки.
Проведение подобных АСМ-исследований может дать вклад в понимание механизмов процесса осаждения молекул ДНК на слюдяную поверхность и взаимодействия с ней. Полученные результаты могут быть применены в нанобиотехнологиях (при создании ДНК-чипов), в наноэлектронике (при создании нанопроводов и т. д.).
ЛИТЕРАТУРА
1. Bustamante C., Vesenka J.,Tang C. L., Rees W., Guthod M. and Keller R. // Biochemistry, 1992. V. 31. Pp. 22-26.
2. Vesenka J., Guthod M., Tang C. L., Keller R., Delaine E. and Bustamante C. // Ultramicroscopy, 1992. V. 42-44. Pp. 12431249.
3. H. Hansma et al. // Nucleic Acids Res., 1992. V. 20. Pp. 35853590.
4. J. Hu, M. Wang, H.-U. G. Weier, P. Frantz, W. Kolbe, D. F. Ogletree and M. Salmeron. // Langmuir, 1996. V. 12. № 7. Pp. 1697-1700.
5. Галлямов М. О. Сканирующая зондовая микроскопия нуклеиновых кислот и тонких органических пленок: дис. ... канд. физ.-мат. наук, М.: МГУ, 1999. - 227 с.
Поступила в редакцию 27.11.2006 г. Поступила после доработки 26.06.2007 г.
