CC BY
58
УДК 53.087.22: 577.323
ОЦЕНКА КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПАРАМЕТРОВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ НА ПОВЕРХНОСТИ СЛЮДЫ
© Т. И. Шарипов1*, Р. Ф. Талипов1, Р. Р. Гарафутдинов2, Р. З. Бахтизин1
1 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 65 74.
2Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел.: +7 (347) 235 60 88.
E-mail: sha-t@yandex.ru
Представлены результаты исследования агрегации олигонуклеотидов различной длины на поверхности слюды. Получены АСМ-изображения единичных молекул ОДН разной длины. Форму молекулы моделировали конусом. Рассчитаны площади поверхностей конусов на АСМ-изображениях, построена градуировочная кривая, отражающая зависимость площади поверхности конуса от длины молекулы ОДН.
Ключевые слова: олигонуклеотиды (ОДН), слюда, иммобилизация, атомно-силовая микроскопия (АСМ), агрегаты.
Иммобилизация молекул нуклеиновых кислот на поверхности различных материалов находит все большее применение в научных исследованиях и в некоторых практических приложениях. В настоящее время бурно развивается технология ДНК-чипов, при создании которых одной из важнейших составляющих является закрепление ДНК или ее фрагментов - олигонуклеотидов (ОДН) - на поверхности [1-2]. В основу иммобилизации могут быть положены процессы как физисорбции (нековалентная фиксация) [3-6], так и хемисорбции (ковалентная фиксация) [7-10].
Удобным способом контроля иммобилизации нуклеиновых кислот на поверхности является применение атомно-силовой микроскопии (АСМ). Она позволяет исследовать топографию поверхности путем ее непосредственной визуализации с высоким разрешением [11-15]. В обзорной работе [8] представлены наиболее общие стратегии иммобилизации биомолекул перед их изучением методом АСМ. Как правило, для фиксации ДНК на поверхности слюды используют поливалентные катионы, которые опосредуют взаимодействие между отрицательно заряженной поверхностью и молекулами ДНК. В первую очередь это ионы переходных металлов четвертого периода. Однако, как показано в [10], возможно использование и моновалентных катионов металлов.
Особые достижения по визуализации коротких фрагментов ДНК представлены в [13]. Авторами показано, что с помощью АСМ можно визуализировать молекулы ДНК длиной порядка 25 нуклеотидов (нт). Такие одноцепочечные ДНК представляют собой глобулы, поскольку способны к внутримолекулярному взаимодействию оснований, особенно в присутствии двухзарядных катионов металлов.
Целью настоящей работы явилась разработка способа оценки количественного параметра иммобилизации олигонуклеотидов - степени их агрегации, в зависимости от условий фиксации на поверхности слюды.
Нами был использованы АСМ Solver P47 и зондовая нанолаборатория Ntegra-Prima для исследования олигонуклеотидов, иммобилизованных отдельно друг от друга или объединенных в агрегаты. Вначале была проверена воспроизводимость получаемых АСМ-изображений, то есть был проведен статистический анализ. Были приготовлены 10 образцов по одной методике. Иммобилизацион-ный раствор, содержащий 2 нг/мкл ДНК (ОДН длиной 93 нт) и MnCl2 (концентрация 50 мкМ) прогревали при 80 °С в течение 2 мин для денатурации возможных двуцепочечных структур и затем наносили на поверхность свежего скола слюды. Раствор выдерживали на слюде 4 мин, после чего подложку промывали водой (10x10 мкл). Для каждого образца получали по 10 АСМ-изображений. На полученных АСМ-изображениях наблюдались отдельные объекты различного размера, которые, вероятно, представляют собой как одиночные молекулы ОДН, так и их агрегаты. Были найдены высоты предполагаемых одиночных ОДН, а также вычислены средние арифметические значения высот. Согласно полученным данным, средняя высота объектов на поверхности слюды оказалась равной 0.58±0.12 нм.
В качестве дополнительного критерия оценки воспроизводимости была взята плотность расположения одиночных ОДН. Найдено, что плотность равна 13±2 шт/мкм2, то есть воспроизводимость получаемых АСМ-изображений относительно низка.
При иммобилизации молекул ОДН из раствора они располагаются на поверхности либо в одиночном состоянии, либо образуют агрегаты. Для оценки количества молекул в агрегате было сделано предположение, что площадь поверхности агрегата Sa должна зависеть от количества молекул в нем (от массы молекул) n. По одной и той же методике приготавливали образцы разных по длине ОДН и визуализировали с помощью АСМ. Далее находили предположительно одиночные ОДН и вычисляли их поверхностную площадь следующим образом.
* автор, ответственный за переписку
На АСМ-изображении одиночные ОДН - объекты круглой формы - моделировали правильными конусами высотой h, радиусом основания R и образующей L. Площадь боковой поверхности такого конуса Sb=nRL или, выражая L через h: Sb=nRV(h2+R2). Тогда, зная h и R, можно вычислить Sb. На АСМ-изображении высоту и радиус объектов квазикруглой формы можно вычислить, построив их профили, которые легко строятся с помощью встроенного пакета программ обработки изображений Image Analysis. Вычислив таким образом площади поверхностей конусов, моделирующих одиночные молекулы ОДН разной длины, на АСМ-изображениях, была построена градуировочная кривая (рис. 1), по которой можно определять массу агрегата, а соответственно, и количество молекул в нем.
На рис. 2 приведены примеры определения количества молекул в агрегате.
п
Рис. 1. Градуировочная кривая для определения количества молекул ОДН в агрегате.
h, нм 0.9
R, нм 25
Sb, нм 1963.771
60
б
h, нм R, нм Sb, нм2
1 27 2290.629
в г
Рис. 2. АСМ-изображения ОДН и соответствующие профили сечений.
а
На рис. 2а,в приведены АСМ-изображения поверхности слюды с иммобилизованными ОДН (длиной 20 нт), а на рис. 2б,г - соответствующие профили; здесь же приведены размеры и боковая площадь объектов. Зная площадь, по градуировочной кривой определяем размер агрегата. Для объекта 1 (рис. 2,б) она округленно равняется 60 нт, то есть данный агрегат состоит из трех молекул ОДН длиной 20 нт. Для сравнения на рис. 2в приведено то же самое АСМ-изображение, но линия уже проведена по другому объекту, профиль которой показан на рис. 2г. Для данного объекта (номер 2) находим, что он состоит их четырех 20-звенных ОДН.
С целью нахождения зависимости плотности одиночных ОДН от концентрации связующего катиона были проведены две серии экспериментов. Сначала была изучена зависимость плотности одиночных молекул ОДН р от их концентрации в им-мобилизационном растворе при неизменном соотношении количества фосфатных групп ОДН и катионов Мп2+ 1:1. Исследуемыми объектами служили ОДН длиной 20 нт.
С одн ’ нг/мкл
Рис. 3. Зависимость плотности одиночных молекул ОДН р от их концентрации в иммобилизационном растворе.
Обнаружено, что при увеличении концентрации молекул ОДН СОдН от 0 до 2 нг/мкл происходит резкое возрастание р (рис. 3). При концентрации ОДН, равной 2 нг/мкл, плотность одиночных молекул оказывается максимальной. Далее при увеличении концетрации от 2 до 10 нг/мкл наблюдается плавный спад кривой с постепенным установлением определенной неизменной величины плотности одиночно иммобилизованных молекул. Вероятно, возрастающий характер кривой объясняется тем, что при малых концентрациях молекулы ОДН не агрегируются и иммобилизуются отдельно друг от друга. Постепенное увеличение концентрации ОДН приводит к увеличению плотности одиночных молекул и агрегатов. При концентрации ОДН более 2 нг/мкл процесс агрегации начинает преобладать над процессом одиночной иммобилизации.
Была также изучена зависимость плотности одиночных молекул ОДН р от концентрации катионов Мп2+ в иммобилизационном растворе Смп2+, которая может быть описана функцией р=Г(СодН/СМпС12) (рис. 4)
При увеличении концентрации катионов Мп2+ в иммобилизационном растворе от 25 до 50 мкМ (при величине СОдН/СМпС12 от 0.013 до 0.0066) наблюдается возрастание плотности одиночных молекул ОДН, что, возможно, объясняется увеличением количества мест связывания между отрицательно заряженными молекулами ОДН и поверхностью слюды. При концентрации катионов Мп2+ свыше 50 мкМ (при величине СОдН/СМпС12 меньше
0.0066) процесс агрегации ОДН в растворе усиливается настолько, что плотность одиночных молекул ОДН, иммобилизующихся на поверхности, значительно уменьшается.
Содн/С
MnCl 2
Рис. 4. Зависимость плотности одиночных молекул ОДН, иммобилизованных на поверхности слюды, от концентрации катионов Mn2+.
Выводы
В работе исследована воспроизводимость получаемых АСМ-изображений с помощью измерения высоты и плотности одиночных ОДН, иммобилизуемых на подложке. Предложен способ построения градуировочной кривой зависимости площади поверхности конуса, моделирующего молекулу ОДН, от длины молекулы, а соответственно и массы. Приведены примеры определения количества молекул в агрегате. Исследована зависимость плотности одиночных ОДН на полученных АСМ-изображениях от концентрации компонентов им-мобилизационного раствора.
Результаты исследования могут внести вклад в понимание механизмов физисорбции молекул ДНК и их фрагментов разной длины на поверхности слюды и использоваться при дизайне ДНК-чипов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-03-970009-р_поволжье_а и грант № 10-02-00575-а).
ЛИТЕРАТУРА
1. Lemieux B., Aharoni A., Schena M. // Molecular Breeding. 1998. V. 4. P. 277-289.
2. Gabig M., Wegrzyn G. // Acta Biochimica Polonica. 2001. V. 48. №3. P. 615-622.
3. Higashi N., Inoue T., Niwa M. // Chem. Commun. 1997. P. 1507-1508.
4. Müller D. J ., Engel A., Amrein M. // Biosensors& Bioelectronics. 1997. V. 12. №8. P. 867-877.
5. Tanigawa M., Okada T. // Analytica Chimica Acta. 1998. V. 365. P. 19-25.
6. Lyubchenko U., Shlyakhtenko L. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. V. 94. P. 496-501.
7. Мирзабеков А. Д., Прокопенко Д. В., Чечеткин В. Р. // Информационные медико-биологические технологии. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. C. 166-198.
8. Wagner P. // FEBS Letters. 1998. V. 430. P. 112-115.
9. El Kirat K., Burton I., Dupres V., Dufrene Y. // Journal of Microscopy. 2005. V. 218. P. 199-207.
10. Hu J., Wang M., Weier H.-U. G., Frantz P., Kolbe W., Ogle-tree D. F., M. Salmeron // Langmuir. 1996. V. 12. №7. P. 1697-1700.
11. Vesenka J., Guthod M., Tang C.L., Keller R., Delaine E., Bustamante C. // Ultramicroscopy. 1992. V. 42-44. P. 1243-1249.
12. Hansma H. et al // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20. P. 3585-3590.
13. Hansma H., Revenko I., Kim K., Laney D. // Nucleic Acids Research. 1996. V. 24. №4. P. 713-720.
14. Миронов В. Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. Нижний Новгород, 2004. 110 с.
15. Ellis J. S., Abdelhady H. G., Allen S., Davies M. C., Roberts C. J., Tendler S. J. B., Williams P. M. // Journal of Microscopy. 2004. V. 215. P. 297-301.
Поступила в редакцию 28.10.2009 г.
