CC BY
50
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ... 75
УДК 616.155.392.11:577.115:615.2/.3
Л.Б. Хворостенко1, М.Н. Делиханова2, В А. Платицын2, О.И. Фролова2
ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ СЫВОРОТКИ И ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗАХ
1 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Тюменской области «Областная клиническая больница №1», Тюмень
2ГОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития, Центральная научноисследовательская лаборатория, Тюмень
Контактная информация:
Хворостенко Лев Борисович, врач-гематолог ГБУ ОКБ №1 адрес: 625023, г. Тюмень, ул. Котовского, 55; тел. +7(3452)28-7718 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 06.08.2011, принята к печати: 25.10.2011.
Резюме
В работе изучены элементы антиоксидантной защиты организма у пациентов с впервые выявленным острым лейкозом. Оценивается влияние исходного уровня биохимических показателей липидных ретинола, a-токоферола, церулоплазмина, активности глутатион^-трансферазы на результаты химиотерапии.
Ключевые слова: острый лейкоз, перекисное окисление липидов, антиоксидантная защита, ретинол, a-токоферол, церулоплазмин, глутатион^-трансфераза.
L.B. Khvorostenko1, M.N. Delikhanova2, V.A. Platitsyn2, O.I. Frolova2 FEATURES ANTIOXIDANTS PROFILE OF SERUM AND ERYTHROCYTES 1AT ACUTE LEUKEMIA
Clinical Hospital №1, Tumen
2State Medical Academy, Tumen
Abstract
This paper studies elements of antioxidant defense in patients with newly diagnosed acute leukemia. The influence the initial level biochemical values: retinol, a-tocopherol, ceruloplasmin, activity of glutathione-S-transferase on the results of chemotherapy.
Key words: acute leukemia, lipid peroxidation, antioxidant protection, retinol, a-tocopherol, ceruloplasmin, glu-tathione-S-transferase.
Введение
В связи с ростом онкологических заболеваний, проблема их лечения становится наиболее актуальной. Основным методом лечения онкогематоло-гических заболеваний, в частности ОЛ, является интенсивная полихимиотерапия. Однако, несмотря на высокий процент ремиссий после начальной терапии, часто бывает рецидив заболевания [8; 13; 15].
В последнее время появилось множество исследовательских работ, доказывающих мембранотоксическую активность опухолевых клеток, которая реализуется путем способности опухолевого субстрата «генерировать» активные формы кислорода, оказывающие цитотоксическое действие на окружающие ткани и проходящие через них клетки крови [6], а также подтверждающих активацию свободно-радикального окисления липидов при ОЛ [7; 16]. Основной точкой приложения нерегулируемой активации свободно-радикального окисления липидов являются фосфолипиды клеточных мембран [11].
Основными механизмами в метаболизме и распределении ксенобиотиков являются функционирование ферментов первой и второй фазы их биотрансформации. Фермент второй фазы глутатион-Б-транс-фераза класса Р участвует в процессах детоксикации широкого спектра электрофильных соединений, включая мутагены и канцерогены окружающей среды [14; 15]. Многие цитостатики, применяемые для лечения
острых лейкозов, такие как алкилирующие агенты, антрациклины, стероидные гормоны также являются субстратами глутатион-Б-трансфераз [9; 10]. Накопление свободных радикалов в высоких концентрациях приводит к повреждению мембран, окислению мембранных структур жизненно важных органов - печени, сердца, почек - в конечном итоге может развиться по-лиорганная недостаточность, ведущая к гибели пациента. Но природа предусмотрела защиту от свободнорадикального окисления, включающую неферментативные механизмы (витамины-антиоксиданты и др.) и ферментативные (внутриклеточные ферменты, например супероксиддисмутаза, и внеклеточные, к которым относится церулоплазмин [1; 2]).
Цель исследования. Изучить особенности антиоксидантного профиля сыворотки и эритроцитов на различных этапах химиотерапии ОЛ.
Материалы и методы
Протокол исследования включает проспективное (5 лет) с 2006 по 2011 гг. наблюдение 75 больных с момента верификации диагноза ОЛ и на дальнейших этапах терапии.
Комплексное обследование и проспективное наблюдение пациентов проводилось на базе гематологического отделения Тюменской областной клинической больницы. Возраст пациен-тов 18^77 лет (ср. 44,3 лет). Мужчин было 41 (54,67 %), женщин -34 (45,33 %).
76 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ...
Лабораторное исследование включало в себя: экстракцию липидов из крови (методом Фолча-Блура),
определение диеновых конъюгатов по-линенасыщенных жирных кислот (метод И. Д. Стальной, 1977), определение содержания шиффовых оснований (флуориметрический метод W.R. Bidlack,l959),
определение активности глутатион-s-трансферазы (Г-S-T) в эритроцитах (А.И. Карпищенко и др., 2002 г.), одновременное флюориметрическое определение витаминов А и Е в сыворотке/плазме крови (Р.Ч. Черняускене и др.,1984),
■ определение церулоплазмина в сыворотке крови иммунотурбидиметрическим методом (реактивы фирмы «SENTINEL», Италия).
Результаты и обсуждение
При исследовании фракционного состава липидного бислоя мембран эритроцитов больных ОЛ нами обнаружены выраженные изменения липидной архитектоники мембран. Как следует из представленных на рис. 1 данных, при манифестации ОЛ наблюдается резкое снижение пула общих осфолипидов мембран эритроцитов больных р<0,05). При достижении первичной ремиссии заболевания, во время проведения индукционной, консолидационной терапии, развитии рецидива и противорецидивной терапии сохраняется дефицит общих фосфолипидов (ФЛ).
Отмечается достоверное снижение концентрации общего холестерина (ХС) мембран эритроцитов больных ОЛ во время консолидационной терапии, а также увеличение концентрации общего ХС мембран эритроцитов пациентов с ОЛ во время рецидива заболевания и противореци-дивной терапии.
Полученные данные в период рецидива заболевания и противорецидивной терапии свидетельствуют о снижении механизмов эстерифика-ции ХС, направленных в норме на выведение из мембранных структур избытков ХС и сохранение агрегатных свойств липидного бислоя клеточных мембран в связи с дефицитом мембранных фосфолипидов [3].
Увеличение концентрации ХС в липидном бислое клеточных мембран можно рассматривать как компенсаторную реакцию, направленную на поддержание стабильности липидного матрикса в условиях дефицита фосфолипидов [11].
Однако обогащение мембран эритроцитов ХС ведет к значительному возрастанию ригидности клеточных мембран, ухудшая основные параметры клеток, в частности кислородно-транспортную функцию красных клеток крови, их деформируемость, а, следовательно, и реологические свойства крови, а также функциональную активность имму-нокомпетентных клеток.
Данный факт демонстрирует компенсаторное увеличение концентрации ХС в липидном бислое мембран эритроцитов, направленное на поддержание стабильности липидного матрикса в условиях глубокого дефицита мембранных фосфолипидов.
Общие ФЛ и ХС в эритроцитах
4.5 4
3.5
3
л
-3 2,5
ьл
І 2 s 1,5 1
0,5
0
□ общие ФЛ
□ общий ХС
контроль до ХТ индукция ремиссия консолидация рецидив ХТ рецидива *достоверность различий с контролем (р<0,05);
**достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).
Рис. 1. Липидный спектр мембран эритроцитов ОЛ в различные периоды заболевания.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ... 77
Таким образом, у пациентов с ОЛ во все периоды заболевания регистрируются мембранодеструктивные изменения эритроцита, более выраженные в периоды рецидивов и противорецидивной терапии. Определение активности процессов перок-сидации липидов, антиоксидантной системы и структурных параметров клеточных мембран проведено также на модели эритроцитов [4]. Как следует из приведенных на рис. 2 данных, в мембранах эритроцитов больных ОЛ в период верификации диагноза отмечается высокий, значительно превышающий показатели здоровых лиц (р<0,05), уровень концентрации первичных продуктов ПОЛ -ДК, обладающих наибольшими высокотоксичными свойствами в плане повреждения внутриклеточных органелл, мембранных ли-попротеидов, белков, ферментов трансмембранного транспорта [5; 12]. В период достижения первичной ремиссии ОЛ во время индукционной, консолидаци-онной терапии, рецидиве заболевания и противореци-дивной терапии отмечается сохранение достоверно высоких показателей токсичных диеновых конъю-гат(p<0,05). Также достоверно увеличивается элиминация почками диеновых конъюгат (р<0,05) с постепенным снижением этой способности. Уровень конечных продуктов липопероксидации липидов - ШО у больных ОЛ во все периоды заболевания достоверно выше показателей контрольной группы (р<0,05), что видно на рис. 3. Образования Шиффа - конечные продукты пероксидации липидов занимают особое место в процессах ПОЛ. С одной стороны, непрерывное накопление в мембранных структурах ШО, представляющих собой необратимые «сшивки» диальдегидов со свободными аминогруппами мембранных белков, характеризует стадию дегенеративных изменений клеток. С другой, высокий уровень ШО можно рассматривать как адаптивный процесс, направленный на элиминацию из клеток более токсичных метаболитов ПОЛ - ДК и МДА [4]. В период консолида-ционной терапии ОЛ отмечается увеличение деструктивных процессов мембран эритроцитов, подтверждаемое достоверно высоким уровнем ШО, который достоверно выше показателей группы с первичной ремиссией (р<0,05). Во время проведения противоре-цидивной терапии деструктивные процессы наиболее выражены.
Элиминация с мочой конечных продуктов пероксидации липидов - оснований Шиффа - у больных ОЛ во все периоды достоверно выше аналогичных показателей контрольной группы
(р<0,05).
В период консолидационной терапии, рецидива заболевания ОЛ отмечается увеличение элиминации конечных продуктов пероксидации липидов мембран эритроцитов, подтверждаемое высоким уровнем ШО в моче, который достоверно выше показателей группы с первичной ремиссией (р<0,05) с незначительным снижением в период терапии рецидива заболевания.
Полученные данные свидетельствуют, что у больных ОЛ наблюдается увеличение активности процессов липопероксидации мембранных липидов с наибольшей выраженностью в период рецидива ОЛ.
В сыворотке крови больных ОЛ обнаружено статистически значимое снижение уровня антиоксидантов ретинола и а-ТФ по сравнению с показателями контрольной (р<0,05) группы (рис. 4).
Снижение уровня антиоксидантов было во все периоды течения ОЛ. Выявлена достоверная недостаточность уровня ферментативной АОЗ в сыворотке крови больных ОЛ в различные периоды заболевания за счет статистически достоверного снижения уровня церулоплазмина по сравнению (р<0,05)с показателями контрольной группы (рис. 5). Наибольшее снижение концентрации церулоплазмина в сыворотке наблюдалось у пациентов в период рецидива заболевания, которое достоверно ниже по отношению к пациентам с первичной ремиссией (р<0,05).
В тоже время отмечается напряженность работы ферментативной АОЗ за счет статистически достоверного увеличения уровня активности Г-Б-Т по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,05), которая достигает пика активности в период индукционной терапии.
Статистически достоверные изменения уровня активности Г-Б-Т (р<0,05) у больных с первичной ремиссией наблюдались в группах пациентов в период верификации диагноза и консолида-ционной терапии.
*достоверность различий с контролем (р<0,05);
**достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).
Рис. 2. Содержание начальных продуктов пероксидации липидов в мембранах эритроцитов и моче больных ОЛ в различные периоды заболевания.
78 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ...
ШО в эритроцитах и моче
100
90
80
70
60
м 50
ч с 40
у
30
20
10
0
□ ШО эритроциты
□ ШО моча
контроль до ХТ индукция ремиссия консолидация рецидив ХТ рецидива *достоверность различий с контролем (р<0,05);
**достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).
Рис. 3. Содержание конечных продуктов пероксидации липидов в мембранах эритроцитов и моче больных ОЛ в различные периоды заболевания.
25 20 ч 15
е
о
110
а
5
0
5 - Токоферол в плазме
і
* **
і
контроль до ХТ индукция ремиссияконсолидациярецидив ХТ рецидива
2
1,8
1,6
1,4
«1,2
"й
4 1
о 1
І0,8
*0,6
0,4
0,2
0
і
Ретинол в плазме
* **
¥
контроль до ХТ индукция ремиссия консолидация рецидив ХТ рецидива
*
*'*
достоверность различий с контролем (р<0,05); достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).
Рис. 4. Содержание жирорастворимых витаминов-антиоксидантов в сыворотке крови больных ОЛ в различные периоды заболевания.
* жж
* * *
Ж
*
*
*
Ж
*
*
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОГО ПРОФИЛЯ... 79
1200
1000
800
600
400
200
Глутатион-Э-трансфераза эритроцитов
контроль до ХТ индукция ремиссия консолидация
* достоверность различий с контролем (р<0,05);
**
рецидив ХТ рецидива
достоверность различий по отношению к больным с первичной ремиссией (р<0,05).
Рис. 5. Ферментативный антиоксидантный профиль сыворотки крови и эритроцитов у больных ОЛ в различные периоды заболевания.
0
Заключение
В разные периоды течения ОЛ можно констатировать наличие глубоких изменений липидной архитектоники мембран эритроцитов, проявляющихся дефицитом общих фосфолипидов в условиях нерегулируемой интенсификации процессов перок-сидации липидов. У больных наблюдается достоверно избыточное накопление первичных продуктов липопероксидации мембранных липидов - дие-
новых конъюгат - на всех этапах с наибольшей выраженностью в период консалидационной терапии ОЛ и постепенным снижением компенсаторных механизмов элиминации. При развитии рецидива заболевания наблюдается наиболее выраженное снижение активности ферментативного антиоксидантного профиля сыворотки и эритроцитов на фоне сохраняющегося глубокого некомпенсированного дефицита неферментативного звена анти-оксидантной защиты.
Литература
1. Бердинских Н.К., Курищук К.В, Лянюшко Н.М. и др. Церулоплазмин: вид биотехнологии до клинич-ного применения. - К., 2006. - 175 с.
2. ВолковаМА. Клиническая онкогематология. - М.: Медицина, 2001. - 571 с.
3. Грацианский НА. Холестерин и здоровье. - Тюмень, 1995. - 68 с.
4. Жмуров ВА., Крылов В.И., Кашуба ЭА., Чимаров В.М. Нефропатии (аспекты мембранологии). -Тюмень, 1993. - 360 с.
5. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шергин С.И. Окислительный стресс // Диагностика, терапия, профилактика. РАМН, Сиб. отд., Новосибирск, 1993. - 181 с.
6. Киселев ФЛ, Павлиш О А, Татосян О.Г. Молекулярные основы канцерогенеза у человека. - М., 1990. - 316 с.
7. Лосева МИ, Поспелова Т.И. Печень при гемобластозах: научное издание. - Новосибирск: НМИ, 1999. - 414 с.
8. Поддубная И.В, Хасанов РШ.., Ручкин В.Н. Открытое несравнительное исследование гикамтина в качестве терапии 2 линии при раке яичников. Лечение рецидивов рака яичников гикамтином - опыт российских регионов (предварительная оценка непосредственных результатов) // Современная Онкология. - 2001. - Т. 3, № 1. - С. 36-8.
9. Ставровская А А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Биохимия. - 2000. - Т. 65, Вып. 1. - С. 112-26.
10. Ставровская А А. Резистентность больных гемобластозами к лекарственной терапии: молекулярные механизмы и проблемы преодоления множественной лекарственной устойчивости. В кн.: Клиническая онкогематология, издание второе. М. А. Волкова (ред.). - М.: Медицина, 2007. - С. 246-56.
11. Сторожок НМ. О роли и механизме действия фосфолипидов в процессе окисления природных систем, содержащих антиоксиданты // Вопросы питания. - 1996. - 2. - С. 25-8.
12. BeartlingCJ. Role of hydrogen peroxide in the cytotoxic effects of UV-A/B radiation on mammalian cell // Photochem. Photobiol. - 1996. - 64 (l). - P. 137-42.
13. RobakTadeusz. Second malignancies and Richter's syndrome in patients with chronic lymphocytic leukemia // Hematology. - 2004. - 9(5-6). - P. 387-400.
14. SalinasA.E., WongM.G. Glutathione S-transferases-a review//Curr. Med. Chem. - 1999. - 6. - P. 279-309.
15. Thomas I.T., Coley H.M. Overcoming multidrug resistance in cancer: an update on the clinical strategy of inhibiting P-glycoprotein // Cancer Control. - 2003. - 10. - P. 159-65.
16. WagnerB.A., Buettner G.R, Burns C.P. Vitamin E slows the rate of free radical-mediated lipid peroxidation in cells // Arch Biochem Biophys. - 1996. - 334(2). - P. 261-7.
