CC BY
19
4. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Колос, 1990. - 283 с.
5. Ромейс Б. Микроскопическая техника. - М.: Изд-во иностр. литер., 1954. - 718 с.
6. Chiarugi A. Embriologia delle Cistaceae // Nuovo Giorn. Bot. Ital., nuova ser. -1925. - Vol. 32. - P. 223-316.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.
ОСОБЛИВОСТ1 АНДРОГЕНЕЗУ В КУЛЬТУР1 IN VITRO Р1ЗНИХ ВИД1В
СОНЯШНИКУ
Т. В. ЧИГРИН; О. А. ЗАДОРОЖНА, кандидат б1олог1чних наук;
Л. Л. ЮШК1НА, О. Г. СУПРУН 1нститут рослинництва ím. В. Я. Юр'ева, Харюв
Вступ
Створення подвоених гапловдв - важливий сучасний метод бютехнологл, що дозволяе прискорювати селекцiйний процес завдяки подвоенню гаметоф^но'1 кiлькостi хромосом бажаного генотипу. Дослщження в цьому напрямi проводяться ще з 60-х рокiв ХХ сторiччя. Отримували як спонтаннi подвоеш гаплощи, так i iндукованi при створенш певних експериментальних умов. Найпоширешшою технiкою отримання подвоених гапловдв е метод шдукцп андрогенезу шляхом культивування iзольованих пилякiв. Цей метод устшно застосовуеться для ячменю [1, 13], пшенищ та тритикале [3, 14], кукурудзи [8-10, 16], ршаку, прчищ [12], льону [11, 18], цукрового буряку [6, 7], овочевих [4] та шших культур.
Фактично за останш 30 роюв культуру пиляюв спробували майже для всiх сшьськогосподарських культур. Створенню подвоених гапловдв соняшнику присвяченi окремi роботи [15, 20]. Описано андрогенез in vitro для таких видiв соняшнику, як Helianthus annuus L., H. occidenthalis Riddell., H.decapetalus L., H.tuberosus L. та мiжвидових гiбридiв H. annuus х H. occidenthalis, H. annuus х H.tuberosus. Визначено значний ефект генотипу на здатшсть до шдукцп калюсогенезу та новоутворень [20].
Враховуючи перспектившсть використання диких видiв соняшнику при схрещуванш з культурними та важливу роль методу створення подвоених гапловдв у прискореннi селекцiйного процесу, метою нашо'1 роботи було визначити особливосп андрогенезу лiнiй культурного соняшнику та рiзних видiв дикого соняшнику для встановлення 1'х здатностi до андрогенезу та подальшого застосування для створення подвоених гапловдв.
Об'екти та методи дослщжень
Матерiалом для дослiджень були лшп культурного соняшнику (H. annuus L.) селекцп 1нституту рослинництва ím. В. Я. Юр'ева: Х114В, Х526В, Х711В, Х720В, Х762В — вщновники фертильносп пилку та дию диплощш види соняшнику (2n=34): H. divaricatus L., H. giganteus L., H. microcephalus Torrey & Gray, H. nuttallii Torrey & Gray, H. decapetalus L. Рослини вирощували в польових умовах на територп науково'1 сiвозмiни 1нституту рослинництва ím. В. Я. Юр'ева (Харювська обл.) в 2010 рощ.
Для отримання пиляюв використовували кошики культурного соняшнику дiаметром приблизно 5,5 см та вищезазначених диких видiв дiаметром 0,7-0,9 см, що вщповщало наявностi стадii одноядерних вакуолiзованих мiкроспор. Фазу розвитку пилку визначали пiд свiтловим мiкроскопом iз використанням цитологiчних методiв на тимчасових препаратах, забарвлених ацетокармшом [5]. В подальшому кошики або ix
фрагменти (для культурних лшш) тддавались поверхневш обробщ детергентом, потсм 96% етанолом (Артемiвський спиртзавод, Украша) (30 с), 50% розчином комерцшного засобу "Доместос" (ООО Юншевер СНГ, Росiя), що мютив гiпохлорит (20 хв.). Чотири рази промивали дистильованою водою. Пиляки, що були на вщповщнш стади, iзолювали з квiток пiд бiнокуляром (МБС-10, "Рубин", СРСР) в асептичних умовах ламшар-боксу (КПГ-1М, СРСР), розмiщували в пробiрках на iндукцiйному поживному середовищг Основу iндукцiйного поживного середовища складали макро- i мiкросолi, вiтамiни середовища Murashige & Skoog (MS) [17]. Пиляки у кшькосп 150 шт. на один зразок виавали на чотири шдукцшш поживнi середовища. В середовище 1 додавали 250 мг/л гiдролiзату казешу (ОХФЗ, Латвiя); 1,0 мг/л НОК (SERVA, Кмеччина); 2 мг/л 2,4-Д (SERVA, Нiмеччина); 0,5 мг/л БАП (SERVA, Нiмеччина); в середовище 2 додавали 0,1 мг/л НОК; 0,2 мг/л БАП. В середовище 3 додавали 500 мг/л гiдролiзату казешу, 2 мг/л НОК; 1,0 мг/л БАП; в середовище 4 - 0,1 мг/л НОК; 0,5 мг/л БАП. В ус середовища додавали 30 г/л цукрози; в середовища 1-3 - 8 г/л агару, в середовище 4 - 6 г/л агару.
Культивування проводили у темрявi за температури +24°С протягом 7 дiб. Пюля цього пробiрки з новоутвореннями переносили в юмнати зi штучним Шматом i продовжували культивувати за температури +24оС +2°С, 16-годинного св^лового перюду та осв^лення 3000 лк. Частоту формування новоутворень визначали шляхом пщрахунку кiлькостi пилякiв з новоутвореннями у вщношенш до загально'1 кiлькостi введених в умови in vitro пиляюв та виражали у вщсотках.
Через 28 дiб з моменту введення в умови in vitro пиляки зi сформованими на ix поверxнi макроструктурами з центром регенерацп були перенесет на регенерацшне середовище, до складу якого входили компонента середовища MS з додаванням 100 мг/л гiдролiзату казешу та регуляторiв росту (0,5 мг/л БАП; 0,5 мг/л кшетин).
Кшьюсть хромосом тдраховували стандартним методом [4] у рослин-регенерашив на тимчасових давлених препаратах листочюв. Пiсля культивування протягом 30 дiб регенеранти переносили на новi середовища з додаванням 3 мг/л НОК.
Аналiз показниюв калюсо- та морфогенезу проводили за допомогою методiв варiацiйноi статистики [2].
Результати та обговорення
За результатами проведених дослiджень встановлено, що при культивуванш пилякiв соняшнику на iндукцiйниx поживних середовищах спостер^али рiзну частоту новоутвореннь. Ця частота вiдрiзнялась у рiзниx генотипiв соняшнику на рiзниx середовищах культивування (табл.).
Таблиця
Формування новоутворень з мжроспор р1зних генотип1в соняшнику на 4-х
середовищах культивування
Назва зразка Частота формування новоутворень на вщповщному середовищ^ %
середовище 1 середовище 2 середовище 3 середовище 4
Х114В 95,3+1,7 10+2,5 94,7+1,8 7+2,5
Х526В 8,7+2,3 20,7+3,3 42,7+4,0 15,3+2,9
Х711В 48,7+4,1 10+2,5 78+3,4 16,0+3,0
Х720В 48,7+4,1 12,0+2,7 27,3+3,6 7,3+2,1
Х762В 89,3+2,5 5,0+1,5 46+4,0 9,3+2,4
H.divaricatus 31,3+3,8 2,7+1,3 30+3,7 22,6+3,4
H.decapetalus 17,0+3,8 2,0+1,4 5+2,2 0
H.giganteus 27,0+4,4 6,0+1,9 9,3+2,4 11,3+2,6
H.microcephalus 2,7+1,3 0 1,3+0,9 -
H.nuttallii 18,7+3,2 18+3,1 2,7+1,3 6+1,9
На пиляках формувалась калюсна бюмаса з окремими щшьними утвореннями (рис. 1). Серед лшш культурного соняшнику спостер^али бшьшу залежшсть частоти новоутворень вiд генотипу (Б=7,42/Ркр=3,49), нiж вiд середовища культивування (Б=1,21/Ркр=3,26).
а б
Рис. 1. Новоутворення з мжроспор на середовищ1 3 лшн Х762В (а)
та Н. giganteus (б)
У диких видiв залежнiсть вiд генотипу та вщ середовища культивування майже не вiдрiзняeться i мае мiсце тенденщя бiльшого впливу середовища культивування (Б=4,38/Ркр=3,26), нiж генотипу (F=3,37/Fкp=3,49). Такий розбщ можливо, пов'язаний зi слабшим вщгуком на умови андрогенезу диких видiв, нiж лiнiй культурного соняшнику (рис. 2). Так, частота формування новоутворень мшроспор лшш культурного соняшнику без урахування середовища культивування знаходилась в середньому в межах 22-56%.
Рис. 2. Частота формування новоутворень з мжроспор при культивуванш in vitro
Частота формування новоутворень диких видiв перебувала в межах вщ 0% до 22%. За данними шших дослщниюв, велико! розбiжностi мiж культурними лшями Н. аппит та дикими видами Н. оеЫёеМа^, Н. decapеtalus, Н. tuberosus за частотою андрогенезу не спостер^али [8]. Можливо, це пов'язано з тим, що дослщники використовували iншi види або бютипи соняшнику, в яких дослщжували андрогенез.
Нами вивчена також здатшсть до андрогенезу на рiзних шдукцшних
середовищах культивування окремо для диких видiв Н. ЛуапеМш, Н. giganteus, Н. т№госерка1т, Н. пиШПп, Н. decapеtalus, та для лшш культурного соняшнику Н. аппиш (Х114В, Х526В, Х711В, Х720В, Х762В) (рис. 3). Висок показники частоти новоутворень спостершали у лшш культурного соняшнику на середовищах 1 i 3, що перевищували цей показник на решт середовищ бшьш шж на 40%. Частота формування новоутворень у диких видiв в залежносп вщ середовища коливалася в межах 10%. Це бшьше шж переконливо свiдчить про нижчу чутливють диких видiв соняшнику до використаних поживних середовищ культивування.
Рис. 3. Частота формування новоутворень на р1зних поживних середовищах
На регенерацшному середовищi центри регенерацп зафiксованi для лшп культурного соняшнику Х711В, диких видiв соняшнику Н. тттосерка1т та Н. decapеtalus. Найбшьшу кшькють регенерантiв дали пиляки Н. giganteus (рис. 4а). У решти зразюв на регенерацiйному середовищi спостерiгали калюси рiзного ступеня щшьносп. При подальшому культивуваннi рослини-регенеранти вдалось одержати лише у Н. giganteus (рис. 4б) та Н. decapеtalus.Ризогенез спостершали тшьки у H.giganteus Ь. (рис.4 в) та Н. decapеtalus.
а б в
Рис. 4. Регенеращя новоутворень соняшнику (а-в): а - формування пагошв; б - рост пагошв; в - ризогенез у пагона
В отриманих пагошв проведено цитолопчний аналiз. На проаналiзованих препаратах не знайдено метафазних пластинок, де кшьюсть хромосом дорiвнювала б 34 (для диплощного соняшнику 2n=34). З метою диплощизацп отриманi пагони пiддавались колхщинуванню шляхом обробки 0,2% розчином колхщину в умовах вакууму («SPT200 Horizont», Польща). Рослини пiсля обробки помютили в умови штучного клiмату, де вони продовжили вегетащю.
Висновки
Таким чином, результати проведених дослщжень свщчать про р1зну андрогенну здатшсть представниюв рiзних видiв соняшнику. Вирiшальне значення на формування новоутворень мав вплив генотипу соняшнику. Серед вивчених лшш культурного соняшнику та диких видiв соняшнику найвища здатшсть до утворення гаплощних регенеранпв була у H. giganteus.
Список лггератури
1. Бшинська О.В. Застосування кукурудзяних крохмалiв з тдвищеним вмiстом амiлози (мутацп ae i su2) у складi штучного живильного середовища для одержання гапловдв ярого ячменю у культурi пиляюв in vitro // Вiсник Харювського Нацiонального унiверситету. Cерiя бiологiя. - 2010. - Вип.11 (№ 905). - C. 60-66.
2. Вольф В.Г. Статистическая обработка опытных данных. - М.: Колос, 1966. -
255 с.
3. Игнатова С.А. Биотехнологические основы получения гаплоидов, отдаленных гибридов и соматических регенерантов зерновых и бобовых культур в различных системах in vitro: Дис. ... д-ра биол. наук: 03.00.20 / УААН; Южный биотехнологический центр в растениеводстве. - Одеса, 2004. - 435 с.
4. Гапловдя овочевих видiв рослин in vitro / Кондратенко С.1., Серпенко О.Ф., Гончарова С.А., Баштан Н.О. / Досягнення i проблеми генетики, селекцп та бютехнологл: Зб. наук. пр. - Укр. т-во генетиюв i селекцiонерiв iм. М.1. Вавшова. -2007. - Т. 2. - С. 508-512.
5. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.
6. Рош М.В. Значення генетичних ресурав рослин для сшьського господарства Украши // Тези доповщей мiжнар. наук.-практ. конф. - Оброшено, 2005. - С. 3-5.
7. Рябовол Л.О. Разработка способов получения гаплоидов и дигаплоидов сахарной свеклы как исходного материала для селекционного процесса: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. - К., 1994. - 24 с.
8. Сатарова Т.Н., Пиралов Г.Р., Дзюбецкий Г.Р. Ускорение селекционного процесса кукурузы с помощью метода эмбриокультуры // Вестник аграрной науки. -1993. - № 8. - С. 50-53.
9. Сатарова Т. М. Андрогенез та ембрюкультура у кукурудзи in vitro: Автореф. дис. ... д-ра бюл. наук: 03.00.20 / НАН Украши; 1нститут кл^инно'1' бюлогл та генетично'1' шженерп. - К., 2002. - 41 с.
10. Оптимизация процесса диплоидизации гаплоидов кукурузы при ускоренном получении гомозиготных линий / Черчель В.Ю., Сатарова Т.Н., Мельничук О.С., Гарькавая Е.Н. / Селекщя i насшництво. - 2009. - Вип. 97. - C. 52-62.
11. Получение удвоенных гаплоидов у льна масличного через культуру пыльников (Методические указания) / Сорока А.И. - Запорожье: Институт масличных культур УААН, 2007. - 26 с.
12. Babbar S.B., Agarwa A.K. Sahay Sh. Isolated microspore culture of Brassica: An experimental tool for development studies and crop improvement // Indian Journal of Biotechnology. - 2004. - Vol. 3, № 4. - P. 185-202.
13. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Z. Pflanzenzucht. -1973. - Bd. 69. - P. 142-155 .
14. Dogramaci-Altuntepe M., Peterson T.S., Jauhar P.P. Anther culture-derived regenerants of durum wheat and their сую^юя! characterization // The American Genetic Association. - 2001. - Vol. 92, № 1. - P. 56-64.
15. Anther culture in Helianthus annuus L., influence of genotype and culture conditions on embryo induction and plant regeneration / Thengane S.R., Joshi M.S.,
Khuspe S.S. et al. / Plant Cell Rep. - 1994. - Vol. 13. - P. 222-226.
16. Hassawi D.S., Liang G.H. Effect of cultivar, microspore development of anther culture of wheat and Triticale // Plant Breeding. - 1990. - Vol. 105, № 3. - P. 332-336.
17. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - P. 473-497.
18. Kurt O., Evanth G.M. Anther Culture Potential of Linseed (Linum usitissimum L.): Effects of Genotypes and Pretreatment on Callus Formation and Differentiation // J.of Agriculture and Forestry. - 1998. - Vol. 22. - P. 553-560.
19. Genotype variation of quantitative trait loci controlling in vitro androgenesis in maize / Murigneux A., Bentolila S., Hardy T. et al. / Genome. - 1994. - Vol. 37, № 3. - P. 970-976.
20. Androgenetic response of sunflower in diferent culture environments / Vijaya Priya K., Sassikumar D., Sudhagar R. et al. / Helia. - 2003. - Vol. 26, № 38. - P. 39-50.
Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
ИЗМЕНЧИВОСТЬ ХРОМОСОМНЫХ ЧИСЕЛ ХВОЙНЫХ ПРИ ИХ ИНТРОДУКЦИИ И СЕЛЕКЦИИ
Т.С. СЕДЕЛЬНИКОВА, доктор биологических наук;
А.В. ПИМЕНОВ, кандидат биологических наук Учреждение Российской академии наук Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского
отделения РАН, г. Красноярск, Россия
Введение
Представители класса хвойные (Coniferopsida), включающего около 600 видов, широко распространены по всему земному шару и являются основными лесообразователями умеренной зоны северного и южного полушарий. Насаждения хвойных, наряду с их хозяйственной ценностью, имеют высокое оздоровительное и эстетическое значение, при этом многие виды отличаются декоративностью и успешно интродуцируются в различных географических регионах, далеких от естественных ареалов. Определение числа хромосом как одного из диагностических признаков вида представляет значительный интерес не только для решения вопросов систематики и эволюции хвойных, но также и для разработки научных основ их селекции и интродукции. Большинство представителей данной группы растений отличаются постоянством числа хромосом и стабильностью кариотипа. Однако в последнее время появляются данные о том, что среди отдельных видов, разновидностей и форм хвойных встречаются растения с нарушениями числа хромосом [10, 11]. В настоящем сообщении впервые обобщены результаты изучения хромосомных чисел хвойных при их интродукции и селекции в дендрариях, парках и лесных опытных хозяйствах.
Материалы и методы
Семенной материал для исследований собирался с деревьев, произрастающих в различных районах России, Чехии, Болгарии, Киргизии и Франции. Подсчет хромосомных чисел осуществлялся в метафазных клетках меристематических тканей кончиков корней. Семена проращивали в чашках Петри, проростки длиной 0,5-1,0 см обрабатывали 1% р-ром колхицина в течение 4-6 часов, затем фиксировали спиртово-
