CC BY
165
к; Основные процессы пивоварения
Продолжение. Начало см. «Пиво и напитки» 1997-2002 гг.
Получение пива с применением иммобилизованных дрожжей
1Г.А. Ермолаева
Московский государственный университет пищевых производств
В настоящее время в пивоварении вновь появляется интерес к сбраживанию пивного сусла иммобилизованными дрожжами. В мире начали действовать промышленные установки. Эта публикация и последующие посвящены этому вопросу.
Пивоварение — старый биотехнологический и консервативный технологический процесс. Консерватизм производства можно объяснить стремлением к получению пива старинных сортов с соблюдением традиционных технологических приемов. Но в последние годы широко стали внедряться новые технологии, позволяющие интенсифицировать производственные процессы, и в первую очередь наиболее продолжительные — брожения и дображивания.
Традиционное главное брожение, протекающее в присутствии всей массы дрожжей, определяется сортом получаемого пива. При брожении и доб-раживании происходят сложные биохимические процессы, связанные с жизнедеятельностью дрожжей, их обменом веществ, а также с химическими превращениями, протекающими в пиве под влиянием внешних условий (температура, рН, концентрация различных органических веществ). Процесс брожения происходит под действием ферментов пивных дрожжей, расщепляющих основное количество углеводов сусла с образованием этилового спирта, диоксида углерода и продуктов конститутивного обмена. Чем выше плотность начального сусла (от 8 % до 23 % сухих веществ), тем дольше идет брожение. По классической технологии главное брожение продолжается от 6 до 9-10 сут. Затем молодое пиво с содержанием этилового спирта в зависимости от сорта (0,5-9 %) снимают с дрожжей и направляют на дображивание, длительность которого может быть до 90 дней.
Поэтому на протяжении десятилетий пивовары стремились сократить наиболее продолжительную часть технологического процесса.
Тенденция к ускорению процесса брожения привела к разработке новых методов сбраживания пивного сусла —
непрерывных, периодических в аппаратах большой вместимости — цилиндро-конических бродильных аппаратах (ЦКБА), сбраживанию иммобилизованными (закрепленными) дрожжами. Они основывались на использовании повышенной температуры брожения, увеличении нормы засевных дрожжей, применении мероприятий по достижению высокой бродильной активности дрожжей.
Около 100 лет назад были попытки применить непрерывное брожение, а с начала 70-х гг. — использовать иммобилизованные дрожжи в пивоварении.
Впервые принцип иммобилизации микроорганизмов был реализован в производстве уксуса более 100 лет назад, наибольшего развития исследования и методы реализации достигли в 70-80 гг. [5].
Адсорбированные дрожжевые клетки для непрерывного брожения были испытаны в 1899 г. Барбетом. В 50-60-е гг. непрерывное брожение было предметом многочисленных исследований. Но в основном они осуществлялись с интактны-ми (свободными) клетками. Иммобилизация казалась решением всех проблем. В 1971 г. Нарцисс и Хеллих и в 1973 г. Бейкер и Кирсоп применили, как первый шаг к иммобилизации, смесь дрожжей и кизельгура.
Практически одновременно стали проводиться исследования по применению иммобилизованных дрожжей для периодического и непрерывного брожения.
Периодическое брожение пива иммобилизованными клетками исследовали А.П. Колпакчи и др. на полиэтиленовой пленке (1976 г.) и керамических или полиэтиленовых кольцах (1980), на альгинатах Вайт и Портно (1978), геле альгината Парандова и др. (1982), Шиндо и др. (1990) на пористом ПВА (1990 г.) [4, 6].
Непрерывное брожение исследовали с помощью дрожжей, иммобилизованных на ПВХ и пористых частицах (Крье, Наварро, 1976 г.), диатомите, ПВХ и пластмассе (Молл, 1977), альгинате кальция (Годфредсен и др., 1981, Линко и др., 1981 г.).
Интенсивное развитие биотехнологии в этот период было обусловлено созданием нового типа биокатализаторов — иммобилизованных клеток микроорганизмов. Микроорганизмы, прикрепленные к основе, называют иммобилизованными (связанными, пришитыми, фиксированными, матрицированными). Иммобилизованными считаются клетки, которые физически связаны или локализованы в определенном месте или пространстве с сохранением их каталитической активности, если возможно или необходимо, — их жизнеспособностью, которые могут быть использованы повторно или непрерывно ^о^а и др., 1987). Использование иммобилизованных дрожжей позволяет легко управлять биокатализом во время брожения и конструировать биореакторы типа плотно набитой колонны, которая удобна для ведения процесса непрерывным способом [3]. В этом направлении развивались и дальнейшие исследования (о результатах которых будут публикации в дальнейшем).
С технологической точки зрения иммобилизация клеток микроорганизмов на твердом носителе создает высокоактивную полиферментную систему для получения разнообразных продуктов, являющихся результатом метаболизма дрожжевой клетки. Преимущество иммобилизации — создание фактора микросреды, которая образовалась вокруг частиц дрожжей с участием нерастворимого носителя. Эта микросреда содержит гидрофобные заряженные частицы, имеющие большое значение в концентрировании питательных веществ.
Иммобилизация на твердом носителе изменяет жизнедеятельность микробной клетки и интенсивность биохимических процессов микроорганизмов. Многократное их использование в биосинтезе различных веществ дает значительный экономический эффект. В производственных условиях расход сырья для генерации биомассы снижается.
Использование иммобилизованных клеток дрожжей для интенсификации процесса обусловлено разными факторами: создается клеточная масса в единице объема реактора, значительно большая, чем при периодическом и непрерывном процессах с использованием интактных клеток; в результате значительно увеличивается выход пива; удлиняется срок действия ферментов клетки; ускоряется процесс ввиду лучших условий транспорта питательных веществ к клетке и связанным с этим улучшением метаболизма. Применение иммобилизованных систем сохраняет и поддерживает определенный ритм роста дрожжевых клеток и соответству-
ПИВО " НАПИТКИ
4•2003
8
ющую ему скорость разбавления. Поэтому исключается необходимость удаления биомассы микроорганизмов после каждого производственного цикла. Дрожжи при иммобилизации активны и могут сбраживать сусло в течение длительного времени без потери их свойств.
Как правило, при использовании иммобилизованных микроорганизмов процессы роста и метаболизма микроорганизмов разделяются. Это позволяет поддерживать их высокую способность к преобразованию субстратов. Применение иммобилизованных дрожжей дает возможность управлять брожением, эффективно используя каталитические свойства микроорганизмов, а также создать условия для действия непрерывных систем.
Преимуществами использования иммобилизованных клеток по сравнению с интактными являются:
повышение производительности отделения брожения и дображивания, улучшение гидродинамического режима в бродильном аппарате, меньшие площади под оборудованием и капитальные затраты;
возможность достижения полного выбраживания сахара, разделения стадий размножения дрожжей и брожения и вследствие этого изменения продуктов метаболизма дрожжей, достижение накопления побочных продуктов брожения, обусловливающих хорошие органолепти-ческие показатели пива; возможность стабилизации качества продукции;
быстрое и полное отделение сброженного субстрата от клеток микроорганизмов, облегчение или полное исключение фильтрования;
достижение повышенной устойчивости микроорганизмов к неблагоприятному воздействию повышенной концентрации этанола, кислотности субстрата, температуры, тяжелых металлов; пролонгируется действие клеток;
благодаря высокой концентрации биомассы протекание процессов резко ускоряется, повышается эффективность производства;
менее интенсивное размножение дрожжей и, как следствие, уменьшение отходов;
меньший объем работ в отделении брожения и дображивания, подготовки и выращивания дрожжей и связанные с этим более низкие текущие расходы;
возможность использования рас дрожжей (для создания желаемых ор-ганолептических характеристик) независимо от их флокуляционной способности;
возможность использования непрерывной технологии без затрат на очистку и выделение дрожжей, сокращения объема оборудования, возможность ав-
томатизации процесса сбраживания, снижение объема очистных работ [1, 5].
Методы иммобилизации клеток.
Система с иммобилизованными микроорганизмами состоит из микроорганизма, носителя и связующего их звена.
При выборе носителя клеток необходимо исходить из того, чтобы он имел по возможности большую поверхность, проявлял высокую механическую прочность и обладал длительным периодом действия. Особенно важно, чтобы носитель создавал в объеме колонны пористую структуру, способствующую свободному проходу сусла, и не препятствовал быстрому удалению диоксида углерода из системы. Следует также учитывать доступность и экономичность носителя.
Из этого следует, что эффективность использования иммобилизованных клеток зависит от типа носителя.
Носитель влияет как на жизнедеятельность клетки, так и на сам процесс, поскольку, будучи равномерно распределенным по объему субстрата, он способствует равномерному распределению клеток, интенсифицирует процессы обмена и ускоряет выделение образующегося при брожении диоксида углерода.
Носители подразделяют на органические полимерные носители и неорганические. К ним предъявляют следующие требования: они должны быть нерастворимы в реакционной среде, иметь разные заряды с микроорганизмом; иметь высокую гидрофильность, химическую и биологическую устойчивость к продуктам жизнедеятельности клеток и дезинфектантам, не вызывать неспецифической адсорбции, обладать механической, термической, химической и биологической прочностью, иметь возможность регенерации, легко гранулироваться и активироваться; иметь развитую поверхность, обеспечивающую максимальный контакт иммобилизованных клеток с субстратом; быть безвредными, доступными, иметь невысокую стоимость, возможность регенерации, прочность удерживания в условиях непрерывного потока.
Носители для иммобилизации могут иметь зернистую структуру и быть выполнены в виде волокон, пленок, полых трубок, мембран.
Выбор носителя зависит от технологического процесса, способа иммоблиза-ции и культуры микроорганизмов.
Методы иммобилизации можно разделить на механические, физические и химические. Используется также и их сочетание, например механическое удерживание микроорганизмов, усиленное ковалентным связыванием. Иммобилизацию проводят методами хемосорб-ции, ионных и электростатических вза-
имодействий, ван-дер-ваальсовых, капиллярных сил, гидратационных эффектов, флокуляцией и коагуляцией, гидрофобных взаимодействий, биоспецифической адсорбции.
В брожении практическое значение имеют:
адсорбция/адгезия микроорганизмов на поверхности инертных носителей (древесная стружка, пористая керамика, кольца Рашига, стекло, уголь, туф, керамика, растительные волокна, силикатные минералы, соединения титана, стекловолокно и др.);
включение в гели (носитель: альги-нат кальция, желатин, каррагенан, ага-роза, хитозан, пектин, полиакриламид и др.). Несущую матрицу (ковалентно-сшитые гели, нековалентные гели, ионотропные гели) получают при жели-ровании в мягких условиях, чтобы позволить клеткам дрожжей встроиться в матрицу с наименьшей потерей их жизнеспособности;
ковалентное связывание;
мембранное микрокапсулирование микроорганизмов (носитель: клетчатка, диатомит, двухфазные эмульсии, мембраны различного происхождения) [2, 4, 5].
Наибольший практический интерес представляет адсорбционный метод иммобилизации, при котором происходит физическое взаимодействие микроорганизмов и носителя (сорбента). При этом хорошо протекают процессы мас-сопередачи, снижается неравномерность линейных скоростей потока, увеличивается поверхность контакта иммобилизованных клеток с субстратом. В зоне сорбента происходит сорбция биологически активных веществ — ферментов, витаминов, аминокислот и других стимуляторов роста микроорганизмов, что способствует активизации жизнедеятельности микроорганизмов, а также концентрирование продуктов автолиза дрожжей.
Различают физическую и химическую адсорбцию. Физическая имеет место при взаимном притяжении молекул — адсор-бтива (адсорбированного вещества) и адсорбента под действием сил Ван-дер-Ваальса. При физической адсорбции не возникает их химического взаимодействия, а при химической адсорбции, или хемосорбции, образуются химические связи между молекулами поглощенного вещества и адсорбента вследствие химической реакции между ними.
При адсорбции можно выделить следующие этапы: первичная адсорбция; вторичная адгезия, обусловленная процессами образования клеточных метаболитов (полисахаридов, белков и т. д.); накопление последующих клеточных слоев на поверхности первичного клеточного слоя за счет поступления микроорганизмов в реактор при непрерыв-
4•2003
|ПИ
НАПИТКИ
9
7Ш1ШШШШШ
Адсорбция
К к ( К П! К
тштшшшш
Адгезия
Включено в полимерные сети (гели)
Мембранное микрокапсулирование
Ковалентное связывание
7ШШШШШШ
Методы иммобилизации микроорганизмов: К — иммобилизованные клетки [4]
ных процессах и (или) их размножении. Вторичная адгезия приводит к образованию механически прочных слоев микроорганизмов на поверхности сорбента, что является основной причиной практически полной задержки клеток [3].
У адсорбентов большая удельная поверхность, отнесенная к единице массы вещества. Они могут иметь различные по диаметру поры, которые разделяют на макропоры (более 2'10-4мм), переходные поры (610-6—210-4) и микропоры (210-6 до 6'10-6мм). От размера пор зависит и характер адсорбции: возможно образование слоев молекул поглощенного вещества толщиной в одну молекулу (мономолекулярная адсорбция) и толщиной в несколько молекул (полимолекулярная адсорбция).
Также вид сорбента оказывает значительное влияние на толщину, плотность клеточного слоя и на степень удерживания клеток. Использование сорбентов с шероховатой или пористой поверхностью позволяет накапливать большее количество клеток в единице объема аппарата по сравнению с сорбентами с гладкой поверхностью.
Адсорбция микробных клеток зависит от их видовых особенностей, размера, возраста, от химической природы
поверхности клеточной стенки, в состав которой входят соединения, обеспечивающие ее взаимодействие с сорбентами, — содержание белков и фосфатных групп находится в прямой зависимости от гидрофобности клетки. Определенную роль играют и выделяемые клеткой метаболиты, которые могут менять адгезионные свойства поверхности клетки.
Включение в гели — часто применяемый метод иммобилизации, отличающийся достаточной прочностью фиксации клеток. Этот метод применяли в ранних исследованиях по иммобилизации. При этом микробная клетка заключается в полимерную сетку, в ячейки которой проникают молекулы субстрата. Предпочтение в качестве носителей отдают натуральным биополимерам — полисахаридам с карбоксильной группой (альгинат, каррагенан, пектин) или с аминогруппой (хитозан).
Эти носители ввиду их нетоксичности и совместимости с пищевыми продуктами и относительной дешевизны имеют преимущества перед синтетическими — полиакриламидом,поливинилхло-ридом, полиуретаном.
Получаемые при полимеризации гели достаточно устойчивы к механическим
воздействиям, инертны к химическим реагентам, проницаемы для компонентов субстрата и продуктов метаболизма клетки. Механические свойства гелей зависят от структурных элементов, из которых они образованы. Например, альгинат является сополимером манну-роновой и гулуроновой кислот. Он состоит из остатков Д-маннуроновой кислоты, а сегменты ¿-гулуроновой кислоты делают его более твердым, но хрупким. В присутствии двухвалентных катионов (например, кальция) альгиновая кислота образует пористый гель, идеальный для колонизации клетками. Размер пор меньше размера клеток, что препятствует их вымыванию, но достаточно для поступления субстрата.
Методы встраивания микробных клеток в гели подходят при использовании матриц из альгината и каррагенана с размером частиц геля 0,3-3 мм.
Для получения иммобилизованных дрожжевых клеток в геле их суспендируют в растворе альгината натрия, распыляют эту суспензию с 1-4%-ным раствором хлорида кальция. Образующиеся гранулы на поверхности имеют нерастворимый слой альгината кальция, имеющий свойства полупроницаемой мембраны. Размеры образовавшихся частиц различны и зависят от вязкости раствора и скорости вращения перфорированной распылительной пластины.
Механизм процесса улавливания клеток в этом методе еще окончательно не установлен, но предполагают, что здесь участвуют электронные и ковалентные связи клеточной стенки. При благоприятных условиях удается сохранить жизнеспособность иммобилизованных этим методом клеток в течение продолжительного времени.
Хотя частицы носителя имеют высокую загрузку биомассы, потеря механического связывания за счет истирания частиц ограничивает промышленное применение этого метода. Брожение на основах из альгината кальция с вкрапленными клетками дрожжей показало, что ограничение переноса питательных веществ приводит к уменьшению специфической скорости брожения, образования высших спиртов и эфиров и поглощения аминокислот (МазБеЬект, 1986).
Хорошая альтернатива полиакрил-амидным гелям — карраген, обладающий высокой механической прочностью, и вязкоупругие гидрогели поливинилового спирта. Последние получают замораживанием концентрированных растворов поливинилового спирта, который проявляет высокую устойчивость к химически агрессивным растворам, нетоксичен, отличается механической прочностью.
У пивоваров к методу включения в гели небольшой интерес, так как клетки дрожжей вымываются из пор, гель неустойчив к истиранию. Поперечные связи в геле из альгината представляют собой препятствие для прохождения сусла. В результате в готовом пиве обнаруживали высокие концентрации свободного азота аминокислот и диацетила, что свидетельствует о замедленном развитии клеток дрожжей.
В пивоварении было испытано много пилотных установок по иммобилизации клеток с использованием носителей из альгината кальция (White и Portno, 1978; Nakaniski и др., 1985; Masschelein, 1986) [6]. Однако потери механической целостности матрицы, ограничения мас-сопереноса и регенерации требуют использования другого носителя.
Микрокапсулирование (инкапсулирование) — метод, в котором гель аль-гината покрывается поликатионным полимером, например поли-£-лизином или полиэтиленимином, дающими мембрану с ионными связями. Затем альгинат может быть растворен в растворе цитрата. При этом клетки останутся в суспензии, но за полимерным барьером, позволяющим пройти только веществам с молекулярной массой 100 000.
Метод ковалентного связывания с использованием полимерной подложки полностью связывает дрожжи в геле, что исключает вымывание клеток. По сравнению с ним метод адсорбции имеет преимущество в простоте иммобилизации, доступности, безопасности и дешевизне носителей.
Для технического применения наиболее подходят три способа иммобилизации дрожжей: заключение их в матрицу, адсорбция на поверхности носителя, заселение пористых материалов. К технологии иммобилизации предъявляют требования: высокая емкость материала с тем, чтобы можно было иммобилизовать большее количество дрожжей, и между суслом и дрожжами не должно быть барьеров.
В носителях реагируют с дрожжевыми клетками атомы и функциональные группы поверхностей, а в дрожжах взаимодействуют с носителями функциональные группы клеточной стенки, обладающие определенным зарядом и поверхностной активностью. Прочность связывания дрожжевых клеток с носителями характеризуется величиной энергии связи: для ковалентной она составляет 300-400 кДж/моль, ионной — 160-460, водородной — 8-12, солевого мостика — 4-6, электростатического взаимодействия — 6, гидрофобного — 4-8,5, адсорбции — не более 10 кДж/моль [5].
Способность клетки к иммобилизации определяется температурой, соста-
вом среды выращивания. Как правило, клетки во время лаг-фазы и на первой стадии экспоненциальной фазы роста адсорбируются плохо. В середине экспоненциальной фазы для клеток характерна максимальная адсорбционная способность, которая в стационарной фазе не меняется или уменьшается.
Эффективность процесса иммобилизации зависит от поверхностной энергии адсорбента. Если она низка, то происходит адсорбция значительного количества клеток, не образующих с адсорбентом прочных связей. На адсорбенте с высокой поверхностной энергией фиксируется сравнительно небольшое количество клеток, зато прочность адсорбции высокая.
Свободные клетки проявляют активность при рН 5,0-5,2, иммобилизованные — при 3,6-7,0, что дает возможность проводить брожение при более низком рН и снизить инфицированность процесса. Иммобилизованные клетки при 7...40°С имеют большую бродильную активность, чем свободные клетки, и более эффективно сбраживают концентрированное сусло [4].
Физиология дрожжей. В последние годы были разработаны технологии и аппаратурное оформление по сбраживанию или созреванию пива с иммобилизованными дрожжами. Это дает возможность увеличить и оптимизировать съем продукции с единицы объема, уменьшить текущие затраты и автоматизировать все процессы.
Иммобилизованные клетки можно использовать как периодически, так и непрерывно. Но как для периодического, так и для непрерывного сбраживания необходимо провести дальнейшие исследования по физиологии иммобилизованной клетки, массопереносу, системе иммобилизации и конструкции реактора. Полученная информация позволит сочетать высокие продуктивность и качество пива.
В системе с иммобилизованными дрожжами большая часть биомассы дрожжей удерживается.
Установлено, что иммобилизация клеток позволяет хорошо использовать внутриклеточные ферменты [3]. Активность некоторых ферментов иммобилизованных клеток выше, чем у интактных клеток. При этом все фазы развития дрожжей протекают одновременно. При иммобилизации микроорганизмов возможны изменения проницаемости клеток, более равномерное распределение питательных веществ по всему объему биореактора, что также положительно влияет на жизнедеятельность микроорганизмов. Установлено, что иммобилизованные дрожжи синтезируют повышенные концентрации эфиров.
Иммобилизованные дрожжи могут быть использованы для периодического или для непрерывного процесса, при этом как для осуществления главного брожения, так и для дображивания и созревания пива.
Особый интерес иммобилизованные дрожжи представляют с точки зрения перехода к непрерывному брожению с интенсивным протоком сусла через аппарат. При этом, изменяя параметры процесса, такие, как скорость потока, температура, засев дрожжей и скорость разбавления, может быть достигнут режим устойчивого процесса. Кроме того, непрерывное брожение иммобилизованными дрожжами предоставит новые возможности генной инженерии пивоваренных дрожжей.
Кроме того, иммобилизованные дрожжи можно использовать в биореакторах для получения безалкогольного пива, для сбраживания сусла с высокой концентрацией сухих веществ. При этом создание защитного слоя вокруг клеток способствует улучшению свойств дрожжей. Этот слой снижает этанольный стресс в микросреде, так как полимеры, использующиеся при иммобилизации клеток, помогают транспортировке этанола внутрь клетки и обратно.
Значительный прогресс в брожении был достигнут использованием иммобилизованных систем в пивоварении. Применение иммобилизованных дрожжей позволяет переходить к непрерывным схемам, упрощать операции по разделению дрожжей и пива, длительно эксплуатировать метаболические способности клеток, повышать продуктивность процесса, получать новые сорта пива. Основной критерий пригодности новой технологии — конечное качество готового пива: метод может быть применен только в том случае, если качество пиво не изменяется или его изменения незначительны.
ЛИТЕРАТУРА
1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. — М.: Элевар, 2000. С. 512.
2. Колпакчи А.П. Влияние закрепления пивоваренных дрожжей на носителе на процесс сбраживания пивного сусла/Научно-технический реферативный сборник. — М.: ЦНИИТЭИпи-щепром, 1979.
3. Калунянц К.А. Химия солода и пива. — М.: Аг-ропромиздат, 1990. С. 176.
4. Саришвили Н.Г., Рейтблат Б.Б. Микробиологические основы технологии шампанизации вина. — М.: Пищевая промышленность, 2000. С. 364.
5. Хорунжина С.И. Биохимические и физико-химические основы технологии солда и пива. — М.: Колос, 1999. С. 312.
6. Bardi E.P., Koutinas A.A., Soupioni M.J, Kandellaki M.E. Immobilization of yeast on delignified cellulosic material for low temperature brewing. — J.Agric.Chem. 1996.
