CC BY
72
БИОТЕРАПИЯ ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ□ 49
УДК 616.006-441-08-059-092.9:611.13/.16.018:577.21.088 Д.В. Соколова, Е.В. Степанова, В.А. Голубева, Е.М. Трещалина, А.Ю. Барышников ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КСЕНОГРАФТОВ ЛИМФОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЛБР-2 КАК МИШЕНИ ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Соколова Дарина Вадимовна, аспирант, лаборант-исследователь лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва адрес: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24; тел.: +7(495)324-10-65 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 26.02.2010, принята к печати 02.03.2010.
Резюме
Лиганд-опосредованная доставка липосомальных форм противоопухолевых препаратов к антигенам является эффективной стратегией, направленной на повышение их терапевтической эффективности. В качестве антигена-мишени выступают, как правило, молекулы, гиперэкспрессированные или селективно представленные на поверхности опухолевых клеток. Для определения дозового диапазона биологического действия подобных препаратов необходимы адекватные модели на животных. В настоящей работе с помощью морфологического, иммуногистохимического и проточно-цитофлуориметрического методов исследования определены основные биологические мишени для противоопухолевой таргетной терапии в подкожных ксенографтах лимфо-мы Беркитта человека, штамм ЛБР-2 из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Установлено наличие на поверхности клеток ЛБР-2 антигенов-мишеней CD19 и HLA-DR, а также маркеров не-оангиогенеза VEGF, HIF1a, CD31 и маркера пролиферации Ki-67. Стабильный уровень экспрессии CD19 и HLA-DR антигенов позволяет рекомендовать эту опухоль в качестве доклинической модели для изучения специфической противоопухолевой активности препаратов, направленных против этих мишеней.
Ключевые слова: таргетная терапия опухолей, молекулярные мишени, маркеры неоангиогенеза, подкожные ксенографты лимфомы Беркитта человека ЛБР-2, иммунодефицитные мыши, морфология опухоли, иммунология опухоли.
D. V. Sokolova, E. V. Stepanova, V.A. Golubeva, E.M. Treshalina, A. Yu. Baryshnikov THE BASIC BIOLOGICAL CHARACTERISTICS
OF HUMAN LYMPHOMA LBR-2 XENOGRAFT FOR TARGETED THERAPY
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
Abstract
Ligand-mediated delivery of liposomal anticancer drugs to antigens is being recognized as an effective strategy for increasing the therapeutic effectiveness of anticancer drugs. Molecules that are either presented selectively, or are overexpressed on the tumor cells surface are usually used as target antigens. To determine the dose range of biological effects for these drugs, the adeauate animal models are reauired. In this study we performed morphological, immunohistochemical and flow-cytometry methods to identify the maior biological target for anticancer «target» therapy in subcutaneous human lymphoma xenografts line LBR-2 from the N.N. Blokhin Cancer Research Center Collection of tumor strains. We have determined the expression of CD19, CD20, and HLA-DR antigens as well as the markers of neoangiogenesis VEGF, HIF-1a, CD31, and the proliferation marker Ki-67 on the LBR-2 cells. The constitutive expression of CD19 or HLA-DR antigens make it possible to recommend this tumor as a preclinical model to examine the specific antitumor activity of drugs directed against these targets.
Key words: targeted tumor therapy, molecular targets, markers of neoangiogenesis, subcutaneous xenografts of Burkitt’s human lymphoma line LBR-2, immune deficient mice, tumor morphology, tumor immunology.
Введение
Агрессивные неходжкинские лимфомы представляют собой группу опухолей, характеризующихся высоким уровнем пролиферативной активности и умеренной или высокой чувствительностью к химиотерапии. Применение цитостатиков в составе традиционных схем ХТ для лечения этого заболевания ограничено высокой общей токсичностью [2; 4; 7]. Молекулярная идентификация опухолевых маркеров открыла новые возможности для развития эффективной селективной стратегии, основанной на использовании лиганд-опосредованного или т.н. «активного» транспорта препаратов к опухоли [10; 12]. Данная стратегия реализовалась, в частности, в
разработке иммунолипосомальных лекарственных форм, содержащих на поверхности липосомы в качестве лиганда специфическое антитело или его Fab-фрагмент к одному из опухолевых антигенов [5; 6; 9; 11]. Для определения дозовых характеристик анти-пролиферативного действия адресных форм противоопухолевых препаратов, перспективных для клинического изучения, необходимо использовать адекватные модели опухолевого роста на животных [8; 13-15]. Оптимальной опухолевой моделью для оценки активности иммунолипосомального лекарственного препарата in vivo является человеческая опухолевая клеточная линия гистологически идентичная исходной опухоли, адаптированная к росту у имму-нодефицитных животных.
Помимо этого такая модель должна иметь адекватные кинетические параметры (скорость роста, достаточно длительную фазу экспоненциального роста, образование измеряемых опухолевых узлов и т.д.), а также способность к неоваскуляризации для обеспечения эффективной доставки препарата к мишени. В качестве специфических характеристик на поверхности опухолевых клеток обязательна стабильная селективная гиперэкспрессия сигнальных антигенов, к которым специфичны МКА, конъюгированные с липосомами [12]. Данная работа посвящена изучению штамма человеческой лимфомы Беркитта ЛБР-2 из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН [4] с помощью гистологической, морфологической и иммунологической идентификации основных молекулярных мишеней для рекомендации использования ее в качестве опухолевой модели при доклинической оценке эффективности «таргетных» препаратов. Стабильно экспрессируемые мишени рассматривались как основание для использования этой модели в доклинических исследованиях.
Материалы и методы
Лабораторные животные
Использовали 90 конвенциональных мышей-самок Balb/c nude 8-10 нед массой тела 18-21 г. Мышей содержали в SPF-зоне специализированного кондиционированного бестимусного отсека при нормированном температурно-влажностном режиме на стерильном экструдированном корме («МЭСТ», РФ), стерильной воде и стерильной бумажной подстилке. Для введения в эксперимент мышей ранжировали по массе тела с разбросом не более 10 % у разных особей (n=3).
Штамм опухоли
Использован штамм лимфомы Беркитта ЛБР-2, первично полученный на мышах Balb/c nude в виде п/к ксенографтов из культуры клеток линии Namalwa [3], и затем специально адаптированный нами к росту в культуре клеток.
Для получения 1-го пассажа на мышах адаптированную нами культуру клеток ЛБР-2 имплантировали п/к в количестве 5*106 клеток на мышь. Повторные пассажи выполняли взвесью опухолевой ткани (инокулят), полученной из подкожных узлов предшествующего пассажа по 60 мг на мышь в 0,5 мл питательной среды 199. Для получения взвеси опухоль препарировали, измельчали с помощью медицинских ножниц, филь-тровали полученную взвесь от крупных агрегатов и ex tempore готовили иноку-лят. Всего выполнено 10 пассажей с интервалом 23 дня между трансплантациями.
Таким путем достигалась возможность получения достаточного количества опухолевого материала для необходимых исследований с использованием одного культурального пассажа.
Определение основных
биологических характеристик ЛБР-2
В эксперименте выполняли:
L мониторинг кинетики роста опухоли под кожей мышей;
L гистологическое исследование строения опухолевого узла (морфологический контроль);
L иммунофенотипическое исследование основных опухолевых маркеров in vivo;
L определение основных маркеров неоангиогене-за in vivo.
Мониторинг роста п/к ксенографтов на мышах Для выявления п/к опухолевых узлов у мышей проводили визуальное наблюдение, а также периодическую пальпацию места трансплантации и наблюдение за характером роста в течение не менее месяца после трансплантации. Пальпируемые узлы многократно измеряли и рассчитывали объем в динамике (К = а х Ь х с, мм 3), что позволило рассчитать средние объемы (Уср), а также относительную скорость роста опухолевых узлов, как соотношение последующего объема к предыдущему:
Zn
Fn -
, где
n - номер измерения.
По этим параметрам строили кривые и определяли стандартные показатели роста опухоли: длительность латентного периода (отсутствие пальпируемых опухолей), экспоненциальной фазы (> трехкратное увеличение размеров), стационарной фазы (отсутствие динамики роста, или менее чем трехкратное увеличение размеров). Параметры роста считали стандартными при условии 100 % прививаемости пассажа. Дополнительным показателем стандартности являлась продолжительность жизни мышей с опухолью, соответствующая паспортным данным коллекционного штамма.
Морфолологическое исследование
Для морфологического исследования выделенный опухолевый материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине в течение 24-48 ч. Затем промывали в проточной водопроводной воде, фиксировали в 5 сменах этанола в течение 1-2 ч в каждой, в 2 сменах ксилола по 20 мин в каждой и в смеси ксилол/парафин 1 ч. Г отовые срезы пропитывали парафином в течение 2 ч и заливали в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 6-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммунофенотипическое исследование
Опухолевый материал, полученный от каждого пассажа, типировали с помощью реакции поверхностной иммунофлуоресценции. В исследовании использовалась следующая панель МКА: HLA-ABC (Serotec), HLA-DR (Serotec), CD20 (Serotec), ICO-180 (НПЦ «Медбиоспектр»), CD19 (Serotec), CD45 (Serotec), изотипические контроли, коньюги-рованные с FITC и PE (Beckman Coulter). С целью определения степени чистоты полученной опухолевой суспензии проводили двойное окрашивание клеток МКА к молекулам MHC I класса HLA-ABC и общелейкоцитарному АГ CD45. Клетки дважды отмывали и ресуспендировали в фосфатном бу фер-ном растворе (PBS), рН 7,4. Клетки (0,5-1*10 ) инкубировали с МКА в течение 30 мин в темноте при 4 °C. После этого клетки дважды отмывали и ре-суспедировали в PBS, содержащем 1% формалина. Клетки анализировали на проточном цитофлуори-метре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Иммуногистохимическое исследование
Проводили с помощью ИГХ-анализа срезов парафиновых блоков опухолей. Ангиогенную активность опухоли определяли как по экспрессии белков, запускающих процесс ангиогенеза HIF-1a и VEGF, так и по количеству микрососудов в опухоли, что является суммарным показателем действия стимуляторов и ингибиторов ангиогенеза.
Срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для «демаскировки» антигенов проводили прогревание срезов в предварительно нагретом до 95-99 °С в 10 мМ цитратном буфере в течение 30 мин.
Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 10 мин в темноте с 3 %-ной перекисью водорода. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 мин с 1 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при 4 °С в течение 16 ч. Инкубацию с проявочной тест-системой [LSAB®+kit или Envision®+ kit, DAKO] проводили при комнатной температуре в течение 20 мин, затем срезы промывали 2 раза по 5 мин.
Для визуализации ИГХ-реакции использовали DAB+ систему [DAKO]. Реакцию проводили в темноте в течение 5-10 мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Nikon» (Япония) под увеличением х10, х40. Для маркеров VEGF и HIF-1a оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана) и интенсивность иммунного окрашивания.
Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. Опухоль считали положительной по VEGF, если в ткани опухоли наблюдалось значимое окрашивание цитоплазмы более 25 % опухолевых клеток. Для оценки пролиферативной активности опухоли подсчитывали количество Ki-67+ опухолевых клеток, приходящиеся на 200-300 опухолевых клеток. Индекс Ki-67 определяли по формуле:
число Ki - 67 - клеток х 100
ПА =---------------------------------, где
общее число клеток
ПА - пролиферативная активность опухоли.
Количество сосудов, окрашенных антителами к CD31, оценивали не менее чем в 3 полях зрения, содержащих максимальное количество сосудов.
Статистическая обработка данных
Выполняли с использованием компьютерной программы «BIOSTAT» (Version 3.2), Microsoft Excel, Statistica v.5.0. Статистически достоверными считали различия при р<0,05.
Завершение экспериментов
Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза в соответствие с международными требованиями этики при работе с лабораторными животными.
Результаты и обсуждение
Мониторинг кинетики роста п/к
ксенографтов ЛБР-2 in vivo
На 1-м пассаже выполняли трансплантацию клеток в стандартной прививочной дозе 5х106 клеток на мышь. К 18 дню (латентный период) после трансплантации получен 100 %-ный выход опухолей среднего объема ^р=336[198ч474]мм3.
К 22-му дню объем увеличился в 5,1 раза до ^=1734[1312-2156]мм3 с постоянной скоростью к 26 дню опыта. Экспоненциальная фаза роста, таким образом, составила 8 дней (рис. 1). Стационарную фазу роста с увеличением объема опухоли в 1,2 раза наблюдали на 26-30 дни опыта.
В результате к концу наблюдения объем опухолей увеличился почти в 1S раз и достиг Vcp=5655[43 11^б999]мм3 (рис. 2).
Гистологическая характеристика п/к ксенографтов ЛБР-2 у мышей-самок Balb/c nude
Во всех гистологических препаратах, полученных из опухолевых узлов 1-10-го пассажей выявлен диффузный рост относительно мономорфных мелких клеток полигональной формы с круглым или овальным ядром, по размерам превышающим ядро малого лимфоцита (рис. 3 А, Б). Ядерная мембрана четкая. В ядре определяются множественные (2-5) базофильные нуклеолы. Характерны многочисленные фигуры митоза. Выявляется высокий уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67 приближен к 100 %; рис. 4). Присутствует типичная для данного типа лимфомы картина «звездного неба» («starry sky»), обусловленная присутствием большого числа макрофагов. Выявленная при патоморфологическом исследовании структура полученных нами п/к ксенографтов ЛБР-2 идентична гистологической картине лимфомы Беркитта человека [1].
Иммунофенотипическая характеристика ЛБР-2 В культуре клеток ЛБР-2 выявлен высокий уровень экспрессии молекул MHC I класса 95±3 % (рис. 5 А), В-клеточных антигенов CD19 (92±5 %; рис. 5 Б), CD20 (93±2 %; рис. 5 В), а также молекул MHC II класса HLA-DR (92±3 %; рис. 5 Г).
В результате иммунофенотипического исследования п/к ксенографтов ЛБР-2 1-10 пассажей при двойном окрашивании с использованием МКА CD45 и HLA-ABC выявлено 94±2 % позитивных клеток (рис. б), что свидетельствует о чистоте опухолевого инокулята. Уровень экспрессии В-клеточного маркера CD19 на 1 пассаже п/к ксенографтов ЛБР-2 был относительно низок по сравнению с исходным на клеточной линии и составил 37±3 % (рис. 7 A). Ко 2 пассажу экспрессия антигена снизилась до 12 % (рис. 7, Б), к 4 - снизилась практически до нуля (рис. 7 Г). Начиная с 5 пассажа, экспрессия маркера CD19 начала восстанавливаться и к б пассажу достигла исходного уровня (рис. 7 Е). Экспрессия антигена CD20 полностью утрачивалась уже на 1 пассаже и не восстанавлива-лась на последующих (рис. S А-Г). Потеря экспрессии В-клеточного антигена может быть обусловлена относительно слабым иммунодефицитом гибридных животных.
Уровень экспрессии молекул MHC II класса (HLA-DR) был стабильно высоким на протяжении всего периода пассирования (рис. 9).
Определение ангиогенной активности п/к ксенографтов ЛБР-2
Исследование показало, что на поверхности опухолевых клеток ЛБР-2 разных пассажей значимых различий в накоплении HIFl-a нет. Напротив, в цитоплазме и ядре опухолевых клеток наблюдалось накопление HIFl-a в S0-100 % клеток - соответствующее окрашивание (рис. 10 Б). Интенсивность окрашивания антителами к HIFl-a была выше в центральной части, чем в периферических участках опухоли. Экспрессия основного фактора ангиогенеза VEGF наблюдалась в цитоплазме 60-S0 % опухолевых клеток, интенсивность окрашивания и количество положительных клеток значимо не изменялись на протяжении всего периода пассирования (рис. 10 В).
Иллюстрации 1-10 см. на стр. II-IV
Среднее количество микрососудов в опухоли, окрашенных антителами к СБ31, составило 6±3 в поле зрения при увеличении *40 (рис. 10 А) и значимо не изменялось от пассажа к пассажу.
Таким образом, стабильно высокая экспрессия факторов неоангиогенеза в п/к ксенографтах ЛБР-2 на протяжении 10 пассажей указывает на высокую ан-гиогенную активность этой опухолевой модели.
Выводы
1. Штамм перевиваемой лимфомы Беркитта человека ЛБР-2 из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ адаптирован к росту in vitro.
2. П/к ксенографты ЛБР-2 полученные имплантацией адаптированной культуры клеток иммунодефи-цитным мышам Balb/c nude, по прививаемости, скорости, кинетике роста и размерам опухолевых узлов пригодны для доклинических исследований.
3. П/к ксенографты ЛБР-2, первично полученные из культуры клеток линии Namalva, при многократном пассировании на иммунодецифитных мышах-самках Balb/c nude сохраняют гистологическую структуру, идентичную лимфоме Беркитта человека.
4. П/к ксенографты ЛБР-2 в течение 10 пассажей на мышах Balb/c nude имеют стабильно высокий уровень экспрессии молекул HLA-DR.
5. Стабильная экспрессия В-клеточного маркера CD19 в п/к ксенографтах ЛБР-2 на мышах Balb/c nude устанавливается только после 5-го пассажа.
6. Экспрессия В-клеточного маркера антигена CD20 в п/к ксенографтах ЛБР-2 не выявляется ни в одном из пассажей на мышах Balb/c nude.
7. ЛБР-2 в виде п/к ксенографтов обладает высоким уровнем экспрессии ангиогенных маркеров VEGF; СD31; HIF1- и могут быть использованы для доклинического изучения противоопухолевых препаратов, направленных на ингибирование ангио- и васкулогенеза.
8. Штамм лимфомы Беркитта человека ЛБР-2 из Коллекции опухолевых штаммов РОНЦ в виде п/к ксенографтов пригодна для оценки антипролиферативного действия адресных препаратов, направленных против HLA-DR и/или CD19 антигена.
Литература
1. Е.А. Барях, С.К. Кравченко, Т.Н. Обухова и др. Лимфома Беркитта: клиника, диагностика, лечение // Клиническая окогематология. - 2009. - Т. 2, № 2. - С. 137-46.
2. Гершанович М.Л. Основные принципы лечения неходжкинских лимфом // Практическая онкология. - 2004. - Т. 5, № 3. - С. 185-93.
3. Трещалина Е.М. Коллекция опухолевых штаммов человека. - Под ред. Давыдова М.И. - М: Практическая медицина, 2009. - 171 с.
4. Хансон К.П., Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. - 2004. - Т. 5, № 3. - С. 1б3-8.
5. Allen T.M., Brandeis E., Hansen C.B. A new strategy for attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes resulting in efficient targeting to cancer cells // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. - Vol. 1237. - P. 99-108.
6. Drummond D.C, Meyer O.M, Hong K. et al. Optimizing liposomes for delivery of chemotherapeutic agents to solid tumors // Pharmacol. Rev. - 1999. - Vol. 51. - P. 691-743.
7. Ferry J.A. Burkitt's Lymphoma: Clinicopathologic Features and Differential Diagnosis // The oncologist. -2006. - Vol. 11. - P. 375-83.
8. KellandL.R. «Of mice and men»: values and liabilities of the athymic nude mouse model in anticancer drug development // Eur. J. Cancer. - 2004. - Vol. 40. - P. 827-36.
9. Li W.M., Mayer L.D., Bally M.B. Prevention of antibody mediated elimination of ligand -targeted liposomes by using poly (ethyleneglycol)- modified lipids // The Journal of pharmacology and experimental therapeutics JPET. 2002. - Vol. 300. - P. 976-83.
10. Lopes de Menezes D.E., Pilarski L.M., Allen T.M. In vitro and in vivo targeting of immunoliposomal doxorubicin to human B-cell lymphoma // Cancer Research. - 1998. - Vol. 58. - P. 3320-30.
11. Noble C.O., Guo Z., Hayes M.E. et al. Characterization of highly stable liposomal and immunoliposomal formulations of vincristine and vinblastine // Cancer Chemother. Pharmacol. - 2009. - Vol. 64. - P. 741-51.
12. Sapra P., Allen T.M. Improved outcome B-cell lymphoma is treated with combinations of immunoliposomal anticancer drugs targeted to both the CD19 and CD20 epitopes // Clinical Cancer Research. - 2004. -Vol.10. - P. 2530-7.
13. Sausville E.A., Newell D.R. Preclinical models in cancer drug discovery and development // Eur. J. Cancer. -2004. - Vol. 40. - P. 783-4.
14. Suggit M., Bibby M.C. Fifty years of preclinical anticancer drug screening empirical to target -driven approaches // Clin. Cancer Res. - 2005. - Vol. 11. - 971-81.
15. Troiani T., Schettino C., Martinelli E. The use of xenograft models for the selection of cancer treatments with the EGFR as an example // Critical Reviews in Oncology/Hematology. - 2008. - Vol. 65. - P. 200-11.
Положительный контроль
0,2 мг/мл І мг/мл 2 мг/мл
Рис. 6. Микрофотографии имплантантов Матригеля, выделенных из подкожной клетчатки мышей, и гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином; получены in vivo введении Абисилина® per os.
Рисунки к статье Д.В. Соколовой и соавт.
«ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КСЕНОГРАФТОВ ЛИМФОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЛБР-2 КАК МИШЕНИ ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ»
Рис. 1. Динамика роста 1-го пассажа п/к ксенографта ЛБР-2 у мышей- Рис. 2. Мышь линии Balb/c nude с п/к самок Balb/c nude после имплантации адаптированной культуры клеток. ксенографтом ЛБР-2 (1-й пассаж, 24-е
сутки после трансплантации).
10 10 10 10 10 FL1-H
. _____ _____, гм»г
10° 101 102 103 10' FL2-H
Рис. 5. Иммунофенотипирование клеток линии Namalwa:
А - HLA-ABC; Б - CD19; В - CD20; Г - HLA-DR.
Рис. 7. Гистограммы экспрессии CD19 антигена на клетках п/к ксенографтов ЛБР-2 у мышей Balb/c nude: 1-8-й пассажи (А-З соответственно).
Рис. 8. Гистограммы экспрессии CD20-антигена на клетках п/к ксенографтов ЛБР-2 у мышей Balb/c nude: 1-4-й пассажи (А-Г соответственно).
Рис. 9. Г истограммы экспрессии HLA-DR на клетках п/к ксенографтов ЛБР-2 у мышей Balb/c nude:
1 -8-й пассажи (А-З соответственно).
На рис. 5; 7-9. по оси абсцисс - количество клеток; по оси ординат - интенсивность флюоресценции; закрашенные гистограммы - изотипические контроли; прозрачные гистограммы с черной линией - исследуемые антигены;
