CC BY
25
УДК 574:664 DOI: 10.17217/2079-0333-2022-60-18-38
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ МОРСКИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ДЛЯ БОРЬБЫ С ПАТОГЕННЫМИ БИОПЛЕНКООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ
Огнистая А.В.1, 2, Маркина Ж.В.1
1 Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, г. Владивосток, ул. Пальчевского, д. 17.
2 Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток, о. Русский, п. Аякс, 10.
В работе дана оценка влияния метаболитов морских микроводорослей на биопленкообразование патогенных бактерий на полистироле. В результате экспериментов выявлено, что внеклеточные соединения Prorocentrum foraminosum PrRUS_7 и Heterosigma akashiwo HAK-SR11 угнетают рост бактерий на поверхностях полистирола. Также обнаружено, что метаболиты Alexandrium affine стимулировали развитие биопленок в нескольких случаях. С помощью сканирующей электронной микроскопии удалось визуализировать эффекты ингибирования и стимуляции роста патогенов, проявляемые метаболитами микроводорослей. Полученные данные могут использоваться для дальнейших исследований с целью создания дезинфицирующих средств для обработки материалов из полистирола на пищевом производстве.
Ключевые слова: биопленка, морские микроводоросли, патогенные бактерии, пищевая промышленность, полистирол, экзометаболиты, эндометаболиты.
EXPERIENCE IN MARINE MICROALGAE METABOLITES USE TO COMBAT PATHOGENIC BIOFILM-FORMING BACTERIA
Ognistaya A.V.1 2, Markina Zh.V.1
1 A.V. Zhirmunsky National Scientific Center for Marine Biology FEB RAS, Vladivostok, Palchevsky, Str. 17.
2 Far Eastern Federal University, Vladivostok, Island Russkiy, The Ajax Bay 10.
The effect of marine microalgae metabolites on pathogenic bacteria biofilm-formation on polystyrene was estimated in the paper. Experiments revealed that extracellular compounds Prorocentrum foraminosum PrRUS_7 and Heterosigma akashiwo HAK-SR11 inhibit bacterial growth on polystyrene surfaces. It was also found that Alexandrium affine metabolites stimulated the biofilms development in several cases. By means of scanning electron microscopy it was possible to visualize the effects of inhibition and stimulation of pathogen growth manifested by microalgae metabolites. The obtained data can be used for further research in order to create disinfectants for polystyrene materials processing in food production.
Key words: biofilm, marine microalgae, pathogenic bacteria, food industry, polystyrene, exometabolites, endometabolites.
ВВЕДЕНИЕ
Вспышки пищевых инфекций, вызываемые энтеробактериями, листериями, стафилококками - явление, наблюдаемое во всем мире. Эти возбудители способны вызывать нарушения работы пищеварительной системы, интоксикацию, гастроэнтериты, колиты и др. [Galië et а1., 2018].
Постоянный контакт пищевой продукции (мясо, птица, морепродукты, молоко, сыр, фрукты, овощи и др.) с эксплуатируемым в процессе производства оборудованием промышленного типа (резервуары, мясорубки, режущие и разделочные инструменты, пастеризаторы, центрифуги, столы, упаковочный материал и т. д.) - главный источник инфицирования продуктов питания бактериями [Сата^о et а1., 2017, Galië et а1., 2018]. Более того, формируются биопленки, которые проявляют высокую устойчивость к дезинфицирующим средствам. Биопленки представляют собой сложные микробные экосистемы, образованные одним или несколькими видами, погруженными во внеклеточный матрикс различного состава в зависимости от типа производимой продукции. Они приобретают способность к физической (против высыхания), механической (потоков моющей жидкости) и химической (химикатов, антимикробных и дезинфицирующих средств) стойкости [Boudare1 et а1., 2018].
На заводах по производству продуктов питания биопленкообразующие бактерии обнаружены на материалах из тефлона, резины, пластика и т. д. Полистирол широко применяется практически во всех отраслях пищевой промышленности. Этот материал не способен растворяться в слабых растворах кислот, воде, щелочах и спиртах. Он входит в состав эксплуатируемого оборудования, а также активно используется при упаковке пищевых про-
дуктов - фруктов, различных видов мяса, рыбы и т. д. К примеру, на птицефабриках полистирол применяют при подаче воды на станциях кормления, при перевозке живых бройлеров на бойни и при упаковке готовой продукции [вепиа1& et а!, 2014]. Стоит отметить, что этот материал является благоприятным субстратом и легко колонизируется различными бактериями. Рабочая поверхность инвентаря и упаковки становится опасной, так как зачастую через нее происходит инфицирование пищи патогенными микроорганизмами р1етт^ й а1., 2016; ваНё et а1., 2018]. Распространение микроорганизмов негативно сказывается на здоровье людей, а также препятствует эффективной работе предприятий: происходит ускорение коррозии, засорение зондов и фильтров, что приводит к сокращению срока их службы и лишним производственным затратам [ваНё et а1., 2018].
На сегодняшний день приложено много усилий для устранения биопленок на рабочих поверхностях пищевого инструментария. Основное внимание исследователей было сконцентрировано на разработке дезинфицирующих средств, применение которых считается одним из лучших способов для удаления микроорганизмов. Однако необходимо отметить, что постоянное использование дезинфектантов на основе антибиотиков на пищевых заводах является одной из основных движущих сил в отношении развития устойчивости бактерий. Антибиотикорезистентность приводит к появлению способности микроорганизмов сохранять свою жизнедеятельность, несмотря на обработку противомик-робными препаратами [Сата^о et а1., 2017]. Таким образом, разработка альтернативных технологий и поиск новых эффективных средств против бактерий может стать первым шагом к уменьшению
и предотвращению развития биопленок в пищевой промышленности.
Среди большого числа морских организмов одноклеточные водоросли представляют собой перспективный ресурс благодаря способности к быстрому росту и простым потребностям в питательных веществах [Balamurugan et al., 2013]. Контролируя процесс выращивания культур морских микроводорослей, можно управлять производством необходимых веществ [Encamacao et al., 2015]. Интерес к микроводорослям заключается в их метаболической пластичности, а также запуске вторичного метаболизма в экстремальных условиях [Falaise et al., 2016].
Известно, что многие виды водорослей, изолированные из разных мест обитания, обладают неодинаковой стимулирующей и ингибирующей активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам [Talero et al., 2015]. Однако такие работы охватывают не все разнообразие фитопланктона. При этом в литературных данных отсутствует информация о воздействии соединений, выделенных из микроводорослей Японского моря на бактериальные биопленки.
Целью данной работы являлась оценка влияния экстрактов морских микроводорослей на ростовые процессы патогенных бактерий Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enteridis и Escherichia coli.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования послужили культуры микроводорослей из Биоресурсной коллекции «Морской биобанк» Национального научного центра морской биологии ДВО РАН Alexandrium tamarense ATRU-16, Alexandrium affne AFRU-12, Prorocentrum foraminosum PrRUS_7, Heterosigma akashiwo HAK-SR11.
В качестве модельных бактерий использовали шесть штаммов из коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова: Staphylococcus aureus 6539; Listeria monocytogenes 310 8078 B-4835/6; Listeria monocytogenes 315 9852 B-6144/1, 4, 6; Salmonella enterica serovar typhimu-rium 3695; Salmonella enterica subsp. enterica serovar enteridis. Целью данной работы являлась оценка влияния экстрактов морских микроводорослей на ростовые процессы патогенных бактерий Staphylo-coccus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella enteridis и Escherichia coli.
Альгологические методы. Культивирование микроводорослей осуществляли в 100 мл в колбах Эрленмейера при температуре 20°С, освещенности 3 500 люкс, периодическом освещении 12 ч свет : 12 ч темнота на питательной среде f/2. Основу среды составила фильтрованная морская вода соленостью 30%о [Andersen, 2005].
Контроль численности микроводорослей проводили путем учета количества клеток в единице объема суспензии. Подсчет клеток производили под микроскопом в камере Горяева [Andersen, 2005].
Для проведения экстракции использовали культуры фитопланктона на переходе из экспоненциальной фазы роста в стационарную. Эта стадия выбрана в связи с тем, что многие исследователи обнаружили, что продукция соединений, ответственных за антибиотические свойства водорослей, чаще всего происходит именно в промежуток между этими фазами роста [Go et al., 2012; Gacheva, Gigova, 2014].
Экстракция клеток микроводорослей. Внеклеточные метаболиты (экзомета-болиты) из микропланктона получали по методике Ли в модификации Аль-Хашими [Lee et al., 1987; Al-Hashimi et al., 2016]. Исследования по выделению активных
веществ (эндометаболитов) из клеточной биомассы микроводорослей осуществляли посредством экстрагирования по методике Бруджан в модификации Клеинегрис [Brujan et al., 2001; Kleinegris et al., 2011]. Концентрирование биомассы осуществляли с помощью центрифуги Allegra 64R (Beckman Coulter) в течение 15 минут при скорости вращения 4 000 об/мин. Надоса-дочную жидкость удаляли и промывали культуры изотоническим раствором хлорида натрия. Процесс центрифугирования повторяли трижды, до полного очищения клеток. Полученную биомассу микроводорослей подвергали экстракции этанолом в соотношении 1 : 2 в течение 24 часов.
Бактериологические методы. Для получения изолированных колоний бактерий применяли метод последовательных разведений [Бузолева, 2011].
Культивирование и количественная оценка бактерий при воздействии экстрактов микроводорослей. Культивирование бактерий совместно с метаболитами микроводорослей производили на поверхности 96-луночного круглодонного планшета из полистирола Sovtech. Динамику образования биопленок на субстрате исследовали с 1-х по 7-е сутки при температуре 37°С. Для определения способности исследуемых штаммов образовывать биопленку использовали метод Кристенсена в модификации О'Туле [Christensen et al., 1985; OToole, 2011], основанный на спек-трофотометрической оценке количества, связанного с биопленкой 1%-ного раствора кристаллического фиолетового. В лунки микротитровального планшета заливали 13 мкл красителя и 87 мкл физраствора, по истечении 40 минут лунки отмывали дистиллированной водой, затем добавляли 96%-ный спирт по 100 мкл. Оценку плен-кообразования проводили измерением оптической плотности с помощью планшет-
ного ридера Labsystems iEMS Reader MF (Biorad) при длине волны 540 нм.
Определение жизнеспособности бактерий осуществляли посредством их высева на чашки Петри. Подсчет выросших колоний производили после 24 часов культивирования при температуре 37°С.
Токсикологические методы. Кинетика ингибирования роста и размножения в биологических популяциях сложна и достаточно разработана лишь для популяций микроорганизмов, когда торможение ростовых процессов можно свести к ингибированию отдельных ферментативных реакций или транспортных систем соответственно. Уравнения, описывающие торможение роста клеток в зависимости от концентрации ингибитора, подобны уравнениям ферментативной кинетики [Евдокимов, 2001]. При наличии кооперативных эффектов при ингибировании расчет проводили по модифицированному уравнению Иерусалимского:
"( * К
In + K"
(1)
где г (£, I) - удельная скорость роста популяции;
£ - концентрация лимитирующего субстрата;
I - концентрация ингибитора;
К - константа насыщения для данного субстрата;
К1 - константа ингибирования;
п - коэффициент нелинейности инги-бирования, который показывает чувствительность тестируемого штамма к токсиканту. Константа ингибирования численно равна той концентрации ингибитора, при которой скорость роста популяции уменьшается вдвое.
Кинетика, соответствующая модифицированному уравнению Иерусалимского,
наиболее часто встречается при ингибиро-вании роста микроорганизмов различными антибиотиками, ксенобиотиками и ионами тяжелых металлов.
Зависимость удельной скорости роста популяции от контроля рассчитывали по уравнению Иерусалимского:
ln
Л
^-1
V -
= n ■ ln I - n ■ ln K
(2)
у
где г0 - удельная скорость роста популяции при нулевой концентрации ингибитора;
г1 - удельная скорость роста популяции при концентрации ингибитора, равной I.
Интенсивность биопленкообразования в присутствии исследуемых веществ, а также без них, оценивали на экспоненциальной фазе биопленочной популяции, основываясь на данных оптической плотности. Вычисляли натуральный логарифм усредненных значений оптической плотности. Далее определяли удельную скорость роста бактерий при разных концентрациях тестируемых веществ по формуле:
Ц =
ln X, - ln X0
T - T
T To
(3)
где Х0 и Х1 - значения биомассы, соответствующие времени роста Т0 и Т\.
В некоторых случаях удельная скорость роста может превосходить контрольные значения, что указывает на стимуляцию роста исследуемым веществом.
Для определения коэффициента нелинейности ингибирования (п) и полулетальной дозы (ЛД50) рассчитывают параметры
Í,
уравнения Иерусалимского ln
Л
-1
г
V'
и 1п I. Высчитанные параметры позволяют графически определить значения нелинейности ингибирования и полулетальной до-
зы. Она высчитывается исходя из пересечения регрессионной прямой с осью удельной скорости роста. Ошибку полулетальной дозы рассчитывали по формуле Миллера и Тейнтера:
™лд50 =-
ЛД84 - ЛД >/2Ñ
(4)
где ЛД84 и ЛД16 - дозы, вызывающие гибель 84 и 16% популяции;
N - общее исходное количество исследуемых объектов [Платонов, Ахалая, 2010].
Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Визуализацию структуры биопленок и оценку воздействия водорослей на патогенные бактерии проводили при помощи сканирующего электронного микроскопа EVO 40 (Carl Zeiss AG (Германия)).
Пробоподготовка для СЭМ: сформировавшиеся биопленки дважды промывали в стерильном фосфатно-буферном растворе (PBS) в течение 10-15 минут для того, чтобы убрать остатки среды и планктонные клетки. Фиксировали биопленку с использованием 2%-ного раствора глутаро-вого альдегида, время фиксации - 2-4 часа. Фиксацию производили при низких температурах (4-5°С). Обезвоживание проб проводили в серии концентраций этилового спирта по 10-15 минут для каждой концентрации. Окончательное обезвоживание проб делали в спирте с максимальной концентрацией (96%) в течение 15 минут. После обезвоживания препарат сушился на воздухе в течение 5 минут [Марданова и др., 2016].
Перед сеансом электронной микроскопии производилось напыление покрытия золотом на поверхность образцов с использованием установки Q150TES (Quorum Technologies). Исследования выполнялись на базе Центра коллективного пользования
«Дальневосточный центр электронной микроскопии» ННЦМБ ДВО РАН. Съемка проводилась в режиме высокого вакуума при 2 кВ.
Статистическая обработка данных.
Представленные в работе данные являлись средними не менее чем из трех повторно-стей. Рассчитаны средние значения и стандартные отклонения. Обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Office Excel 2007.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние метаболитов микроводорослей на Staphylococcus aureus штамм 6539. В нашей работе во всех контрольных ячейках планшета S. aureus формировала плотную биопленку, которая активно окрашивалась по методу Кристенсена. Некоторые авторы также показали, что все тестируемые изоляты S. aureus были способны образовывать биопленки на поверхностях, контактирующих с пищевыми продуктами. Формирование биопленки происходило преимущественно на полистироле (в сравнении с другими материалами, в частности из нержавеющей стали) [da Silva Meira et al., 2012; de Souza et al., 2014; den Reijer et al., 2016]. Ученые из Индии предположили, что гидрофобность полистирола является благоприятным фактором для формирования биопленок штаммами S. aureus [Pagedar et al., 2010].
В результате проведенных нами экспериментов экзогенные вещества, выделенные из микроводорослей A. tamarense ATRU-16 и A. affine AFRU-12, не оказывали выраженного эффекта на рост S. aureus 6539. Экзометаболиты H. akashiwo HAK-SR11 и P. foraminosum PrRUS_7 подавляли интенсивность биопленкообразования данного штамма на полистироле. Тем не менее для подавления половины популяции
S. aureus метаболитов H. akashiwo потребовалось меньше, что показано в таблице 1. Многими авторами представлены сведения об антимикробных свойствах одноклеточных водорослей, метаболиты которых в низких концентрациях воздействовали на численность стафилококка в биопленке и планктонной форме [Ordog, 1999; Bhaga-vathy et al., 2011]. Угнетение численности бактерий в биопленке соединениями, выделенными из культуральной среды рафи-дофитовой водоросли H. akashiwo, вероятно, связано с продукцией веществ, вырабатываемых в целях защиты от бактерий [Al-Hashimi et al., 2016].
Из всех исследуемых эндометаболитов альгокультур выявлен единственный случай подавления биопленкообразования S. aureus 6539 на полистироле при культивировании P. foraminosum, что согласуется с ответом данного штамма на экзогенные вещества (табл. 1 и 2). Действие продуктов метаболизма микроводорослей рода Proro-centrum можно связать с их способностью синтезировать уникальные соединения [Valdiglesias et al., 2013; Larsson et al., 2019]. Тем не менее метаболиты, полученные из культуральной среды микроводорослей, угнетали процесс образования биопленки S. aureus эффективнее (табл. 2). Известно, что водоросль P. foraminosum локализуется на макрофитах [Селина, 2017], что может свидетельствовать о возникновении конкурентных взаимоотношений с бактериями-эпифитами, следовательно, литературные данные и результаты собственных исследований позволяют предположить, что микроводоросли способны секретировать соединения, обладающие антимикробными свойствами [Гольдин, 2013].
При визуализации S. aureus с помощью сканирующей электронной микроскопии в контрольном образце обнаружена плотная биопленка, на гладкой поверхности
которой расположены клетки округлой формы, собранные в кластеры. Между отдельными клетками проявляются структуры матрикса, способствующие связи бактерий друг с другом (рис. 1, А).
При добавлении метаболитов, выделенных из культуральной среды H. akashiwo и P. foraminosum, на многих участках выявлено разрушение биопленочного матрикса (рис. 1, Б), а также глубокие «провалы» с выходом микробной массы на поверхность (рис. 1, В). Мишенью для экзогенных соединений P. foraminosum в первую очередь стали бактерии, покинувшие биопленку для расселения, и клеточная поверхность которых в результате была частично деформирована (рис. 1, Г). Некоторыми исследователями также замечена антимикробная активность метаболитов водорослей против S. аureus,
проявляющаяся уменьшением численности бактериальной культуры, а также деструкцией биопленочного матрикса [Al-Hashimi et al., 2016].
Добавление эндогенных соединений H. akashiwo приводило к утолщению биопленки. Наблюдалось меньшее количество кластеров на поверхности (по сравнению с контролем), что, возможно, связано с нарастанием слоев и увеличением биомассы матрикса, который покрывает бактериальные клетки. Биопленки на некоторых участках пронизаны каналами, выступающими на поверхность экзогенной части (рис. 1, Д). Ранее показано, что в состав метаболитов микроводорослей входили соединения, являющиеся предпочтительным субстратом для интенсивного роста и адгезии бактерий, в том числе и S. aureus [Kaplan et al., 2004; Fagerlund et al., 2016].
Таблица 1. Действие экзометаболитов микроводорослей на формирование биопленки патогенных бактерий
Table 1. Effect of microalgae exometabolites on the formation of biofilms pathogenic bacteria
Наименование бактериального штамма Параметры воздействия на биопленку Экзометаболит микроводоросли
Heterosigma akashiwo HAK-SR11 Prorocentrum foraminosum PrRUS 7 Alexandrium tamarense ATRU-16 Alexandrium üffme AFRU-12
Staphylococcus aureus 6539 Тип воздействия Ингибирование Ингибирование Нет влияния Нет влияния
П 0,625* 1,804 0,466 0,176
ЛД50, кл/мл (1,7 ± 0,09) х 103 (2,6 ± 0,11) х 103 - -
Listeria monocytogenes 310 8078 B-4835/6 Тип воздействия Стимулирование Стимулирование Ингибирование Нет влияния
П - - 0,577 0,213
ЛД50, кл/мл - - (1,6 ± 0,06) х 103 -
Listeria monocytogenes 315 9852 B-6144/1,4,6 Тип воздействия Ингибирование Ингибирование Нет влияния Нет влияния
П 0,524 0,965 0,488 0,384
ЛД50, кл/мл (1,7 ± 0,12) х 103 (3,2 ± 0,2) х 103 - -
Salmonella enteridis Тип воздействия Ингибирование Стимулирование Стимулирование Нет влияния
п 0,600 - - 0,425
ЛД50, кл/мл (4,0 ± 0,15) х 103 - - -
Окончание табл. 1
Наименование бактериального штамма Параметры воздействия на биопленку Экзометаболит микроводоросли
Heterosigma akashiwo HAK-SR11 Prorocentrum foraminosum PrRUS 7 Alexandrium tamarense ATRU-16 Alexandrium affine AFRU-12
Salmonella typhimurium 3695 Тип воздействия Ингибирование Ингибирование Ингибирование Стимулирование
П 0,839 0,766 1,035 -
ЛД50, кл/мл (1,0 ± 0,07) х 103 (4,9 ± 0,11) х 103 (1,2 ± 0,08) х 103 -
Escherichia coli 1147 Тип воздействия Нет влияния Стимулирование Ингибирование Стимулирование
п 0,468 - 1,376 -
ЛД50, кл/мл - - (1,525 ± 0,04) х 103 -
* n > 0,5 свидетельствует о том, что процесс ингибирования был существенным.
* n > 0,5 indicates that the inhibition process was significant.
Таблица 2. Действие эндометаболитов микроводорослей на формирование биопленки патогенных бактерий
Table 2. The effect of microalgal endometabolites on the formation of pathogenic bacteria biofilms
Наименование бактериального штамма Параметры воздействия на биопленку Эндометаболит микроводоросли
Heteгosigma akashiwo ИЛК-8К11 Prorocentrum foraminosum PrRUS 7 Alexandгium tamaгense ЛТШ-16 Alexandrium affine AFRU-12
Staphylococcus aureus 6539 Тип воздействия Стимулирование Ингибирование Нет влияния Нет влияния
П - 0,554 0,287 0,194
ЛД50, кл/мл - (1,7 ± 0,19) х 103 - -
Listeria monocytogenes 310 8078 B-4835/6 Тип воздействия Нет влияния Ингибирование Нет влияния Ингибирование
П 0,344 2,356 0,404 0,510
ЛД50, кл/мл - (2,3 ± 0,08) х 103 - (5,4 ± 0,14) х 103
Listeria monocytogenes 315 9852 B-6144/1,4,6 Тип воздействия Нет влияния Ингибирование Нет влияния Стимулирование
П 0,384 0,781 0,287 -
ЛД50, кл/мл - (1,9 ± 0,09) х 103 - -
Salmonella enteridis Тип воздействия Ингибирование Ингибирование Нет влияния Нет влияния
П 0,510 0,727 0,213 0,488
ЛД50, кл/мл (7,8 ± 0,07) х 103 (3,9 ± 0,03) х 103 - -
Salmonella typhimurium 3695 Тип воздействия Ингибирование Нет влияния Нет влияния Нет влияния
П 0,577 0,445 0,500 0,496
ЛД50, кл/мл (3,1 ± 0,09) х 103 - - -
Escherichia coli 1147 Тип воздействия Нет влияния Ингибирование Ингибирование Стимулирование
п 0,494 1,732 1,600 -
ЛД50, кл/мл - (2,3 ± 0,07) х 103 (1,5 ± 0,07) х 103 -
* n > 0,5 свидетельствует о том, что процесс ингибирования был существенным.
* n > 0,5 indicates that the inhibition process was significant.
Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия трехсуточной биопленки, образованной Staphylococcus aureus при добавлении метаболитов микроводорослей: А - контрольный образец биопленки. Стрелками обозначены бактериальные клетки, собранные в кластеры (1а), и структура матрикса, связывающая бактерии друг с другом (26); Б - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Heterosigma akashiwo. Стрелками показано разрушение участков биопленочного матрикса (1б, 2б); В - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Prorocentrum foraminosum. Разрушенная часть биопленки с выходом микробной массы наружу (1в); Г - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Prorocentrum foraminosum. Стрелки обозначают деформированные клетки под действием метаболитов (1г, 2г); Д - изменение биопленки при стимуляции эндометаболитами Heterosigma akashiwo: наложение слоев марикса (1д), каналы матрикса, выступающие на поверхность биопленки (2д)
Fig. 1. Scanning electron microscopy of a three-day-old biofilm formed by Staphylococcus aureus with the addition of microalgae metabolites: A - control biofilm sample. Arrows indicate bacterial cells collected in clusters (la), and the matrix structure that binds bacteria to each other (2б); Б - changes in the biofilm structure upon inhibition by exometabolites of Heterosigma akashiwo. The arrows show the destruction of biofilm matrix areas (1б, 2б); В - changes in the biofilm structure upon inhibition by Prorocentrum foraminosum exometabolites. The destroyed part of the biofilm with the release of the microbial mass outside (1в); Г - changes in the biofilm structure upon inhibition by Prorocentrum foraminosum exometabolites. Arrows indicate deformed cells under the action of metabolites (1г, 2г); Д - changes in the biofilm upon stimulation with Heterosigma akashiwo endometabolites: superimposition of marix layers (1д), matrix channels projecting onto the biofilm surface (2д)
Влияние метаболитов микроводорослей на Listeria monocytogenes штаммы 310 8078 B-4835/6, 315 9852 B-6144/1, 4, 6.
В нашем эксперименте в контрольных образцах обнаружено массивное развитие биопленки L. monocytogenes на полистироле. Известно, что полимерные поверхности обеспечивают более быстрое развитие и прочное закрепление биопленок L. mono-cytogenes, их намного сложнее дезинфицировать, чем поверхности из иных материалов [Poimenidou et al., 2016].
Механизмы действия экзометаболитов альгокультур в отношении биопленкообра-зования L. monocytogenes оказались штамм-специфичны. Однако в некоторых случаях наблюдался прямо противоположный эффект (см. табл. 1).
Влияние экзогенных веществ на L. monocytogenes 310 8078 B-4835/6 выражалось слабым ингибирующим воздействием. Единственный случай подавления L. monocytogenes 310 8078 B-4835/6 зафиксирован при внесении внеклеточных веществ A. tamarense (см. табл. 1). Культивирование L. monocytogenes 315 9852 B-6144/1, 4, 6 на полистироле с экзометаболитами H. akashiwo, P. foraminosum показало угнетение роста патогенных бактерий. Однако необходимо выделить, что наименьшая полулетальная доза зарегистрирована для вида H. akashiwo (см. табл. 1). Существует предположение о том, что в состав метаболитов микроводорослей входят вещества, которые выступают в качестве ингибиторов и одновременно служат компонентами питания для листерий [Терехова и др., 2009].
Ответные реакции разных штаммов листерий на эндометаболиты, изолированные из клеточной биомассы водорослей, отличались. Наблюдалось подавление роста L. monocytogenes 315 9852 B-6144/1, 4, 6 эндометаболитами P. foraminosum, что также подтверждает активность продуктов метаболизма, выделенных из надосадоч-
ной жидкости. Следует отметить, что для предотвращения биопленкообразования половины популяции листерий на полистироле эндогенных соединений P. foraminosum потребовалось меньше, чем метаболитов, полученных от других микроводорослей. Внутриклеточные соединения от других тестируемых видов водорослей не оказали выраженного действия на развитие биопленки L. monocytogenes 315 9852 B-6144/1, 4, 6. Ингибирование биопленки L. monocytogens 310 8078 B-4835/6 эндоме-таболитами индивидуально и не соотносится с данными, полученными при культивировании с внеклеточными соединениями водорослей (см. табл. 2).
При визуализации с помощью СЭМ штаммы листерий в контрольных образцах формировали прочную ригидную биопленку, на поверхности которой расположены хорошо различимые одиночные палочковидные клетки. Нативная структура биопленок L. monocytogenes была сглаженной и структурированной (рис. 2 и 3, А).
Морфологическая картина биопленок стафилококка и листерий при добавлении альгометаболитов отличается характером разрывов и структурой (рис. 1 и 2).
При культивировании L. monocytogenes 3108078B-4835/6 с клеточными экстрактами P. foraminosum и A. affine в структуре биопленки отмечены разломы, в некоторых из исследуемых частей биопленочный матрикс слоистый (рис. 2, Б и В). На рисунке 2, Б, представлена биопленка со своеобразным рельефом, который выражается слоистостью, в некоторых разрушенных частях выявляются клетки, частично погруженные в матрикс. Нарушение целостности биопленки прослеживается на рисунке 2, В, видны гидролизованные участки матрикса. По данным литературных источников, P. foraminosum способен внутрикле-точно продуцировать динофизистоксин (DTX), относящийся к группе диарейных
токсинов [Селина, 2017; Kameneva et al., 2015]. Следует отметить, что на рисунке 2, Г при воздействии экзометаболитов H. aka-shiwo на поверхности биопленки обнаружены частично фрагментированные, а иногда мертвые клетки, что, по-видимому, является следствием токсического воздействия метаболита.
Также выявлено действие некоторых из тестируемых метаболитов, увеличивающих плотность, слоистость и ярусность биопленок L. monocytogenes 3108078B-4835/6 (рис. 2, Д). На поверхности биопленочных структур чаще наблюдали кластеры из клеток, чем одиночные палочки, что свидетельствовало о стимуляции бактериального роста экзометаболитами H. akashiwo. Зафиксирована ригидная биопленка, густо заселенная бактериальными клетками, которые, по всей видимости, находятся в преддисперсионной стадии (рис. 2, Д).
Следует выделить существенные различия в ответе штаммов листерий на внесенные метаболиты микроводорослей. Различия зафиксированы в характере разрывов биопленки L. monocytogenes 3108078B-4835/6 и L. monocytogenes 3159852B-6144/1, 4, 6. При этом у последнего штамма биопленочный матрикс подвергся большему воздействию экзометаболитов одноклеточных водорослей: матрикс менее слоистый с ярко выраженной фенестрацией в некоторых зонах (рис. 3, Б и Г).
При культивировании листерий с эн-дометаболитами P. foraminosum проявляется грубый дефект структуры в виде глубокого «разреза» (рис. 3, Б и В). В случае экзогенных соединений H. akashiwo выявлено нарушение матрикса, приводящее к отторжению биопленочных структур, поверхность биопленки становилась неровной, матрикс в местах разрушения представлял собой неструктурированную рыхлую отслаиваемую субстанцию (рис. 3, Г).
Влияние метаболитов микроводорослей на Salmonella enterica, серотипы enteridis и typhimurium. В нашей работе оба серотипа Salmonella формировали прочную биопленку в контрольных лунках планшета из полистирола. Известно, что серотипы Salmonella - это преимущественно гидрофильные штаммы, но они также обладают способностью к формированию биопленок на гидрофобных поверхностях, состоящих преимущественно из пластика (полистирол и поливинилхлорид) [Stepanovic et al., 2004; Abdallah et al., 2014].
В отношении S. enteridis обнаружено подавление биопленкообразования на полистироле при выращивании микроорганизмов с продуктами, полученными из культураль-ной среды H. akashiwo. Нейтральное действие на S. enteridis оказывали экзометаболиты A. affine (см. табл. 1). Действие одних и тех же альгометаболитов на биопленкообразова-ние сальмонелл на полистироле видоспеци-фично. Исключение составили межклеточные соединения, продуцируемые H. akashiwo, при внесении которых наблюдалось угнетение роста бактерий. Наибольшему ингиби-рованию экзометаболитами H. akashiwo, P. foraminosum, A. tamarense подверглась S. typhimurium 3695. Наименьшее значение полулетальной дозы зафиксировано у видов H. akashiwo и A. tamarense (см. табл. 1).
Вещества, изолированные из клеточной массы микроводорослей, угнетали процесс образования биопленки бактерий рода сальмонелл на полистироле. Однако и экзо-, и эндометаболиты рафидофитовой водоросли H. akashiwo подавляли рост S. enteridis (см. табл. 2). Микроводоросли класса Raphidophyceae содержат в своем составе фукоксантин, который негативно воздействует на бактерии в биопленке и планктонной форме [Yasumoto, 1988; Paola et al., 2017]. Внутриклеточные соединения из P. foraminosum также приостанавливали развитие S. enteridis.
Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия трехсуточной биопленки, образованной Listeria monocytogenes 3108078B-4835/6 при добавлении метаболитов микроводорослей: А - контрольный образец биопленки. Стрелками обозначены бактериальные клетки, собранные в кластеры (1а), и структура матрикса, связывающая бактерии друг с другом (2а); Б - изменение структуры биопленки при ингибировании эндо-метаболитами Alexandrium affine; В - изменение структуры биопленки при ингибировании метаболитами Prorocentrum foraminosum: трещины в биопленочной структуре (1в), раскрошенный слой матрикса биопленки (2в); Г - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Prorocentrum foraminosum: мертвые и частично разрушенные клетки листерий (1г); Д - изменение структуры биопленки при стимуляции бактериального роста экзометаболитами Heterosigma akashiwo
Fig. 2. Scanning electron microscopy of a three-day old biofilm Listeria monocytogenes 3108078B-4835/6 with the addition of microalgae metabolites: A - control biofilm sample. Arrows indicate bacterial cells collected in clusters (1a) and the matrix structure that binds bacteria to each other (2а); Б - changes in the biofilm structure upon inhibition by Alexandrium affine endometabolites; В - Ganges in the biofilm structure upon inhibition metabolites by Prorocentrum foraminosum: cracks in the biofilm structure (1в), crumbled biofilm matrix layer (2в); Г - Ganges in the biofilm structure upon inhibition by Prorocentrum foraminosum exometabolites: dead and partially destroyed Listeria cells (1г); Д - Ganges in the biofilm structure upon stimulation of bacterial growth with exometabolites Heterosigma akashiwo
Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия трехсуточной биопленки, образованной Listeria monocytogenes 3159852B-6144/1, 4, 6 при добавлении метаболитов микроводорослей: А - контрольный образец биопленки Listeria monocytogenes 3159852B-6144/1, 4, 6. Стрелка (1а) демонстрирует клетки листерий, расположенные в матриксе; Б - изменение структуры биопленки при ингибировании эндометаболитами Prorocentrum foraminosum. Фенестрация биопленки листерий показана стрелкой (16); В - изменение структуры биопленки при ингибировании Prorocentrum foraminosum. Стрелкой обозначена рыхлая разрушенная биопленка, образованная посредством добавления метаболитов микроводорослей (1в); Г - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Heterosigma akashiwo. Стрелкой (1г) показаны места разрушения биопленки и частичное отслаивание структур матрикса
Fig. 3. Scanning electron microscopy of a three-day-old biofilm formed by Listeria monocytogenes 3159852B-6144/1, 4, 6 with the addition of microalgae metabolites: A - control sample of Listeria monocytogenes 3159852B-6144/1, 4, 6 biofilm. Arrow (1a) shows Listeria cells located in the matrix; E - changes in the biofilm structure upon inhibition by Prorocentrum foraminosum endometabolites. Fenestration of the Listeria biofilm is shown by an arrow (1b); B - changes in the biofilm structure upon Prorocentrum foraminosum inhibition. The arrow indicates a loose destroyed biofilm formed by the addition of microalgae metabolites (1e); r - changes in the biofilm structure upon inhibition by Heterosigma akashiwo exometabolites. The arrow (1g) shows the sites of biofilm destruction and partial exfoliation of matrix structures
Обнаружено несколько закономерностей при культивировании & typhimurium с разными типами альгометаболитов. Эн-дометаболиты H. akashiwo, как и в случае экзогенных веществ, подавляли биоплен-кообразование сальмонелл на полистироле, при этом значения полулетальной дозы для этих видов альгокультур были схожими (см. табл. 2).
В научных публикациях имеются сведения об активности клеточных экстрактов диатомовых водорослей, которые угнетали рост S. typhimurium [Yasumoto, 1988; Paola et а!., 2017]. Предполагается, что воздейст-
вие этой группы связано с продукцией полиэфиров. Ингибирующее влияние экзо-и эндометаболитов разных типов микроводорослей на сальмонеллы выявили и другие исследователи [Walter, Mahesh, 2000; Ghasemi et al., 2007; Bhagavathy et al., 2011]. Ранее было установлено, что главным механизмом ингибирования сальмонелл являются жирные кислоты микроводорослей [Findlay, Patil, 1984].
С помощью СЭМ сальмонеллы визуализировались как палочковидные клетки, прочно объединенные ригидным матриксом, пронизанным каналами, устья которых
выступали на внешнюю часть биопленки (рис. 4, А). Биопленка, образованная представителями сальмонелл, прочная; известно, что в состав их матрикса входит полимер целлюлозы, который, по мнению авторов, придает ригидность и говорит о принадлежности бактерий к группе кишечных патогенов [Kaplan, 2010] (рис. 4 и 5).
Внесение экзометаболитов H. akashiwo к культуре S. enteridis приводило к частичному «слущиванию» наружнего покрова биопленочной структуры (рис. 4, Б). Следует отметить уменьшение плотности и сглаженности биопленки по сравнению с контрольным образцом (рис. 4, Б). Метаболиты P. foraminosum приводили к десквамации
матрикса, придавая рыхлость и образуя разрывы, что, по-видимому, свидетельствует об антибиопленочных свойствах тестируемых микроводорослей (рис. 4, В и Г).
Выраженных отличий в характере ингибирования метаболитами микроводорослей для разных видов сальмонелл не обнаружено (рис. 4 и 5). Биопленка, образованная S. typhimurium 3695, была подвержена разрушению экзометаболитами P. foraminosum, A. tamarense (рис. 5, В и Г) и эндометаболитами H. akashiwo (рис. 5, Б). На рисунках 5, В и Г выявлено отслаивание структур биопленочного материала, впоследствии приводящее к рыхлости и замедленному развитию биопленки.
Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия трехсуточной биопленки, образованной Salmonella enteridis при добавлении метаболитов микроводорослей: А - контрольный образец биопленки Salmonella enteridis. Стрелкой (1а) показаны устья каналов, выходящие на поверхность биопленки; Б - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Heterosigma akashiwo. Стрелки (1б) демонстрируют слущивание наружнего слоя биопленки; В - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Prorocentrum foraminosum; Г - изменение структуры биопленки при ингибировании эндо-метаболитами Prorocentrum foraminosum
Fig. 4. Scanning electron microscopy of a three-day biofilm formed by Salmonella enteridis with the addition of microalgal metabolites: A - control sample of Salmonella enteridis biofilm. Arrow (1a) shows the mouths of the channels emerging on the surface of the biofilm; Б - changes in the biofilm structure upon inhibition by Heterosigma akashiwo exometabolites. Arrows (16) show sloughing of the outer layer of the biofilm; В - changes in the biofilm structure upon inhibition by Prorocentrum foraminosum exometabolite; Г - change in the biofilm structure upon inhibition by Prorocentrum foraminosum endometabolites
Рис. 5. Сканирующая электронная микроскопия трехсуточной биопленки, образованной Salmonella typhi-murium 3695 при добавлении метаболитов микроводорослей: А - контрольный образец биопленки Salmonella typhimurium 3695; Б - изменение структуры биопленки при ингибировании эндометаболитами Heterosigma akashiwo; В - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Prorocentrum fora-minosum; Г - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Alexandrium tamarense. Стрелками (1г) обозначены разрушенные клетки под воздействием метаболитов
Fig. 5. Scanning electron microscopy of a three-day biofilm formed by Salmonella typhimurium 3695 with the addition of microalgae metabolites: A - a control sample of the biofilm Salmonella typhimurium 3695; Б - a change in the structure of the biofilm when inhibited by Heterosigma akashiwo endometabolites; B - a change in the structure of the biofilm when inhibited by exometabolites of Prorocentrum foraminosum; Г - modification of the biofilm structure when inhibited by Alexandrium tamarense exometabolites. Arrows (1г) indicate destroyed cells under the influence of metabolites
Влияние метаболитов микроводорослей на Escherichia coli штамм 1147.
Многие исследования показали, что штаммы E. coli могут прикрепляться к различным поверхностям, включая тефлон, полистирол, полипропилен, ПВХ и другие биотические поверхности. Гидрофобность материала поверхности играет важную роль в образовании биопленок у этого вида [Carter et al., 2016].
В нашем исследовании обнаружено угнетение биопленкобразования E. coli на полистироле при внесении экзогенных соединений A. tamarense. Наибольший инги-бирующий эффект оказывали представители микроводорослей P. foraminosum. В то же время стоит отметить разный эффект альгометаболитов на бактерии, отличия обнаружены не только на уровне видов, но
и штаммов (см. табл. 1). Известно, что микроводоросли в процессе жизнедеятельности синтезируют множество биоактивных веществ, которые могут использоваться бактериями в качестве стимуляторов роста, а также выступать в роли ингибиторов. Подобные вещества, влияющие на развитие патогенов, имеют сходство в строении и могут проявлять разную биологическую активность, их действие зависит от концентрации [Yamasaki et al., 2009]. Необходимо подчеркнуть, что E. coli была устойчива к экзометаболитам H. akashiwo и P. foraminosum, тем не менее вещества из культуральной среды A. tamarense подавляли формирование биопленки кишечной палочкой (см. табл. 1). Полученный эффект можно соотнести с тем, что представители
Alexandrium способны запускать вторичный метаболизм, продуцируя при этом соединения, аллелопатические свойства которых уже доказаны [Long et al., 2021].
В случае с E. coli внутриклеточные вещества P. foraminosum и A. tamarense приостанавливали процесс образования биопленки на полистироле (см. табл. 2). Зафиксирован единообразный ответ на разные типы метаболитов A. tamarense. Угнетение бактерий группы кишечной палочки эндометаболитами динофитовых водорослей, к которым относится A. tamarense и P. foraminosum, может быть связано с продукцией полисахаридов и жирных кислот [Walter, Mahesh, 2000; Herrero et al., 2006; Abedin, Taha, 2008; Mendiola et al., 2008; Santoyo et а!., 2009]. Обнаружена устойчивость E. coli к обоим типам метаболитов H. akashiwo, которые в большинстве случаев обладали бактерицидной активностью (см. табл. 1 и 2). При добавлении экзо -и эндогенных соединений A. affine выявлено увеличение численности E. coli. Остальные случаи воздействия альгометаболитов на бактерии были единичными.
При использовании СЭМ в контрольных образцах E. coli выявлена плотная ровная биопленка, объединенная матриксом, на поверхности которого прослеживались палочковидные клетки (рис. 6, А). Получен инги-бирующий ответ E. coli на метаболиты A. tamarense (см. табл. 1 и 2). Рисунок 6, Б демонстрирует негативное воздействие эндогенных соединений A. tamarense на E. coli. Обнаружены трещины и углубления, сопровождающиеся раскрошенными частями биопленочных слоев (рис. 6, Б). Внеклеточные вещества, изолированные из микроводоросли A. tamarense, приводили к разложению компонентов матрикса E. coli. Кроме того, наблюдались разломы структур, представляющие собой «глыбы», распространенные по поверхности биопленки (рис. 6, В).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований обнаружено, что экзометаболиты микроводорослей по-разному воздействовали на патогенные бактерии. Так, они ингиби-ровали рост микроорганизмов в 42% проведенных опытов, в 29% стимулировали и в 29% оказывали нейтральное действие. Наиболее эффективными оказались внеклеточные соединения H. akashiwo HAK-SR11, угнетающие рост всех бактерий (при коэффициенте нелинейности ингибирования (n) от 0,524 до 0,839), и P. foraminosum PrRUS_7 n = 0,776-1,804). Необходимо отметить увеличение численности некоторых бактерий при культивировании с внеклеточными веществами A. tamarense ATRU-16, а также стимуляцию бактериального роста экзометаболитами A. affne AFRU-12.
Выявлено, что эндометаболиты микроводорослей угнетали тестируемые бактерии в 38% выполненных экспериментов, в 12% стимулировали, в 50% не влияли на рост. Наилучший результат угнетения роста патогенных микроорганизмов обнаружен при культивировании с эндогенными веществами P. foraminosum PrRUS_7 (n = 0,554-2,356). Также зафиксированы единичные случаи повышения бактериальной численности внутриклеточных веществ H. akashiwo HAK-SR11 и A. affine AFRU-12.
При использовании сканирующей электронной микроскопии не выявлено существенной разницы в механизме действия экзо-и эндометаболитов на биопленки патогенных бактерий. Основные изменения биопленочной структуры при добавлении альгоме-таболитов зависели от особенностей бактерий образовывать биопленку. Воздействие метаболитов выражалось деформацией бактериальных клеток и матрикса, провалами, расслаиванием структур и разрывами биопленки. Характер подобных изменений зависел от видовой принадлежности бактерий.
Рис. 6. Сканирующая электронная микроскопия трехсуточной биопленки, образованной Escherichia coli 1147 при добавлении метаболитов микроводорослей: А - контрольный образец биопленки Escherichia coli 1147; Б - изменение структуры биопленки при ингибировании эндогенными соединениями Alexandrium tamarense; В - изменение структуры биопленки при ингибировании экзометаболитами Alexandrium tamarense
Fig 6. Scanning electron microscopy of a three-day biofilm formed by Escherichia coli 1147 with the addition of microalgae metabolites: A - a control sample of the biofilm Escherichia coli 1147; Б - a change in the structure of the biofilm when inhibited by endogenous compounds of Alexandrium tamarense; B - a change in the structure of the biofilm when inhibited by exometabolites of Alexandrium tamarense
ЛИТЕРАТУРА REFERENCES
Бузолева Л.С. 2011. Микробиологическая оценка качества природных вод, летняя учебно-полевая практика. Учебное пособие. Владивосток. 88 с. Buzoleva L.S. 2011. Microbiological assessment of the quality of natural waters, summer field practice. Study guide. Vladivostok. 88 p. (in Russian).
Гольдин Е.Б. 2013. Биологическая активность микроводорослей и ее значение в межвидовых взаимоотношениях. Экосистемы, их оптимизация и охрана. № 9. С. 49-76.
Goldin E.B. 2013. Biological activity of microalgae and its significance in interspecific relationships. Ekosistemy, ih opti-
mizaciya i ohrana (Optimization and Protection of Ecosystems). № 9. P. 49-76. (in Russian).
Евдокимов Е.В. 2001. Динамика популяций в задачах и решениях. Учебное пособие. Томск: Томский государственный университет. 72 с.
Evdokimov E. V. 2001. Population dynamics in problems and solutions. Study book. Tomsk: Tomsk State University Publ. 72 p. (in Russian).
Марданова А.М. Кабанов Д.А., Рудакова Н.Л., Шарипова М.Р. 2016. Биопленки: основные принципы организации и методы исследования. Учебно-методическое пособие. Казань: Казанский федеральный университет. 42 с. Mardanova A.M., Kabanov D.A., Ruda-kova N.L., Sharipova M.R. 2016. Biofilms:
basic principles of organization and research methods. Guidance manual. Kazan: Kazan Federal University Publ. 42 p. (in Russian).
Платонов А.Г., Ахалая М.Я. 2010. Применение метода пробит-анализа в радиобиологии. Расчет полулетальной дозы ЛД50. Учебно-методическое пособие. Москва: Национальный исследовательский ядерный университет. 36 с. Platonov A.G., Akhalaya M.Ya. 2010. Application of the probit analysis method in radiobiology calculation of the half-year dose of LD50. Guidance manual. Moscow: National Research Nuclear University. P. 36 (in Russian).
Селина М.С. 2017. Морфология и сезонная динамика потенциально токсичной микроводоросли Prorocentrum foraminosum Faust 1993 (Dinophyta) в заливе Петра Великого Японского моря. Биология моря. Т. 43. № 3. С. 169-174. SelinaM.S. 2017. The morphology and seasonal dynamics of the potentially toxic microalga Prorocentrum foraminosum Faust 1993 (Dinophyta) in Peter the Great Bay, the Sea of Japan. Russian Journal of Marine Biology. Vol. 43. №. 3. P. 196-201.
Терехова В.Е., Айздайчер Н.А., Бузолё-ва Л.С., Сомов Г.П. 2009. Влияние метаболитов морских микроводорослей на размножение бактерий вида Listeria monocytogenes. Биология моря. Т. 35. № 4. С. 306-309.
Terekhova V.E., Aizdaicher N.A., Buzole-va L.S., Somov G.P. 2009. Influence of extrametabolites of marine microalgae on the reproduction of the bacterium Listeria monocytogenes. Russian Journal of Marine Biology. Vol. 35. №. 4. P. 355-358.
Терпиловский М.А. 2014. Биологическая химия. Учебно-методическое пособие.
Ульяновск: Ульяновский государственный университет. 246 с. Terpilovsky M.A. 2014. Biological Chemistry. Guidance manual. Ulyanovsk: Ulyanovsk State University. 246p. (in Russian).
Abdallah F.B., Lagha R., Said K. et al. 2014. Detection of cell surface hydro-phobicity, biofilm and fimbirae genes in Salmonella isolated from tunisian clinical and poultry meat. Iranian Journal of Public Health. Vol. 43. № 4. P. 423-431.
Abedin R.M.A., Taha H.M. 2008. Antibacterial and antifungal activity of cyanobacte-ria and green microalgae. Evaluation of medium components by Plackett-Burman design for antimicrobial activity of Spiru-lina platensis. Global Journal of Biotechnology and Biochemistry. Vol. 1. № 3. P. 22-31.
Al-Hashimi А., Abdu-Allah S.N., Al-Rrudaai G., Mansur R.F. 2016. The effect of microalgae extraction on bacterial species isolated from seminal fluid of sexually -active males in Baghdad. Journal of Genetic and Environmental Resources Conservation. Vol. 4. № 2. P. 171-177.
Andersen R.A., ed. 2005. Marine culture medium., editor. Algal Culturing Techniques. Academic Press. P. 21-33.
Balamurugan V., Gangadhar L.G., Mohan-doss M. et al. 2013. Characterization of leptospira isolates from animals and humans: phylogenetic analysis identifies the prevalence of intermediate species in India. Springer plus. Vol. 2. P. 362.
Bhagavathy S., Sumathi P., Bell J.S. 2011. Green algae Chlorococcum humicola -a new source of bioactive compounds with antimicrobial activity. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. Vol. 1. № 1. P. S1-S7.
Boudarel H., Mathias J.D., Blaysat B., Grediac М. 2018. Towards standardized mechanical characterization of microbial
biofilms: analysis and critical review. Biofilms Microbiomes. Vol. 4. Р. 17-19.
Brujan E.A., Nahen K., Schmidt P., Vogel A. 2001. Dynamics of laser induced cavita-tion bubbles near an elastic boundary. Journal of Fluid Mechanics. Vol. 433. P. 251-281.
Camargo A.C., Woodward J.J., Call D.R., Nero L.A. 2017. Listeria monocytogenes in food-processing facilities, food contamination, and human listeriosis: the Brazilian Scenario. Foodborne Pathogens and Disease. Vol. 14. № 11. Р. 623-636.
Carter M.Q., Louie J.W., Feng D. et al. 2016. Curli fimbriae are conditionally required in Escherichia coli O157:H7 for initial attachment and biofilm formation. Food Microbiology. Vol. 57. P. 81-89.
Christensen G.D., Simpson W.A., Younger J.J. et al. 1985. Adherence of coagulase-negative Staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 22. № 6. P. 996-1006.
Encarnacao T., Pais A.A.C.C., Campos M.G., Burrows H.D. 2015. Cyanobacteria and microalgae: arenewable source of bioac-tive compounds and other chemicals. Science Progress. № 98. Pt. 2 P. 145-168.
Fagerlund A., Langsrud S., Heir E. et al. 2016. Biofilm matrix composition affects the susceptibility of food associated staphylococci to cleaning and disinfection agents. Frontiers in Microbiology. Vol. 7. P. 856-882.
Falaise C., Francois C., Travers M.-A. et al. 2016. Antimicrobial compounds from eu-karyotic microalgae against human pathogens and diseases in aquaculture. Marine Drugs. Vol. 14. № 9. 159 p.
Findlay J.A., Patil A.D. 1984. Antibacterial constituents of the diatom Navicula delognei. Journal of Natural Products. Vol. 47. № 5. P. 815-818.
Flemming H.C., Wingender J., Szewzyk U. et al. 2016. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. Vol. 14. № 9. Р. 563-575.
Gacheva G.V., Gigova L.G. 2014. Biological activity of microalgae can be enhanced by manipulating the cultivation temperature and irradiance. Central European Journal of Biology. Vol. 9. № 12. Р. 1168-1181.
Galié S., García-Gutiérrez C., Miguélez E.M., et al. 2018. Biofilms in the food industry: health aspects and control methods. Frontiers in Microbiology. Vol. 9. P. 898-902.
Genualdi S., Nyman P., Begley T. 2014. Updated evaluation of the migration of styrene monomer and oligomers from polystyrene food contact materials to foods and food simulants. Food Additives and Contaminants. Part A. Vol. 31. № 4. Р. 723-733.
Ghasemi Y., Moradian A., Mohagheghzadeh A. et al. 2007. Antifungal and antibacterial activity of the microalgae collected from paddy fields of Iran: Characterization of antimicrobial activity of Chroococcus disperses. Journal of Biological Sciences. Vol. 7. Iss. 6. P. 904-910.
Go S., Lee S.J., Jeong G.T., Kim S.K. 2012. Factors affecting the growth and the oil accumulation of marine microalgae, Tetraselmis suecica. Bioprocess and Biosystems Engineering. Vol. 35. № 1-2. Р. 145-150.
Gutiérrez D., Delgado S., Vázquez-Sánchez D. et al. 2012. Incidence of Staphylococcus aureus and analysis of associated bacterial communities on food industry surfaces. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 78. № 24. Р. 8547-8554.
Herrero M., Ibañez E., Cifuentes A., Reglero G. Santoyo S. 2006. Dunaliella salina micro-alga pressurized liquid extracts as potential antimicrobials. Journal of Food Protection. Vol. 69. № 10. P. 2471-2477.
Kameneva P.A., Efimova K.V., Rybin V.G., Orlova T. 2015. Detection of Dinophysis-toxin-1 in clonal culture of marine dinoflagellate Prorocentrum foraminosum (Faust M.A., 1993) from the Sea of Japan. Toxins. Vol. 7. Iss. 10. P. 3947-3959.
Kaplan J.B., Ragunath C., Velliyagounder K. et al. 2004. Enzymatic detachment of Staphylococcus epidermidis biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Vol. 48. № 7. Р. 2633-2636.
Kaplan J.B. 2010. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research. Vol. 89. № 3. P. 205-218.
Kleinegris D.M.M., Janssen M., Brandenburg W.A., Wijffels R.H. 2011. Two-phase systems: potential for in situ extraction of microalgal products. Biotechnology Advances. Vol. 29. № 5. Р. 502-507.
Larsson M.E., Harwood T.D., Lewis R.J. et al. 2019. Toxicological characterization of Fukuyo apaulensis (Dinophyceae) from temperate Australia. Phycological Research. № 1.0. Р. 65-71.
Lee J.S., Yanagi R., Kenma T., Yasumoto T. 1987. Fluorometric determination of diarr-hetic shellfish toxins by high-performance liquid chromatography. Agricultural and Biological Chemistry. Vol. 51. № 3. P. 877-881.
Long M., Peltekis A., González-Fernández C. et al. 2021. Allelochemicals of Alexandrium minutum: Kinetics of membrane disruption and photosynthesis inhibition in a co-occurring diatom. Harmful Algae. Vol. 103. Р. 101997.
Mendiola J.A., Santoyo S., Cifuentes A. et al. 2008. Antimicrobial activity of sub- and supercritical CO2 extracts of the green alga Dunaliella salina. Journal of Food Protection. Vol. 71. № 10. P. 2138-2143.
Ordog V. 1999. Beneficial effects of microalgae and cyanobacteria in plant soil-
systems, with special regard to their auxin-and cytokinin-like activity. International Workshop and Training Course on Microalgal Biology and Biotochnology Mosonmagyarovar, Hungary. P. 13-26. O'Toole G.A. 2011. Microtiter dish biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. № 47. Р. 2437. Pagedar A., Singh J., Batish V.K. 2010. Surface hydrophobicity, nutritional contents affect Staphylococcus aureus biofilms and temperature influences its survival in preformed biofilms. Journal of Basic Microbiology. № 50. P. S98-S106. Paola M., Prandinib J.M., Kich J.D., da Silva M.L.B. 2017. Elimination of antibiotic multi-resistant Salmonella typhimurium from swine wastewater by microalgae-induced antibacterial mechanisms. Journal of Bioremediation & Biodegradation. Vol. 8. Iss. 1. P. 379. Poimenidou S.V., Chrysadakou M., Tzako-niati A. et al. 2016. Variability of Listeria monocytogenes strains in biofilm formation on stainless steel and polystyrene materials and resistance to peracetic acid and quaternary ammonium compounds. International Journal of Food Microbiology. Vol. 237. P. 164-171. den Reijer P.M., Haisma E.M., Lemmens-den Toom N.A. et al. 2016. Detection of alpha-toxin and other virulence factors in biofilms of Staphylococcus aureus on polystyrene and a human epidermal model. Plos One. Vol. 11. № 3. e0145722 р. Santoyo S., Rodriguez-Meizoso I., Cifuentes A. et al. 2009. Green processes based on the extraction with pressurized fluids to obtain potent antimicrobials from Haemato-coccus pluvialis microalgae. Food Science and Technology. Vol. 42. № 7. P.1213-1218. da Silva Meira Q.G., de Medeiros Barbosa I., Alves Aguiar Athayde A.J. et al. 2012.
Influence of temperature and surface kind on biofilm formation by Staphylococcus aureus from food-contact surfaces and sensitivity to sanitizers. Food Control. Vol. 25. P. 469-475.
de Souza E.L., da Silva Meira Q.G., de Medei-ros Barbosa I. et al. 2014. Biofilm formation by Staphylococcus aureus from food contact surfaces in a meat based broth and sensitivity to sanitizers. Brazilian Journal of Microbiology. Vol. 45. № 1. P. 67-75.
Stepanovic S., Cirkovic I., Ranin L., Svabic-Vlahovic M. 2004. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. Vol. 38. № 5. P. 428-432.
Talero E., Gartia-Maurino S., Avila-Roman J. et al. 2015. Bioactive compounds isolated from microalgae in chronic inflammation
and cancer. Marine Drugs. Vol. 13. № 10. P. 6152-6209.
Valdiglesias V., Prego-Faraldo M.V., Pasaro E. et. al. 2013. Okadaic acid: more than a diarrheic toxin. Marine Drugs. Vol. 11. № 11. P. 4328-4349.
Walter C.S., Mahesh R. 2000. Antibacterial and antifungal activities of some marine diatoms in culture Indian Journal of Marine Sciences. Vol. 29. № 3. P. 238-242.
Yamasaki Y., Shikata T., Nukata A. et al. 2009. Extracellular polysaccharide-protein complexes of a harmful alga mediate the allelopathic control it exerts within the phytoplankton community. The ISME Journal. Vol. 3. Р. 808-817.
Yasumoto T. 1988. Bioactive substances of synbiotic microalgae. Journal of Synthetic Organic Chemistry. Vol. 46. Iss. 5. Р. 478-489.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Огнистая Альбина Васильевна - Дальневосточный федеральный университет; 690091, Россия, Владивосток; аспирант Департамента ядерных технологий; alya_lokshina@mail.ru. SPIN-код: 4996-4219; Author ID: 1070727.
Ognistaya Albina Vasilievna - Far Eastern Federal University; 690091, Russia, Vladivostok; Postgraduate of the Nuclear Technology Department; alya_lokshina@mail.ru. SPIN-code: 4996-4219; Author ID: 1070727.
Маркина Жанна Васильевна - Национальный научный центр морской биологии им. А.В. Жирмунского ДВО РАН; 690041, Россия, Владивосток; кандидат биологических наук; научный сотрудник лаборатории клеточных технологий; zhannav@mail.ru. SPIN-code: 7056-0032; Author ID: 251096; Researcher ID: I-3693-2016; Scopus ID: 8982837500.
Markina Zhanna Vasilievna - A.V. Zhirmunsky National Scientific Center for Marine Biology FEB RAS; 690041, Russia, Vladivostok; Candidate of Biological Sciences, Researcher of Laboratory of Cell Technologies; zhannav@mail.ru. SPIN-code: 7056-0032; Author ID: 251096; Researcher ID: I-3693-2016; Scopus ID: 8982837500.
