CC BY
16ститут защиты животных»; мкр. Юрьевец, г. Владимир, Россия, 600900; тел.: +7 (915) 793 02 62; e-mail: kulakov@arriah.ru
Щербакова Лидия Олеговна, канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных»; мкр. Юрьевец, г. Владимир, Россия, 600900; тел.: +7 (915) 772 67 85; e-mail: scherbakova@arriah.ru
Author affiliation:
Zybina Tat'yana Nikolaevna, the Leading Biologist at the Laboratory of Prevention of Diseases of Birds of the Federal state budgetary scientific Institution (FSBSI) «All-Russian scientific research Institute for the Protection of Animals»; district Yur>evets, Vladimir city, Russia, 600900; phone: +7 (904) 593 77 08; e-mail: zybina@arriah.ru
Pyatkina Alla Aleksandrovna, Ph. D. in Biology, Senior Researcher at the Laboratory of Prevention of Diseases of Birds of the Federal state budgetary scientific Institution (FSBSI) «All-Russian scientific research Institute for the Protection of Animals»; district Yur>evets, Vladimir city, Russia, 600900; phone: +7 (919) 010 82 29; e-mail: pyatkina@arriah.ru
Moroz Natal'ya Vladimirovna, Ph. D. in Veterinary Medicine, Head at the Laboratory of Prevention of Diseases of Birds of the Federal state budgetary scientific Institution (FSBSI) «All-Russian scientific research Institute for the Protection of Animals»; district Yur>evets, Vladimir city, Russia, 600900; phone: +7 (900) 480 77 96; e-mail: moroz@arriah.ru
Kulakov Vladimir Yur'evich, Ph. D. in Veterinary Medicine, Leading Researcher at the Laboratory of Prevention of Diseases of Birds of the Federal state budgetary scientific Institution (FSBSI) «All-Russian scientific research Institute for the Protection of Animals»; district Yur'evets, Vladimir city, Russia, 600900; phone: +7 (915) 793 02 62; e-mail: kulakov@ arriah.ru
Hcherbakova Lidia Olegovna, Ph. D. in Biology, Leading Researcher of the Reference Laboratory for Viral Diseases of Birds of the Federal state budgetary scientific Institution (FSBSI) «All-Russian scientific research Institute for the Protection of Animals»; district Yur>evets, Vladimir city, Russia, 600900; phone: +7 (915) 772 67 85; e-mail: scherbakova@arriah. ru
DOI: 10.256907VETPAT.2020.5793.006 УДК 579.6
Леонович О. А., Ишмухаметов А. А., Дзагурова Т. К.
ОПЫТ ДЕКОНТАМИНАЦИИ ВИРУСНЫХ ШТАММОВ ОТ МИКОПЛАЗМ
Ключевые слова: микоплазма; деконтаминация; ортохантавирусы; вирус Пуумала; Хантаан; До-брава/Белград; вирусные штаммы; клеточные культуры.
Резюме: Серьезной проблемой для производства биопрепаратов в ветеринарной и биофармакологической промышленности, а также для научно-исследовательских лабораторий является загрязнение микоплазменной инфекцией. Ряд трудностей связан с обнаружением и деконтами-нацией микоплазмы из-за ее высокой резистентности к антибиотикам и латентным характером протекания микоплазменной инфекции. Разработка эффективных способов своевременного выявления микоплазм и деконтаминации вирусных штаммов, пассируемых в клеточных
культурах, является актуальной задачей. Целью работы являлась оценка возможности декон-таминации вирусов от микоплазменного загрязнения с использованием антибиотиков. В работе использовали коллекцию штаммов ортохантавирусов (ФНЦИРИП имени М. П. Чумакова РАН) вирус Пуумала, Хантаан, вирус Сочи - геновариант вируса Добрава/Белград. Для индикации микоплазмы применяли цитохимический метод с использованием красителя Hoechst 33258. Размножение вируса контролировали непрямым методом флюоресцирующих антител, титр вируса в клетке определяли методом фокусобразующих единиц. В работе представлены данные по микоплазменной деконтаминации штаммов ортохантавирусов с использованием антибиотиков ципрофлоксацина и BMCyclin (Roche). Показано, что ципрофлоксацин обладает явным цито-токсическим эффектом, а применение BMCyclin может приводить к подавлению репликации вируса в клетке. Предложен способ применения BMCyclin для ортохантавируса Хантаан, обеспечивающий хорошую выживаемость клеточной культуры Vero E6 и высокую степень репродукции вируса. Показана высокая эффективность антибиотика BMCyclin для деконтаминации микоплазмы, его использование является простым, эффективным и малозатратным и может быть рекомендовано с целью сохранения ценных вирусных штаммов.
Введение
Микоплазмы, простейшие одноклеточные микроорганизмы, прокариотические бактерии относятся к классу Mollicutes и способны вызывать заболевания у животных, человека и даже у насекомых. Микоплазмы являются частым загрязнителем клеточных и вирусных культур [1-3] в биологических лабораториях. Микоплазмы не имеют жесткой клеточной стенки и способны к самостоятельному размножению, что вызывает трудности в их лечении. Загрязнение микоплазмой клеточных культур и вирусов, пассируемых в клеточных культурах, оказывает множество негативных воздействий, влияющих на качество фармакологических и ветеринарных биопрепаратов. Около 20-ти видов микоплазм были обнаружены в качестве загрязнителей, а такие виды как Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laylawii ответственны за 95 % всех загрязнений клеточных и вирусных культур [4, 5]. Причиной загрязнения микоплазмой могут являться любые биологические материалы, в том числе исследователь и сыворотки крови животных [6]. Поскольку ми-коплазменная инфекция может долго находиться в латентной форме и никак не проявлять себя, существуют трудности по профилактике и выявлению микоплазм.
Деконтаминация от микоплазменных загрязнений является альтернативой уничтожения важных или незаменимых клеточных культур и вирусных штаммов. В литературе описаны различные методы деконтаминации клеточных культур от микоплазм, но самым простым, дешевым и наиболее эффективным способом оказалось применение антибиотиков [7-9]. Фторхинолоны, тетрациклины, плеврому-
тилины и макролиды обладают сильными антимикоплазменными свойствами и могут применяться по разным схемам: однократно, в виде комбинации двух антибиотиков параллельно или последовательно, в комбинации с другими препаратами и методами [10, 11], что позволяет избавиться от микоплазменной контаминации клеток или свести её присутствие до неопределяемых количеств. При этом, если загрязненные клеточные линии обычно можно заменить линиями без микоплазм, то декон-таминация от микоплазмы коллекций вирусов, включающих уникальные штаммы, не имеет альтернативы. Описано некоторое количество методов деконтаминации вирусных штаммов от микоплазм, которые, либо являются достаточно сложными [12], либо оказывали серьезное цитотокси-ческое действие и/или индуцированно снижали репродукцию вируса [13-17].
Чтобы соответствовать стандартам качества, необходимо совершенствовать контроль и проводить своевременное удаление микоплазм из клеточных культур и вирусных стоков. И хотя методы микоплаз-менной деконтаминации клеточных линий в значительной степени описаны, методы декантоминации вирусных штаммов, пассируемых в клетках, до сих пор мало документированы. Наша задача состояла в устранении микоплазменного загрязнения вирусных штаммов, пассируемых в клетках Vero E6, с помощью простого и экономически эффективного метода.
Материалы и методы исследований
В работе использовали штаммы из коллекции ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН: вирус Пуумала, штамм К27/Уфа-8 и вирус Хантаан, штамм P-87/ Хабаровск-89 (выделены из крови больных геморраги-
ческой лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС)); вирус Сочи (геновариант вируса Добрава/Белград), штамм Ар1586/Со-чи-01 (выделен от кавказской лесной мыши Apodemus ponticus). Штаммы хранили при температуре минус 65 оС в виде ви-руссодержащих культуральных суспензий клеток Vero E6 (ATCC No. CRL-1586), перевиваемой культуры клеток почки зеленой мартышки.
Сыворотки крови, содержащие антитела к вирусам Пуумала (№ 8902), Ханта-ан (№ 8192), Добрава (№ 6369) получены от реконвалесцентов ГЛПС.
Клетки Vero E6 выращивали в двойной среде Игла MEM с добавлением телячьей сыворотки (5 %) при температуре 37 °C. Клетки снимали версен-трипсиновой (1:1) смесью.
При пассировании вируса клетки Vero E6 заражали либо в монослое либо в су-спезии клеток. Заражение проводили в течение 1 часа при температуре 37 оС. Инфицированные клетки инкубировали в среде Игла MEM при температуре 37 оС течение 7-10 дней.
Микоплазму определяли методом индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод) с использованием красителя Hoechst 33258 (Sigma) [18[. Детектирование проводили визуально микроскопически.
Размножение вируса контролировали по выявлению вирус специфического антигена непрямым методом флюоресцирующих антител (НМФА). Для этого суспензию инфицированных клеток наносили на предметные стёкла. Препараты высушивали и фиксировали 20 мин в холодном ацетоне (минус 20 оС). На фиксированные сухие клетки наносили соответствующую контрольную сыворотку, содержащую вирус специфические антитела, в разведении 1:200. Стекла с препаратами инкубировали во влажной камере 30 мин при температуре 37 оС, затем промывали 3 раза по 10 минут физиологическим раствором 0,9 % NaCl и 1 раз дистиллированной водой, сушили при комнатной температуре и наносили меченные флюорохро-мом (ФИТЦ) антивидовые антитела. После инкубации во влажной камере (37 оС, 30 мин) препараты промывали водой и исследовали с помощью люминесцентного микроскопа, используя водно-иммерсионный объектив 40х.
Титр вируса определяли методом фокусобразующих единиц (ФОЕ) в культуре Vero E6 по ранее описанному мето-
ду [19]. На монослой клеток Vero E6, выращенный в 24-луночных панелях вносили суспензию вируса (200мл на лунку) и выдерживали при температуре 37 оС в течение 1 часа, затем суспензию удаляли, и вносили 0,4-0,6 % метилцеллюлозное покрытие (900 мкл на лунку). После инкубации при температуре 37 оС в течение 6-7 суток, метилцеллюлозное покрытие удаляли, клетки 1 раз отмывали 0,9 % раствором NaCl. Фиксировали монослой 96 % этиловым спиртом в течение 20 мин, затем лунки панели промывали 0,9 % NaCl. В каждую лунку вносили по 200 мкл специфической анти-хантавирусной сыворотки. После контакта (37 оС, 60 мин) клетки 3 раза по 5 мин отмывали 0,9 % NaCl, вносили в лунки по 200 мкл антивидовые антитела, меченные пероксидазой (белок «А»). После контакта (37 оС, 60 мин) клетки 3 раза по 10 мин отмывали 0,9 % NaCl. В качестве субстратиндикаторной системы применяли 0,05 % диаминобензидинатетрахлорид с добавлением 0,02 % NiCl2 и 0,01 % Н2О2, смесь по 200 мкл вносили в каждую лунку, выдерживали 15-20 мин и проводили учёт опыта. Количество колоний инфицированных клеток в виде темно-серых пятен подсчитывали визуально; титр вируса выражали в lg ФОЕ в 1 мл вносимого вируссо-держащего материала.
В работе использовали антибиотики ципрофлоксацин (Эльфа Лабораториз, Индия) - синтетический противомикроб-ный препарат широкого спектра действия из группы фторхинолонов, действует бактерицидно и BMCydin (Ro^e) - комбинированный препарат, в состав входит два компанента: тиамулин (полусинтетический антибиотик группы плевромутили-нов) и моноциклин (полусинтетический антибиотик из группы тетрациклинов, действует бактериостатически); питательные среды ИГЛА МЕМ, двойную ИГЛА МЕМ, Л-глутамин, растворы трипсина, версена (производство ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН, отсутствие контаминаций контролируется аккредитованной лабораторией); телячья сыворотка Gibra (сертификат на отсутствие вирусных и микоплаз-менных контаминаций).
Результаты и обсуждение
Полученные для исследования в виде культуральной жидкости штаммы вирусов Пуумала (К27/Уфа-85), Хантаан (P-87/ Ха-баровск-89), и Сочи (Ар1586/Сочи-01) при наличии высокой вирусной активности (6,0 lg ФОЕ/мл) имели выраженную микоплаз-
Рис. 1. Клетки Vero E6, инфицированные вирусом Пуумала штамм К27/Уфа-85 (А), вирусом Сочи штамм Ар1586/Сочи-01 (Б), неинфицированные вирусом (В) до деконтаминации.
Окрашивание Hoechst 33258, х40.
менную контаминацию (рис. 1, 3А).
С целью очистки вирусных штаммов от микоплазмы использовали антибиотики ципрофлоксацин и ВМСусНп, рекомендованные для лечения микоплазматических инфекций.
Для проведения деконтаминации микоплазмы ципрофлоксацином (из расчета 10 мкг на 1мл среды) применили две схемы: при первой антибиотик вносили непосредственного в среду роста клеток после заражения клеток вирусом, при второй схеме антибиотик вносили через сутки после заражения. В обоих случаях инкубировали зараженные клетки в среде с антибиотиком в течение 7-10 дней. Затем клетки снимали, определяли наличие микоплазмы и степень зараженности клеток (количество антигена). После первого пассажа в присутствии ципрофлоксацина в обоих случаях зараженность клеток вирусами Пуума-ла, Хантаан и Сочи составила 100 %; при этом микоплазма не выявлялась ни в одной вирусной культуре. Однако после прекращения воздействия ципрофлоксацина (последующая инкубация в среде без антибио-
тика), микоплазма выявлялась уже на 2-3 пассаже вируса, т. е. полностью удаление микоплазмы из культуры клеток не происходило. При этом после 2-3 пассажей вируса в присутствии ципрофлоксацина наблюдалась значительная деградация клеток Vero E6 во всех случаях. Попытки снизить концентрацию антибиотика менее 10 мкг/1 мл с целью уменьшения цитотоксич-ности не приводило к освобождению культуры от микоплазм. Более того, повторное применение ципрофлоксацина в концентрации 10 мкг/1 мл и выше после нескольких пассажей вируса, ранее прошедшего цикл деконтаминации, также не дало нужного эффекта.
Несмотря на то, что ципрофлоксацин позиционируется как антибиотик с низкой токсичностью для клеток макроорганизма (в связи с отсутствием в них ДНК-гиразы), по отношению к клеткам Vero E6 мы наблюдали высокую токсичность в бактерицидных дозах, а также быстро развивающуюся резистентность (2-3 пассаж) мико-плазмы к данному антибиотику.
Деконтаминацию вирусных штаммов
антибиотиком BMCyclin проводили по следующей схеме: в среду роста после заражения клеток вирусом добавляли BMCyclin 1 (тиамулин) из расчета 10 мкг на 1 мл среды, выдерживали 3 суток, далее среду меняли на свежую с добавлением BMCyclin 2 (миноциклин) в концентрации 5 мкг на 1 мл среды, выдерживали 4 суток. Цикл повторяли 3 раза (по рекомендации производителя). После этого клетки снимали и проверяли на наличие микоплазмы микроскопическим способом путем окрашивания ДНК красителем Hoechst 33258 (рис.
рез сутки после заражения обеспечило высокую выживаемость клеточной культуры и хорошую репродукцию вирусов Пуумала и Сочи в клетке. Антибиотик ВМСусЬп не оказывал видимого токсического эффекта на клетки в используемых дозах и обеспечивал удаление микоплазмы из культуры, что подтверждается также данными других исследований [8].
Однако в случае с вирусом Хантаан, несмотря на хороший клеточный рост и отсутствие гибели клеток, после обработки антибиотиком ВМСусЬп при полном отсутствии микоплазмы наблюдалось резкое падение (до 0 %) зараженности клеток вирусом (рис. 3Г).
С целью преодоления негативного вли-
2, 3Б), степень зараженности (НМФА) и вирусную активность (ФОЕ). Далее клетки пассировали в среде без антибиотика, и спустя 1, 2 и 5 недель (3, 4, 7 пассажей) повторно проверяли на вышеуказанные показатели (таблица).
Результаты показали полное отсутствие микоплазмы во всех культурах спустя 1, 2 и 5 недель при сохранении зараженности клеток до 100 % для вируса Пуумала и до 70-80 % для вируса Сочи (табл. 1). Использование предложенной схемы декон-таминации с добавлением антибиотика че-
яния антибиотика на репродукцию вируса Хантаан нами была предложена следующая схема обработки клеток: ВМСусЬп 1 добавляли в среду роста через сутки после заражения, выдерживали 3 суток, затем среду роста меняли на свежую с добавлением ВМСусЬп 2. По истечении 4-х суток среду роста вновь меняли на свежую без антибиотика и инкубировали инфицированные клетки еще в течение 10-ти дней. Повторяли данный цикл еще два раза (чередуя инкубацию с и без ВМСусЬп). Такая схема воздействия антибиотиком дала хорошие результаты. Несмотря на то, что после каждого цикла вирусная нагрузка в клетке уменьшалась примерно на 1520 %, удалось добиться полного отсутствия
Таблица. Результаты применения ВМСуеИп для деконтаминации стоков _вирусов Пуумала, Сочи и Хаантан__
Вирус Период обнаружения микоплазмы после обработки ВМСусИп Антиген (НМФА) Титр вируса lg ФОЕ/мл
1 пассаж 3 пассаж 7 пассаж 7 пассаж
Пуумала* К27/Уфа-85 отр отр отр 100 % >6
Сочи* Ар1586/Сочи-01 отр отр отр 80 % 2,7
Хантаан* P-87/ Хабаровск-89 отр отр отр 0 % 0
Хантаан** P-87/ Хабаровск-89 отр отр отр 70 % 5,0
Примечание *после обработки антибиотиком ВМСу^п по схеме производителя; **обработка ВМСу^п по схеме, предусматривающей пассирование вируса в культуре без добавления антибиотика между циклами обработки антибиотиком.
А Б
Рис. 2. Клетки Vero E6, инфицированные вирусом Пуумала, штамм К27/Уфа-85 (А) и вирусом Сочи, штамм Ар1586/Сочи-01 (Б) после обработки BMCyclin (2 цикла). Окрашивание Hoechst 33258, х40.
А
Б
Рис. 3. Клетки Vero E6, инфицированные вирусом Хантаан штамм P-87/ Хабаровск-89х до обработки (А, В) и после обработки BMCyclin по схеме производителя (Б, Г). А, Б) - окрашивание Hoechst 33258, х40; В, Г) - НМФА, увеличение х40.
микоплазмы в вирусных стоках в течение последующих 5-7 пассажей с сохранением высокого уровня зараженности клеток (до 70 %) и вирусной репликацией до 5,0 ^ ФОЕ/мл (табл. 1, рис. 4).
Заключение
Загрязнение микоплазмой остается важной проблемой лабораторий биофармацевтической и ветеринарной промышленности. Поскольку микоплазма может
Рис. 4. Клетки Vero E6, инфицированные вирусом Хантаан штамм P-87/ Хабаровск-89х после обработки BMCyclin по схеме, предусматривающей пассирование вируса в культуре без добавления антибиотика между циклами. НМФА, увеличение х40.
вызывать различные молекулярные изменения в биологии клетки, случайное использование загрязненных микоплазмой вирусных штаммов может привести к искажению результатов экспериментальных исследований, а также сделать невозможным использование биотехнологических препаратов.
С целью предотвращения инфицирования микоплазмами культуральных вирус-содержащих суспензий рекомендуется регулярно проводить контроль на отсутствие контаминации микоплазмой новых клеточных и вирусных культур, непрерывных клеточных линий в промышленных условиях не менее 1 раз в месяц (каждую неделю в лабораторных условиях), перед каждым хранением и в случае изменений в условиях производства, а также при возникновении проблем с воспроизводимостью результатов.
Регулярное тестирование культураль-ных суспензий вирусов на отсутствие ми-коплазмы и ее своевременное удаление в случае обнаружения позволит избежать сложных проблем, связанных с сохранением важных и незаменимых вирусных штаммов.
При этом деконтаминация вирусных стоков от микоплазм сталкивается с рядом трудностей: устойчивостью разных видов микоплазм к антибиотикам и снижению репликации вирусов при обработке клеток антибиотиком. В нашей работе мы также столкнулись с выраженным снижением репликации вируса Хантаан при применении ВМСуйт. Связано ли это действие антибиотика с индуцированным снижением инфекционности вируса или здесь играют роль какие-либо другие факторы, остается непонятным. Механизм этого феномена требует отдельного исследования.
Проведенные исследования показали хорошую эффективность ВМСуЫш для микоплазменной деконтаминации при отсутствии побочных явлений (цитотоксич-ность, развитие антибиотикорезистентно-сти). Нами апробирована методика, которая может быть эффективной при использовании ВМСу^п для микоплазменной де-контаминации в случае угрозы индуцированного подавления вирусной репродукции в клетке. Метод является простым, эффективным и малозатратным, и может быть рекомендован с целью сохранения ценных вирусных штаммов.
Библиографический список:
1. Mariotti E. Mollicutes contamination: a new strategy
for an effective rescue of cancer cell lines / E. Mariotti, F DAlessio, P Mirabelli, R. Di Noto [et al.] // Biologicals. - 2012. - № 4. - pp. 88-91.
2. Rawadi G. Advances in PCR-based detection of mycoplasmas contaminating cell cultures / G. Rawadi, O. Dussurget // PCR Methods Appl. - 1995. - № 4. - pp. 199-208.
3. Volokhov D. V Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: review of alternative non-microbiological techniques / D. V Volokhov, L. J. Graham, K. A. Brorson, V E. Chizhikov // Mol. Cell. Probes. - 2011. - № 25. - pp. 69-77.
4. Hu M. Application of PCR for detection and identification of mycoplasma contamination in virus stocks / M. Hu, C. Buck, D. Jacobs, G. Paulino, H. Khouri // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. - 1995. - № 31 (9). - pp. 710-715.
5. Armstrong S. E. The scope of mycoplasma contamination within the biopharmaceutical industry / S. E. Armstrong, J. A. Mariano, D. J. Lundin // Biologicals. - 2010. - № 38 (2). - pp. 211-213.
6. Rottem S. Beware of mycoplasmas / S. Rottem, M. F
Barile Trends // Biotechnol. - 1993. - № 11(4). - pp. 143-51.
7. Singh S. Treatment and control of mycoplasma
contamination in Plasmodium falciparum culture / S. Singh, S. K. Puri, K. Srivastava // Parasitol. Res. -2008. - № 104 (1). - pp. 181-184.
8. Uphoff C. C. Eradication of mycoplasma contaminations / C. C. Uphoff, H. G. Drexler // Methods Mol. Biol. - 2005. - № 290. - pp. 25-34.
9. Uphoff C. C. Elimination of mycoplasmas from infected cell lines using antibiotics / C. C. Uphoff, H. G. Drexler // Methods Mol. Biol. - 2011. - № 731. -pp. 05-14.
10. Drexler H. G. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, Sources, Effects, Detection, Elimination, Prevention / H. G. Drexler, C. C. Uphoff // Cytotechnology. - 2002. - № 39 (2). - pp. 75-90.
11. Kazemiha M. V Effectiveness of Plasmocure™ in Elimination of Mycoplasma Species from Contaminated Cell Cultures: A Comparative Study versus Other Antibiotics / M. V Kazemiha, S. Azari, M. Habibi-Anbouhi, A. Amanzadeh [et al.] // Cell J. -2019. - № 21 (2). - pp. 143-149.
12. Malenovska H. Elimination of mycoplasma contamination of virus stocks / H. Malenovska, M. Reichelova // Veterinarni Medicina. - 2011. - № 56 (11). - pp. 547-550.
13. Ikoev V N. A method of ultracentrifugation used for control of live viral vaccines with regard to removal of mycoplasma / V. N. Ikoev, G. M. Gonskii, S. G. Dzagurov // Vopr. Virusol. - 1973. - № 18 (5). - pp.
625-628.
14. La Linn M. Complete removal of mycoplasma from viral preparations using solvent extraction / M. La Linn, A. J. Bellett, P. G. Parsons, A. J. Suhrbier // Virol. Methods. - 1995. - № 52 (1-2). - pp. 51-54.
15. Nissen E. Application of surfactin for mycoplasma inactivation in virus stocks / E. Nissen, G. Pauli, J. Vater, D. Vollenbroich // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. - 1997. - № 33 (6). - pp. 414-415.
16. Simpson E. J. A simple method for the removal of mycoplasma contamination from paramyxovirus stocks / E. J. Simpson, S. L. Cosby, B. K. Rima, S. J. Martin // J. Virol. Methods. - 1983. - № 6 (3). - pp. 127-34.
17. Wolford R. G. Elimination of Mycoplasma contaminants from virus stocks by treatment with nonionic detergents / R. G. Wolford, F M. Hetrick // Appl. Microbiol. - 1972. - № 24 (1). - pp. 18-21.
18. Chen T. R. In situ detection of mycoplasma contamination in cell cultures by fluorescent Hoechst 33258 stain / T. R. Chen // It Exp. Cell Res. - 1971. - № 104. - pp. 255-262.
19. Дзагурова Т. К. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов-возбудителей ГЛПС в европейской части России / Т. К. Дзагурова, Е. А. Ткаченко, В. Н. Башкирцев // Медицинская вирусология. - 2008. - № 25. -С. 142-150.
1-18 Vide supra.
19. Dzagurova T. K. Vyidelenie i identifikatsiya shtammov hantavirusov-vozbuditeley GLPS v evropeyskoy chasti Rossii [Isolation and identification of HFRS
hantavirus strains in the European part of Russia] / T. K. Dzagurova, E. A. Tkachenko, V. N. Bashkirtsev // Meditsinskaya virusologiya. - 2008. - # 25. -S. 142-150.
DOI: 10.25690/VETPAT.2020.57.93.006
Leonovich O. A., Ishmuhametov A. A., Dzagurova T. K.
EXPERIENCE IN DECONTAMINATION OF VIRAL STRAINS FROM
MYCOPLASMAS
Key Words: mycoplasma; decontamination; orthohantaviruses; Puumala virus; Hantaan; Dobrava/Bel-grade; viral strains; cell cultures.
Abstract: Mycoplasma contamination is a serious problem for the production of biologics in the veterinary and biopharmacological industries, as well as for research laboratories. A number of difficulties are associated with the detection and decontamination of mycoplasma due to its high resistance to antibiotics and the latent nature of the course of mycoplasma infection. The development of effective methods for the timely detection of mycoplasmas and the decontamination of viral strains passaged in cell cultures is an urgent task. The aim of this work was to assess the possibility of decontamination of viruses from mycoplasma contamination using antibiotics. We used a collection of strains of orthohantaviruses (FSCIRIP named after M. P. Chumakov RAS) Puumala virus, Hantaan virus, Sochi virus - a genovariant of the Dobrava/Belgrade virus. A cytochemical method using Hoechst 33258 dye was used to indicate Mycoplasma. Virus reproduction was controlled by indirect method of fluorescent antibodies, the virus titer in the cell was determined by the method of focus-forming units. This paper presents data on Mycoplasma decontamination of orthohantavirus strains using the antibiotics ciprofloxacin and BMCyclin (Roche). It has been shown that ciprofloxacin has a clear cytotoxic effect, and the use of BMCyclin can lead to suppression of virus replication in the cell. A method of using BMCyclin for Hantaan orthohantavirus is proposed, which provides good survival of Vero E6 cell culture and a high degree of virus reproduction. The high efficiency of the antibiotic BMCyclin for decontamination of Mycoplasma has been shown. Its use is simple, effective and low-cost and can be recommended in order to preserve valuable viral strains.
Сведения об авторах:
Леонович Оксана Александровна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок отдела природно-очаговых вирусных инфекций
ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов (ФНЦИРИП) им. М. П. Чумакова РАН»; д. 8, посёлок Института полиомиелита, поселение Московский, город Москва, Российская Федерация, 108819; e-mail: loa-73@mail.ru; тел.: +7 (916) 106 99 52
Ишмухаметов Айдар Айратович, доктор мед. наук, профессор, член-корреспондент РАН, Генеральный директор ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов (ФНЦИРИП) им. М. П. Чумакова РАН»; д. 8, посёлок Института полиомиелита, поселение Московский, город Москва, Российская Федерация, 108819; заведующий кафедрой ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный университет (МГМУ) имени И. М. Сеченова» Минздрава России; г. Москва, Российская Федерация, 119435
Дзагурова Тамара Казбековна, доктор мед. наук, заведующая лабораторией геморрагических лихорадок ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов (ФНЦИРИП) им. М. П. Чумакова РАН»; д. 8, посёлок Института полиомиелита, поселение Московский, город Москва, Российская Федерация, 108819
Author affiliation:
Leonovich Oksana Aleksandrovna, Ph. D. in Biology, Senior Researcher of the Laboratory of Hemorrhagic Fevers of the Department of Natural Focal Viral Infections of the FSBSI «Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Preparations (FSCRDIP) named after M. P Chumakov RAS»; house 8, settlement of the Institute of Poliomyelitis, settlement Moskovsky, Moscow city, Russian Federation, 108819; e-mail: loa-73@ mail.ru; phone: +7 (916) 106 99 52
Ishmukhametov Aydar Ayratovich, D. Sc. in Medicine, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, General Director of the FSBSI «Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Preparations (FSCRDIP) named after M. P. Chumakov RAS»; house 8, settlement of the Institute of Poliomyelitis, settlement Moskovsky, Moscow city, Russian Federation, 108819; Head of the Department of the (FSAEI) of Higher Education (HE) «First Moscow State Medical University (MSMU) named after I. M. Sechenov» of the Ministry of Health of Russia; Moscow city, Russian Federation, 119435
Dzagurova Tamara Kazbekovna, D. Sc. in Medicine, Head of the Laboratory of Hemorrhagic Fevers of the FSBSI «Federal Scientific Center for Research and Development of Immunobiological Preparations (FSCRDIP) named after M. P. Chumakov RAS»; house 8, settlement of the Institute of Poliomyelitis, settlement Moskovsky, Moscow city, Russian Federation, 108819
$
ВЕТЕРИНАРНАЯ КЛИНИКА
ЦЕНТР
344068, г. Ростов-на-Дону, ул.Фурмановская, д.106/43
(863)2926537 www.vetcentr.com
